Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Cette thèse s'intègre dans un programme de modélisation du cancer. Une étape clé du développement de cette maladie est la formation de métastases secondaires: des cellules cancéreuses échappées d'une tumeur primaire interagissent avec l'endothélium vasculaire via des mécanismes biologiques spécifiques, s'arrêtent et s'étalent sur la paroi du vaisseau sanguin, puis la traversent pour coloniser les tissus sous-jacents. Pour mieux cerner un des aspects de ce phénomène, nous avons testé l'effet d'un écoulement croissant sur l'étalement de cellules cancéreuses adhérentes à une paroi en géométrie confinée. Nous avons estimé expérimentalement et prédit de façon théorique la contrainte de cisaillement critique marquant la transition entre l'étalement et la rétraction de la cellule. Nous avons ensuite mis en évidence la relocalisation vers l'avant de la cellule des zones d'adhésion et de l'actine polymérisée lorsque la contrainte de cisaillement à la paroi avoisine la contrainte critique.

Talin is a multifunctional cytoskeletal protein that plays a critical role in linking the actin cytoskeleton to the integrin family of transmembrane cell adhesion receptors. Two distinct integrin binding sites have been identified in talin, one present in the globular head domain (IBS1) and involved in integrin activation, and a second (IBS2), that has been delineated to a 130 residue fragment of the talin rod domain, but whose functional role is still elusive (Tremuth et al.,2004). The objective of the present study was to define the minimal structure of talin IBS2 and to investigate its functional role in the integrin-cytoskeleton connection. In the first part of this study, we used a combination of three different experimental approaches to define the minimal structure of talin IBS2: 1) an in silico bioinformatics approach to analyse sequence conservation of talin IBS2, 2) an in vivo cell biology approach to study the subcellular localization of recombinant talin fragments covering IBS2 in CHOáIIbâ3 cells, and 3) an in vitro biochemical approach consisting in protein overlay, pull down and Surface Plasmon Resonance (SPR) assays, to study the direct interaction between talin IBS2 and the integrin â3 subunit. We delineated IBS2 to a single amphipathic á-helical repeat of 23 residues within the talin rod domain. We further provided evidence that a two amino acid mutation(L2094I2095/AA) was sufficient to inactivate the IBS2 site, due to a disruption of the á helix structure, as demonstrated by infrared spectroscopy. In addition, we identified 2 lysine residues (K2085, K2089) exposed on the solvent face of á helix 50, which are directly involved in the talin IBS2-integrin interaction. In the second part of this study, we investigated the functional role of talin IBS2 in spreading defective talin (-/-) cells and showed that in contrast to full-length wild type talin, an IBS2 LI/AA mutant talin was unable to fully rescue the spread phenotype of these cells. These results provide the first direct evidence that IBS2 in the talin rod is essential to link integrins to the actin cytoskeleton.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’objectif du travail présenté dans cette thèse était de développer des nanoparticulesfonctionnelles ayant la capacité d’induire l’adhésion et la migration de kératinocyteshumains normaux. L’utilisation de systèmes particulaires pour favoriser l’adhésion etla migration cellulaire dans les processus de cicatrisation constitue une nouvelleapproche de l’ingéniérie tissulaire. Dans cette optique, un dérivé hydrosoluble du chitosan rendu fonctionnel par l’ajoutde peptides RGD a été développé. Les nanoparticules furent développées parcoacervation complexe entre le dérivé cationique du chitosan et le sulfate dechondroïtine anionique. La capacité du système particulaire à induire unchangement cellulaire phénotypique a été évaluée in vitro.Lors de l’évaluation de ce nouveau polymère, le succès de la synthèse a été montrépar l’absence de cytotoxicité et par la préservation de son activité biologique médiéepar les séquences RGD. Aussi bien les polymères que les nanoparticules ont induitl’adhésion et la mobilité de fibroblastes dermiques humains, confirmant le conceptde nanoparticules bio-actives. Cependant, concernant l’étude des interactions entreles nanoparticules et les kératinocytes, aucune conclusion n’a pu être tirée etd’autres travaux sont nécessaires. Pour résumer, un système particulaire bio-actif a été développé. Le choix despeptides RGD pour induire la migration des kératinocytes doit être réévalué, etl’utilisation de concentrations plus importantes, de mélange de peptides d’adhésionou l’utilisation de peptides d’adhésion différents doit être envisagée pour laréalisation d’études ultérieures. / The aim of the work presented in this thesis, was to develop functionalizednanoparticles with the ability to induce adhesion and migration in normal humankeratinocytes. Using particulate systems to promote and support cell adhesion andmigration in epidermal restoration is a novel approach of tissue engineering.In this view, a water-soluble chitosan derivative functionalized with RGD peptideswas developed. Nanoparticles were formed through complex coacervation betweenthe cationic chitosan derivative and the anionic chondroitin sulfate. The particulatesystem was evaluated in vitro for its ability to change phenotype in cells.In the evaluation of the novel hybrid polymer, the successful synthesis wasconfirmed by the absence of cytotoxicity and a preserved bioactivity specific to theRGD-moieties. Both the polymer and the particles formed thereof induced celladhesion and spreading in human dermal fibroblasts, proving the concept ofbioactive nanoparticles. However, when investigating the interaction between thenanoparticles and keratinocytes, no clear conclusion could be drawn and furtherassays are required. To summarize, a bioactive particulate system was developed. The choice of RGDpeptides to induce migration in keratinocytes needs to be re-evaluated and higherconcentrations, mixtures of adhesion peptides or other adhesion peptides might beconsidered for further investigations.

L'objectif visé dans cette étude consiste à développer une méthodologie de caractérisation des interactions ligands/récepteurs cellulaires à la surface d'un transducteur physique. Le ligand immobilisé est représenté par un cyclopentapeptide c(-RGDfK-) dont les propriétés de reconnaissance spécifique pour l'intégrine alphaV beta3 sont bien connues. Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit concernent la synthèse des ligands peptidiques, la mise au point des différentes techniques d'immobilisation de ces ligands et enfin la caractérisation des interactions biomoléculaires avec des cellules exprimant l'intégrine. Le ligand peptidique est présenté de façon multivalente sur un châssis moléculaire cyclodécapeptidique de séquence c(-Pro-Gly-Lys-Lys-Lys-)2. Le greffage des différents motifs se fait via la formation d'un lien éther d'oxime ou d'un lien amide sur les chaînes latérales des lysines orientées de part et d'autre du plan moyen du cyclopeptide. Trois approches ont été mises en œuvre pour fixer les ligands -RGD- sur une surface : le couplage affin, l'insertion dans une bicouche lipidique et le couplage covalent. Les surfaces fonctionnelles résultantes ont été caractérisées par des méthodes physico-chimiques d'analyse de surface et d'interface. Des tests d'adhésion cellulaire, suivis par QCM-D et par microscopie optique, ont ensuite permis de caractériser les propriétés de reconnaissance des ligands peptidiques. La comparaison des signaux de QCM-D et des images de la surface, obtenus à différents taux de greffage du ligand a permis d'identifier une densité de greffage minimale en ligand nécessaire à l'adhésion et à l'étalement des cellules.

Afin d'identifier de nouvelles cibles organo-spécifiques de l'endothélium, nous avons comparé l'expression de gènes entre deux lignées de hautes cellules endothéliales et mis en évidence la protéine ARM-1. Des expériences de RT-PCR ont montré une expression spécifique d'ARM-1 dans certaines lignées de cellules endothéliales et de lymphocytes. La surexpression d'ARM-1 dans des cellules endothéliales de peau, n'exprimant pas cette protéine, augmente de façon préférentielle l'adhésion de certaines lignées lymphocytaires sur ces cellules. Ceci renforce l'hypothèse d'un rôle particulier d'ARM-1 au sein des cellules endothéliales. Une étude de fractionnement cellulaire a montré qu'ARM-1 était une protéine sécrétée, pouvant être associée à la membrane. Des expériences d'immunolocalisation n'ont cependant démontré aucune expression d'ARM-1 à la surface cellulaire. Ces résultats suggèrent une action indirecte d'ARM-1 dans l'adhésion plutôt qu'un rôle direct en tant que molécule d'adhésion.

Le but de cette thèse de doctorat était de concevoir des brosses de polymères stimuli-sensibles afin de contrôler dynamiquement les interactions adhésives entre une cellule et son substrat.Pour cela, nous avons utilisé la polymérisation radicalaire par transfert d'atomes (ATRP) initiée en surface, et sa variante permettant de régénérer in situ le catalyseur de polymérisation (ARGET-ATRP), pour préparer des brosses thermo-sensibles de poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM). Les deux méthodes ont été appliquées pour différentes densités surfaciques et temps de polymérisation, et les cinétiques de croissance de la brosse à l'aide des deux protocoles ont été étudiés. Une croissance de chaîne bien contrôlée a été observée avec le protocole ARGET-ATRP, mais pas avec la méthode ATRP. Le protocole testé ci-dessus a été utilisé pour fabriquer des brosses de PNIPAM qui ont été patternées par l'intermédiaire d'une stratégie d'ablation aux UV profonds, afin de concevoir des substrats permettant de contrôler spatialement l'adsorption de protéines. Ces substrats ont montré d'excellentes propriétés adhésives, sont réutilisables et peuvent se stocker sur de longues périodes.Les changements conformationnels de brosses PNIPAM ont été sondés grâce à un dispositif original mis en place sur la base d'un microscope en réflexion à contraste d'interférences (RICM). La technique RICM a permis d'estimer la réponse optique des brosses en fonction de leur profil de hauteur, ce qui en fait un outil intéressant pour leur caractérisation. La réponse de la brosse a été étudiée en fonction de sa densité de greffage et de la longueur de chaîne. Les résultats ont fourni une preuve unique de l'existence d'un phénomène de séparation de phase verticale, donnant lieu à des changements structurels non-uniformes dans les brosses lors du passage de la température inférieure de solubilité du PNIPAM dans l'eau. Le RICM a été utilisé pour réaliser la tâche complexe d'estimer les paramètres moléculaires de la brosse et la compréhension de l'origine physique du phénomène d'hystérésis thermique dans une brosse de polymère.De nouveaux polymères stimuli-sensibles ont été synthétisés dans le but d'obtenir des systèmes d'intérêt pour les études biologiques en conditions physiologiques. Nous avons conçus différents co-polymères photo-thermo-sensibles à base d'acrylamides et d'acrylates. Les changements de conformation des polymères conçus ont été étudiés en détail en faisant varier la composition globale des monomères dans le système. Nous avons identifié une composition de ter-polymères dont les solutions aqueuses ont montré une séparation de phase à 37°C qui peut être réversible sous irradiation lumineuse, ce qui la rend compatible pour les études d'adhésion cellulaire. / The aim of the current Ph.D thesis was to design stimuli responsive polymer brushes in order to dynamic control cell-substrate adhesive interactions.For this purpose, Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) and Activators Regenerated by electron Transfer (ARGET)-ATRP were used in order to prepare thermo responsive Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) brushes. Both the methods were applied under varying surface densities and polymerization times, and the kinetics of the brush growth using both the protocols was investigated. A well controlled chain growth was reported under ARGET-ATRP protocol, in contrast to the ATRP method. The above tested protocol was used to grow PNIPAM brushes that were patterned via deep UV photoablation strategy to design thermoresponsive patterned substrates for protein adsorption studies.The substrates showed excellent adhesive properties and reusability with long term storage capacity.The conformational changes of PNIPAM brushes, grown via the ARGET-ATRP protocol, were investigated using an original set-up based on Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM). RICM allowed us to probe the optical response of the brushes as a function of their density profile, making it an interesting tool for brush characterization. The response of the brush was studied as a function of brush grafting density and chain length. The results provided a unique evidence for non-uniform structural changes within the brush thickness when the solvent temperature was varied across the Lower Critical Solution Temperature (LCST) of the polymer. RICM was employed to achieve the challenging task of estimating the molecular parameters of the brush and understanding the physical origin of the phenomenon of thermal hysteresis in a polymer brush.Stimuli Responsive Polymers, sensitive to non-invasive stimuli, were synthesized with an aim to address dynamic single cell adhesion studies at their physiological conditions. Free Radical Polymerization and ARGET-ATRP protocol were used to design two photo-thermo-responsive poly(DMA-AZAA) and poly(DMA-NIPAM-AZAAm) polymers. The conformational changes of the designed polymers were investigated at length by varying the overall composition of monomers in the system. The solutions of the DMA-NIPAM-AZAAm terpolymer showed a sharp phase separation at 37°C that could be reversibly switched under light irradiation, making it compatible for cell adhesion studies.

La biocompatibilité d'un implant est principalement contrôlée par l'interface entre le biomatériau et le tissu environnant. Afin de contrôler cette interaction et de favoriser l'adhésion des cellules sur l'implant, nous avons créé à la surface d'alliages de titane des domaines nanométriques concentrés en séquence Arginine-Glycine-Acide Aspartique (RGD) reconnue pour ses propriétés adhésives. Après avoir modifié la chimie de surface par un agent de liaison aminosilane, nous avons utilisé les méthodes de synthèse de dendrimères ou liés des nanoparticules à l'aminosilane afin de démultiplier le nombre de amines primaires par site. Ces amines primaires étant ensuite utilisées pour attacher la séquence RGD à la surface du matériau. L'adhésion d'ostéoblastes sur les matériaux préparés a été étudié par acoustique picoseconde. / Abstract

Dans le système immunitaire, l’activation des cellules B nécessite la reconnaissance spécifique par les récepteurs membranaires des cellules B des antigènes portés par cellules présentatrices d’antigènes (macrophages, cellules dendritiques, …). Cette reconnaissance se traduit par une accumulation de protéines adhésives constituant une structure moléculaire appelée synapse immunologique, à partir de laquelle sont extraits les antigènes. Les mécanismes biologiques impliqués dans l’extraction d’antigènes par les cellules B sont encore mal connus. Dans notre étude, nous proposons d’utiliser des gouttes d’huile dont la surface est fonctionnalisée par des anticorps, comme substrat pour l’activation des cellules B. Ces gouttes présentent l’intérêt de posséder une interface liquide et d'être déformables (mesure de forces possible). Afin de mettre en contact les gouttes fonctionnalisées avec les cellules B, nous avons fabriqué un réseau de pièges ayant la forme d’un U répartis dans une chambre microfluidique. La forme de cette chambre a été optimisée de manière à garantir un remplissage efficace des pièges. Le dispositif expérimental mis au point permet de mettre en contact une goutte fonctionnalisée par des anticorps et une cellule B dans plusieurs pièges en parallèle, et d’observer l’évolution du contact dans le temps par microscopie. Nous avons observé que le contact goutte/cellule induisait une accumulation d’anticorps greffés à la goutte au niveau de la zone de contact. La cinétique d’accumulation est mesurée. Des observations en fluorescence des lysosomes des cellules B montrent une polarisation vers la zone de contact, suggérant une réponse de la part de la cellule. / In the immune system, B cell activation is triggered by the specific binding of the B cell receptors with the antigens present on antigen-presenting cells like macrophage, dendritic cells, ... This recognition leads to an accumulation of adhesive proteins at the contact. This molecular structure is called immune synapse, from which the antigens are extracted by the B cell. The precise biological mechanisms implied in the extraction of antigens are still unknown. In our work, we propose to use antibody-coated oil droplets as substrates for the activation of B cells. These droplets have the advantage to have a liquid surface, allowing the antibodies-coated diffusion at their surface. Moreover, these droplets are potentially deformable, so they behave as cellular force probes. Lastly, the droplets have the same size of the B cells, so they mimic the antigen-presenting cells. In order to put in contact the B cells with the droplets, we fabricated a regular network of microfluic traps with U-shape in a microfluic chamber. The shape of the chamber has been optimized to guaranty a good trapping efficiency. Using the traps, we have been able to put into contact one antibody-coated droplet with one B cell in several traps in parallel, and to observe the contact in function of time by fluorescence microscopy. We observed an accumulation of the antibodies coated on the droplet at the surface of contact. The kinetics of accumulation has been measured and the time scale of accumulation has been deduced. Also, observations with fluorescence showed a polarization of the lysosomes near the contact, suggesting a B cell response.