Le tissu osseux est une structure dynamique en perpétuel remaniement. Ce remaniement appelé remodelage osseux est le résultat de l’activité des deux principales cellules de l’os : les ostéoclastes qui sont responsables de la résorption de la matrice osseuse et les ostéoblastes qui la synthétisent. La cytokine RANKL (Receptor Activator of NFkB Ligand) membre de la famille du TNF (Tumor Necrosis Factor) joue un rôle essentiel dans la formation, l’activation et la survie des ostéoclastes par sa liaison à son récepteur membranaire RANK. Son ciblage spécifique est un axe de recherche majeur dans le développement de nouvelles thérapies pour le traitement des pertes osseuses telle que l’ostéoporose. Une nouvelle classe de molécules d’affinité, les Nanofitines® (NF) sont développées par la Société Affilogic. Les Nanofitines sont des protéines artificielles dérivées de la protéine de liaison à l'ADN Sac7d, de Sulfolobus acidocaldarius, ayant la capacité de se lier sélectivement à diverses cibles. Ce travail de collaboration, visait à générer des NF ciblant RANKL, étudier leur effet inhibiteur in vitro sur l’ostéoclastogénèse et déterminer leur intérêt thérapeutique potentiel pour prévenir la perte osseuse dans un modèle pré-clinique. Nous avons pu révéler un effet inhibiteur sur l’ostéoclastogénèse et de l’activité des ostéoclastes in vitro ainsi qu’un effet sur la perte osseuse dans un modèle animal révélé par des études histomorphométriques. De plus, l’analyse histologique des différents organes a permis d’écarter tous signes de toxicité. Ce travail sert donc de preuve de concept de l’utilisation de Nanofitines® pour le ciblage de molécules ayant un intérêt ostéo-articulaire. / Bone tissue is a dynamic structure undergoing constant remodeling. This bone remodeling is the result of the activity of the two main bone cells: the osteoclasts that are responsible for the resorption of the bone matrix and the osteoblasts that synthesize it. The cytokine RANKL (Receptor Activator of NFkB Ligand), a member of the TNF (Tumor Necrosis Factor) family, plays an essential role in the formation, activation and survival of osteoclasts by binding to its membrane receptor RANK. Its specific targeting is a major research focus in the development of novel therapies for the treatment of bone loss such as osteoporosis. A new class of affinity molecules, Nanofitins® (NF) are developed by Affilogic. Nanofitins® are artificial proteins derived from the Sac7d DNA binding protein, isolated from Sulfolobus acidocaldarius, that have the ability to bind selectively to various various targets. This collaborative work aimed to generate NF targeting RANKL, study their in vitro inhibitory effect on osteoclastogenesis and determine their potential therapeutic interest in a pre-clinical model of osteoporosis. We have shown an inhibitory effect on osteoclastogenesis and osteoclast activity in vitro, as well as an effect on bone loss in an animal model revealed by histomorphometric studies. In addition, histological analysis of the different organs ruled out any signs of toxicity. Taken together, these results demonstrated that Nanofitins® can be used as efficient in vitro antagonists of RANKL and prove to be effective in preserving bone in vivo.

Notre étude consistait à identifier le rôle de Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) dans la résorption osseuse lors des maladies parodontales. Pour ce faire, nous avons étudié l'effet de cette bactérie sur la prolifération, l'expression et la production de différentes molécules (cytokines pro-infiammatoires et régulatrices ainsi que des protéases) par les ostéoblastes infectés. Nos résultats démontrent qu'une infection avec P. gingivalis vivant à différentes concentrations diminue la prolifération cellulaire. Nous avons aussi observé une modulation de l'expression des ARNm de RANKL et d'OPG. De plus, nous avons démontré que P. gingivalis stimule l'expression et la production d'IL-6 et de MMP-2. En conclusion, nos travaux montrent que P. gingivalis peut promouvoir la résorption osseuse directement, en réduisant la prolifération ostéoblastique et indirectement, en augmentant la production de médiateurs inflammatoires.

Les ostéoclastes (OCs) sont responsables de la résorption de l’os normal. La différenciation, la maturation et la survie de ces cellules sont principalement stimulées par RANKL. Ces phénomènes se produisent dans les suites de l’interaction de RANKL avec son récepteur RANK situé à la surface de l’OC, via la transduction de signaux intracellulaires conduisant à l’activation de différentes cascades de signalisation. Les principaux facteurs de transcription induits par cette signalisation sont NF-?B et NFATc1, qui modulent l’expression de gènes d’importance majeure pour le bon fonctionnement des OCs. Dans la maladie de Paget, caractérisée par une augmentation multifocale du remodelage osseux avec hyperrésorption osseuse, les OCs ont une morphologie anormale, ils sont résistants à l’apoptose et leur activité est augmentée. Des mutations du gène codant pour la protéine p62 (séquestosome 1 ) ont été décrites dans cette maladie, identifiant p62 comme un facteur important de la signalisation de l’OC. Des travaux de notre laboratoire ont montré une augmentation de l’activation de NF-?B induite par RANKL dans les OCs pagétiques, avec même une activité constitutive de NF-?B en présence de la mutation p62 p.P392L. Notre étude a évalué l’expression et l’activation de NFATc1, et le rôle de PKC[C zêta] dans la signalisation NFATc1, cette kinase appartenant au complexe de signalisation TRAF6/p62 induit par RANKL. En culture primaire, des monocytes de sang périphérique de patients pagétiques et de contrôles (tous génotypés pour la mutation p62) ont été différenciés en OCs matures en présence de RANKL et M-CSF. Nous avons évalué l’effet de RANKL sur l’activation de NFATc1 (translocation nucléaire évaluée par immunofluorescence), en présence ou non d'un inhibiteur de PKC[C zêta], ainsi que l’expression protéique (immunobuvardage) et ARNm (RTPCR quantitative). Nous avons observé que RANKL stimulait l’activation de NFATcl dans les OCs pagétiques, porteurs ou non de la mutation p62 p.P392L, et que PKC[C zêta] intervenait dans cette signalisation. Dans un modèle de différenciation OC à partir de monocytes foetaux, nous avons par ailleurs mis au point l’étude de l’activation de NFATc1 par essai luciférase, et les conditions optimales pour évaluer son expression protéique et génique. Nos résultats démontrent pour la première fois dans des OCs humains que RANKL stimule l’activation et l’expression de NFATc1, et que l’activation de NFATc1 est augmentée dans les OCs pagétiques. De manière tout à fait originale, nous montrons également que la PKC[C zêta] contribue à l’activation de NFATc1. [symboles non conformes]

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune qui touche environ 1% de la population mondiale. Elle entraîne une inflammation synoviale et une destruction de l’architecture articulaire. L’articulation rhumatoïde est un milieu très inflammatoire qui est infiltré par des cellules telles que les neutrophiles, les macrophages, les monocytes, les lymphocytes B et T ; par des protéines telles que des cytokines, des chimiokines, des molécules d’adhésion, par des complexes immuns, et par des auto-anticorps comme les facteurs rhumatoïdes qui sont un marqueur spécifique de la maladie et qui permettent d’établir un pronostic sur son évolution. De plus, dans l’articulation rhumatoïde, il y aura formation d’un pannus rhumatoïde avec érosion progressive du cartilage et de l’os. Les ostéoclastes sont les cellules principalement impliquées dans cette érosion osseuse. Afin d’effectuer des études in vitro, les ostéoclastes sont généralement obtenus à partir de monocytes isolés de sang humain, ce qui rend leur étude complexe car les variations sont très grandes d’un donneur de sang à l’autre. Nous avons utilisé la lignée cellulaire d’origine myéloïde HL60 pour obtenir des ostéoclastes et avons caractérisé ces cellules HL60 « osteoclast-like » dans tous les aspects de leur fonction et de leur activation. Nous avons aussi montré que les facteurs rhumatoïdes pouvaient agir directement sur les ostéoclastes pendant leur différenciation et pendant la résorption osseuse. Cette étude nous a permis d’amorcer la compréhension du rôle possible des facteurs rhumatoïdes sur la résorption osseuse dans la polyarthrite rhumatoïde.

The objective of this thesis is to provide an improved characterization of porous scaffolds. A more focused objective is to provide a computational model simulating the cell mediated resorption process of resorbable bone substitutes. The thesis is structured in three scientific manuscripts. The first manuscript used fuzzy-based image treatment methods to analyse images generated by micro-computed tomography. From the literature, it is known that the fuzzy-based method helps to improve the accuracy of the characterization, in particular for scaffolds featuring a relatively small pore size. In addition, a new algorithm was introduced to determine both pore and interconnection sizes. The surface area of bone substitutes was quantified by using marching cube algorithm. Besides, the so-called Lattice Boltzmann method was used to characterize the permeability of the investigated scaffolds. Scaffolds made of [béta]-tricalcium phosphate ([béta]-Ca[subscript 3](PO[subscript 4])[subscript 2]) and presenting a constant porosity and four variable pore sizes were examined. The average pore size (diameter) of the four bone substitute groups (denominated with a letter from group A to D) was measured to be 170.3«1.7, 217.3«5.2, 415.8«18.8 and 972.3«10.9 [micro]m. Despite this significant change in pore size, the pore interconnection size only increased slightly, in the range of 61.7 to 85.2 [micro]m. The average porosity of the four groups was 52.3«1.5 %. The surface density of scaffolds decreased from 11.5 to 3.3 mm[superscript -1], when the pore size increased. The results revealed that the permeability of scaffolds is in the same order of magnitude and increased from 1.1?10[superscript -10] to 4.1?10[superscript -10] m[superscript 2] with increasing the pore size. The second manuscript was devoted to the use of subvoxelization algorithm and high-resolution scanner, in an attempt to further improve the accuracy of the results, in particular, of the small pore scaffolds. As expected, an increase of the image resolution from 15 to 7.5 [micro]m significantly eased the segmentation process and hence improved scaffold characterization. Subvoxelization also improved the results specifically in terms of interconnection sizes. Specifically, much smaller interconnection sizes were yielded after applying the subvoxelization process. For example, the mean interconnection size of small pore size groups, group A and B, dropped from 63 to 20 and 30 [micro]m, respectively. Furthermore, due to more details obtained from subvoxelization and high-resolution scanning, additional effects so called"boundary effects" were observed. The boundary effects can yield misleading results in terms of interconnection sizes. The means to reduce these effects were proposed. The third manuscript focused on the simulation and understanding of cell mediated resorption of bone graft substitutes. A computer model was developed to simulate the resorption process of four bone substitute groups. [mu]CT data and new"image processing" tools such as labelling and skeletonization were combined in an algorithm to perform the steps of resorption simulation algorithm. The proposed algorithm was verified by comparing simulation results with the analytical results of a simple geometry and biological in vivo data of bone substitutes. A correlation coefficient between the simulation results and both analytical and experimental data, was found to be larger than 0.9. Local resorption process revealed faster resorption in external region specifically at earlier resorption time. This finding is in agreement with the in vivo results. Two definitions were introduced to estimate the resorption rate; volume resorption rate and linear resorption rate. The volume resorption rate was proportional to accessible surface and decreased when the pore size increased, while the linear resorption rate was proportional to thickness of material and increased with increasing the pore size. In addition, the simulation results revealed no effect of resorption direction on resorption behaviour of substitutes. However, the resorption rate of small pore size samples was decreased with increasing the minimum interconnection size required for cell ingrowth, to 100 [micro]m. This thesis combined novel"image processing" tools and subvoxelization method to improve the characterization of porous bone substitutes used in the bone repair process. The improved characterization allowed a more accurate simulation process. The simulation data were consistent with previously obtained biological data of the same group and allows understanding the local resorption process. The available tools and results are expected to help with the design of optimal substitute for bone repair."--Résumé abrégé par UMI.

Malgré sa réputation d'être statique, le tissu osseux est un organe dynamique maintenu en équilibre sous les actions respectives des cellules résorbant l'os, les ostéoclastes, et les cellules formant l'os, les ostéoblastes. Les pathologies osseuses comme l'ostéoporose, découlent d'un débalancement entre la résorption et la formation osseuse. Ces maladies mènent à des diminutions nettes de la masse osseuse, à une augmentation de la fragilité du tissu et par conséquent à une perturbation de la qualité de vie chez les personnes atteintes. Les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) ont été identifiées comme d'intéressants candidats pour stimuler la régénération du tissu osseux. Les BMP-2 et -7 ont été approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) pour des applications orthopédiques spécifiques. Récemment, il a été démontré que la BMP-9 possédait un potentiel ostéogénique supérieur aux BMP-2 et -7 qui sont couramment utilisées en clinique. Toutefois, son effet sur l'ostéoclaste n'a jamais été caractérisé. À partir d'un modèle d'ostéoclastes obtenus à partir de sang de cordon ombilical, l'effet de la BMP-9 sur la différenciation ostéoclastique, la résorption osseuse et l'apoptose chez l'ostéoclaste a été étudié. La transduction du signal par la BMP-9 a été étudiée chez l'ostéoclaste. Les cultures d'ostéoclastes ayant atteint une différenciation terminale expriment les ARNm codant pour ALK-1, BMPR-IA, -IB et -II. La BMP-9 active la voie canonique des Smad chez l'ostéoclaste. Par une analyse de l'expression de marqueurs ostéoclastiques, il est observé que la BMP-9 ne module pas la formation des ostéoclastes. Pour l'étude sur la résorption osseuse, les précurseurs ostéoclastiques ont été cultivées sur des lamelles osseuses bovines. Il est observé que la BMP-9 ne module pas la résorption osseuse régulée par les ostéoclastes. L'apoptose des ostéoclastes a été étudiée par marquage TUNEL. Il est observé qu'en absence et présence des facteurs de survie, RANKL (Receptor activator of the nuclear factor KB ligand) et M-CSF (Macrophage colony stimulating factor), la BMP-9 à 50 et 150 ng.ml-1 protège les ostéoclastes de la mort cellulaire. Les mécanismes moléculaires de l'inhibition d'apoptose induite par la BMP-9 ont également été étudiés. La BMP-9 induit chez l'ostéoclaste une inhibition du clivage de la caspase-9 et non de la caspase-8, suggérant que celle-ci découle d'une diminution de l'activation de la voie intrinsèque de l'apoptose. Une étude de la modulation des homologues de la famille Bcl-2 a montré que la BMP-9 à 150 ng.ml-1 induit une diminution de l'expression de Bid, un homologue pro-apoptotique. Cette étude démontre pour la première fois les effets de la BMP-9 chez l'ostéoclaste humain. [Symboles non conformes]

L'autotaxine (ATX) est une protéine sécrétée par différents tissus y compris le foie, le tissu adipeux et l'os. L'ATX possède une activité lysophopholipase D responsable du clivage de la lysophosphatidyl-choline (LPC) en acide lysophosphatidique (LPA), facteur de croissance affectant la prolifération cellulaire, la différenciation et la migration. Il a été démontré que les effets biologiques du LPA pourraient être la conséquence de la production locale d'ATX dans un tissu ou une cellule donnée. Nous avons récemment démontré que le LPA contrôle l'ostéoclastogenèse et l'activité de résorption ostéoclastique. De plus, nous avons démontré que l'expression de Enpp2 (gène de l'ATX) augmente au cours de l'ostéoclastogenèse. Le but de notre étude était d'évaluer l'implication de l'ATX produite par les ostéoclastes au cours de l'ostéoclastogenèse et dans le contrôle de la masse osseuse, en particulier en conditions inflammatoires.La production et le rôle de l'ATX au cours de l'ostéoclastogenèse ont été analysés sur les ostéoclastes murins et humains. De plus, l'ATX a été spécifiquement ciblée dans les ostéoclastes avec l'utilisation des souris Enpp2fl/fl Ctsk-Cre et par le traitement pharmacologique des souris par un anti-ATX. La perte osseuse en conditions inflammatoires a été évaluée dans le modèle d'inflammation induite par le lipopolysaccharide (LPS) et dans les modèles de souris arthritiques par transfert de sérum K/BxN et avec la lignée transgénique surexprimant le TNF humain hTNF. La production de l'ATX par les ostéoclastes est cruciale pour l'activité de résorption osseuse ostéoclastique in vitro. Les souris Enpp2fl/fl Ctsk-Cre ne présentent pas de phénotype osseux en conditions physiologiques mais sont protégées de la perte osseuse systémique et des érosions osseuses observées en conditions arthritiques. De plus, l'ihibition pharmacologique de l'ATX protège les souris de la perte osseuse systémique et des érosions focales observées dans le modèle hTNF+/- .L'inhibition pharmacologique et génétique de l'ATX améliore la perte osseuse locale et systémique inflammatoire en inhibant la résorption osseuse. L'ATX semble être une cible thérapeutique prometteuse dans la prévention de la perte osseuse associée à l'inflammation / Autotaxin (ATX) is a secreted protein produced by various tissues including the liver, adipose tissue and bone. ATX exhibits a lysophospholipase D activity responsible for cleavage of lysophosphatidyl-choline (LPC) in lysophosphatidic acid (LPA) that in turn acts as a growth factor, affecting cell proliferation, differentiation, and migration. It has been shown that biological effects of LPA could be the direct consequence of local production of ATX in a given tissue or cell type. We showed that LPA controls osteoclastogenesis and osteoclast bone resorption activity. In addition, we observed that Enpp2 (ATX gene) was upregulated during osteoclastogenesis. The aim of the study was to evaluate if ATX produced by osteoclasts could play a role in osteoclastogenesis and bone mass control, especially in inflammatory conditions.The role of ATX on osteoclastogenesis and osteoclast activity were analysed by murine and human assays. ATX was targeted by conditional inactivation of Ennp2 (ATX gene) in osteoclasts (Enpp2fl/fl Ctsk-Cre) and by treatment with anti-ATX. Arthritic and erosive diseases were studied in arthritis models using human tumor necrosis factor transgenic (hTNF+/-) mice and K/BxN serum-treated mice. Systemic bone loss was analysed in the Lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation model. Joint inflammation and osteoclasts were assessed by histology and bone mass and bone erosion by micro-CT.ATX production by osteoclasts was observed and was revealed as a crucial factor controlling osteoclast activity. Inhibition of ATX led to reduced bone resorption in vitro. Then, we generated Enpp2fl/fl Ctsk-Cre+/- mice allowing ATX depletion specifically in mature osteoclasts. These mice showed no specific bone phenotype under physiological conditions but displayed significant protection against systemic bone loss and almost an absence of bone erosion formation after challenge with LPS and K/BxN serum transfer. Pharmacological inhibition of ATX significantly mitigated focal and systemic TNF-induced bone loss. Pharmacological and genetic inactivation of ATX ameliorates systemic and focal inflammatory bone loss by inhibiting bone resorption. ATX emerges as a new promising therapeutic target for the prevention of inflammatory associated bone loss

Les biomatériaux interviennent dans de nombreuses applications médicales. La connaissance de leur évolution une fois implantés dans l’organisme est primordiale pour les améliorer et en créer de nouveaux. Dans cette optique, nous avons réalisé une modélisation à deux dimensions de la transformation d’un biomatériau en os. Pour cette modélisation, nous utilisons la théorie de la percolation. Celle-ci traite de la transmission d’information à travers un milieu où sont distribués un très grand nombre de sites pouvant localement relayer cette information. Nous présentons un modèle de double percolation sites-liens, pour prendre en compte d’une part la vascularisation (et/ou résorption) du biomatériau de l’implant dans un os, et d’autre part sa continuité mécanique. Nous identifions les paramètres pertinents pour d´écrire l’implant et son évolution, qu’ils soient d’origine biologique, chimique ou physique. Les différents phénomènes sont classés suivant deux régimes, percolant ou non-percolant, qui rendent compte des phases avant et après vascularisation de l’implant. Nous avons testé notre simulation en reproduisant les données expérimentales obtenues pour des implants de corail. Nous avons réalisé une étude des différents paramètres de notre modèle, pour déterminer l’influence de ceux-ci sur chaque phase du processus. Cette simulation est aussi adaptable à différents systèmes d’implants. Nous montrons la faisabilité d’une modélisation à trois dimensions en transposant la partie statique de notre simulation. / Biomaterials play an important role in many medical applications. To know how they evolve once inserted in the human body is essential to improve them and to create new ones. For this purpose, we have elaborated a two dimensional model for the transformation of biomaterial into bone. For this model, we have used the percolation theory. This general theory accounts for the transmision of information across an environment in wich a huge number of sites relay localy this piece of information. We present a double site-bond percolation model to account, on the one hand, for the vascularization (and/or resorption) of biomaterial implant in bones and, on the other hand, for its mechanical continuity. We identify the relevant parameters to describe the implant and its evolution, and separate their biological or chimical origin from their physical one. We classify the various phenomena in two regimes, percolating or non-percolating, which concern the two stages before and after the vascularization of the implant. We have tested our simulation by comparing them with experimental results obtained withcoral implants. We have studied how the various parameters of our model can influence each stage of the process. This simulation can also be applied to different types of implants. We show that a three dimensional model is possible by transposing the static part of our simulation.

La polyarthrite rhumatoïde (PAR) est une maladie auto-immune dont le processus inflammatoire chronique aboutit à la formation d’érosions osseuses. Dans PAR, les neutrophiles peuvent exprimer le récepteur activateur NF-κB (RANK), facteur de régulation des réponses immunes et osseuses. Afin d’étudier le rôle de RANK exprimé par les neutrophiles inflammatoires dans la perte osseuse locale de la PAR, une arthrite expérimentale mimant la PAR est induite chez des souris dont le gène RANK est conditionnellement délété dans les neutrophiles (CKO-RANK). Les neutrophiles purifiés du liquide synovial des souris sauvages sont capables d’exprimer RANK et de former des cellules multinucléées résorbant une matrice calcifiée in vitro. La tomographie micro-informatisée des lésions articulaires montre la perte osseuse locale chez les souris sauvages avec arthrite alors que les souris CKO-RANK avec arthrite n’ont pas cette perte osseuse. Ces travaux montrent donc que ces neutrophiles inflammatoires exprimant RANK sont associés à la perte osseuse pathologique. / Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease whose chronic inflammation process results in the bone erosion formation. In RA, the neutrophils can express the receptor activator of NF-κB (RANK), a factor regulator of immune and bone responses. To study the role of RANK expressed by inflammatory neutrophils in pathological local bone resorption in RA, an experimental arthritis imitating RA is induced in mice with gene RANK conditional knock-out in neutrophils (CKO-RANK). Neutrophils purified from synovial fluid of wild-type mice are capable to express RANK and are capable to form the multinucleated cells resorbing bone matrix in vitro. Microcomputed tomography of the articular lesions shows the bone loss in wild-type mice with arthritis, while mice with CKO-RANK neutrophils with arthritis do not have this bone loss. Thus, these results show that inflammatory neutrophils expressing RANK can resorb bone of inflamed joints during arthritis.

Ce projet est le résultat d'une collaboration entre le laboratoire de vision et systèmes numériques (LVSN) de l'Université Laval et le département de Radio-oncologie du CHUQ. Il consistait à développer une méthode de simulation de la résorption d'un oedème de la prostate. La méthode développée est basée sur l'algorithme des masses-tenseurs élastique linéaire et sur une discrétisation en éléments finis. Elle consiste à étirer artificiellement le contour de la prostate pour simuler l'oedème, puis à relâcher et observer le comportement. Cette méthode a l'avantage de donner un modèle tridimensionnel de la résorption de l'oedème contrairement aux modèles existants qui sont des modèles de modélisation de la décroissance du volume seulement, comme le modèle exponentiel par exemple. Les résultats obtenus avec cette méthode sont assez proches du comportement réel. Ces résultats seront éventuellement exploités dans la boucle de calcul de dosimétrie pour le traitement du cancer de la prostate par curiethérapie avec implants permanents. Le modèle visco-élastique linéaire servira également à la réalisation d'un simulateur de traitement en réalité virtuelle.