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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'environnement hémodynamique des cellules endothéliales est un stimulus capital pour l'activation et le maintien de leurs fonctions. Les vaisseaux sanguins sont constamment soumis aux forces hémodynamiques sous forme de tension et de forces de cisaillement et ces forces font partie intégrante de l'environnement physiologique des cellules endothéliales. La force de cisaillement présente à l'interface sang-paroi vasculaire agit au niveau de l'endothélium et influence la biologie des cellules endothéliales. La présence de ces forces est souvent négligée dans les modèles in vitro traditionnels d" étude de l'endothélium. Une simple couche de cellules, en deux dimensions, dans un environnement statique s'éloigne de l'environnement natif des cellules endothéliales. La méthode d'autoassemblage développée dans notre laboratoire a permis de mettre au point un modèle in vitro d'étude de l'endothélium humain dans des conditions plus physiologiques. Ce modèle appelé matrice fibroblastique tubulaire est formé de matrice extracellulaire endogène, tridimensionnelle et de forme tubulaire. Ces caractéristiques permettent la culture de cellules endothéliales humaines sur une matrice endogène en plus de les exposer à un flux hémodynamique physiologique. L'objectif de ces travaux était d'évaluer la réponse au flux hémodynamique des cellules endothéliales cultivées dans ce modèle. Après une période d'exposition de 4 heures au flux, les observations microscopiques de l'endothélium démontrent des changements de morphologie des cellules endothéliales qui se rapproche de la réalité in vivo. Nous avons observé un alignement et un étirement des cellules parallèles à la direction du flux et un réarrangement du cytosquelette par la formation de fibres de stress également parallèles à la direction du flux. De plus, nous n'avons pas observé de décollement des cellules par le flux, indiquant l'affinité du substrat de matrice extracellulaire. Nous avons analysé l'influence de l'exposition au flux sur l'expression de 7 gènes impliqués dans la biologie endothéliale : PECAM, eNOS, ETB l , PAI-1, tPA, VECAD et vWF. Nous n'avons pas observé de différences significatives des niveaux d'expression de ces gènes entre la condition statique et dynamique. Le modèle de la matrice fibroblastique tubulaire possède un potentiel certain pour l'étude des cellules endothéliales dans un environnement hémodynamique physiologique. Son utilisation pourrait profiter à plusieurs domaines d'étude impliquant les cellules endothéliales. / The hemodynamic environment of endothelial cells (EC) is a major stimulus for their functions and maintenance. Blood vessels are constantly exposed to hemodynamic forces in form of tension and shear stress. These forces are part of the natural environment of blood vessels and EC. The shear stress present at the blood-vessel wall interface acts directly on the endothelium and modulate its functions at several levels. The hemodynamic environment is often neglected with traditional in vitro models of the endothlium. A simple layer of EC. in two dimensions, in a static environment is far away from the native physiological conditions. The self-assembly method. developed in our laboratory. open the door for a new in vitro model of the human endothelium which can be study under more physiological conditions. This model is composed of fibroblastic three dimensional tubular extracellular matrix (FTM). Its features allow us to culture human EC on an endogenous matrix and to expose them to a physiological flow. In order to study the response of human EC under shear stress in our FTM, the endothelialized FTMs were submitted to static and flow conditions for 4 hours in an hemodynamic bench. Following flow experiments, microscopic observations of the endothelium show changes of cell morphology which approach in vivo reality. We observed an alignment and a stretching of the cells parallel to the flow direction. We also observed a rearrangement of the cytoskeleton by actin stress fibers formation parallel to flow direction. Moreover, we did not observe any cell removed by the flow indicating the affinity for the extracellular matrix. We analyzed the influence of hemodynamic flow on the expression of 7 genes involved in EC biology: PECAM, eNOS, ET-B1, PAI-1, tPA, VECAD and vWF. We did not observe any significant differences induced by the flow in the expression levels of these genes. The FTM model has an undeniable potential for EC studies under a physiological hemodynamic environment and several fields involving EC could benefit from it.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les modifications artérielles liés au vieillissement ou au diabète telles que la dysfonction endothéliale contribuent à augmenter le risque de survenue d'événements cardiovasculaires. La dysfonction endothéliale, coronaire ou périphérique, est reconnue comme un facteur indépendant de survenue d'évènements cardiovasculaires indépendamment de la présence d'athérosclérose ou de facteur de risque d'athérosclérose. Des approches thérapeutiques capables de prévenir ou de restaurer la dysfonction endothéliale pourrait aider à réduire le risque de survenue d'accidents cardiovasculaires. Ce travail a pour but d'évaluer les effets de deux molécules, l'une sur la dysfonction endothéliale liée à l'âge, l'autre sur la dysfonction liée au diabète. En prévention primaire et secondaire, l'aspirine à faible dose réduit l'incidence des évènements cardiovasculaires. La première partie de ce travail étudie les effets de l'aspirine à faible dose sur la dysfonction endothéliale chez des souris C57B/J6. La dysfonction endothéliale liée à l'âge est établie par la réponse à l'acétylcholine (ACh) de segments aortiques précontractés par phenylephrine (Phe) et isolés de souris âgées de 12-, 36-, 60- et 84 semaines. Les effets de l'aspirine à faible dose sont étudiés chez des souris présentant une altération de la relaxation endothélium-dépendante. Les effets de l'âge et du traitement par aspirine sur la structure de la paroi ont été déterminés sur des coupes aortiques de souris. Les effets de l'aspirine sur des marqueurs du stress oxydants, le malondialdehyde (MDA) et l'8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OhdG) ont été étudiés. Comparée à celle des souris âgées de 12 semaines, la relaxation endothelium-dépendante était significativement réduite chez les souris âgées de 60- et 84-semaines (p<0.05). Les souris âgées de 68 semaines traitées par aspirine avaient une meilleure relaxation endothélium-dépendante comparées aux souris contrôles du même âge (83.9%±4 vs 66.3%±5; p<0.05). L'aspirine à faible dose diminuait les concentrations de 8-OHdG au sein de la paroi aortique (p<0.05), mais n'avait pas d'effet significatif sur l'épaisseur intima-média. L'effet protecteur de l'aspirine n'a pas été observé lorsque le traitement a été initié chez des souris plus âgés (96 semaines). L'aspirine à faible dose est capable de prévenir la dysfonction endothelium-dépendante chez des souris vieillissantes. Cependant l'absence d'effet chez des souris plus âgées montre que le traitement doit être initié tôt. Les mécanismes impliqués dans l'effet protecteur de l'aspirine à faible dose pourrait être le stress oxydant. Les AGE sont impliqués dans la dysfonction endothéliale notamment liée au diabète, via des phénomènes de quenching du NO et d'interaction AGE-RAGE, cette dernière entraînant une augmentation du stress oxydant. La deuxième partie de notre travail analyse l'action de l'aminoguanidine, puissant inhibiteur des AGE sur la dysfonction endothéliale liée au diabète. La dysfonction endothéliale de souris C57B/6J rendues diabétiques par injection de streptozotocine, est établie par la réponse à l'acétylcholine (ACh) de segments aortiques précontractés par phenylephrine (Phe) et isolés de souris après 4 et 8 semaines de diabète. Des dosages d'AGE sériques par technique ELISA et une évaluation de l'expression de RAGE par technique de western blot ont été réalisés sur des broyats aortiques. Après 4 semaines de diabète, comparée à celle des contrôles, la relaxation endothélium dépendante était diminuée de 24% (p<0,01) et s'altérait encore après 8 semaines de diabète. Cette dysfonction endothéliale était associée à une augmentation significative des AGE sériques, de l'expression de RAGE et à des anomalies histologiques significatives.Le traitement par aminoguanidine permettait d'une part de prévenir les anomalies de relaxation endothelium dépendante observées chez les souris diabétiques de 4 semaines, réduisait les AGE sériques et l'expression de RAGE et d'autre part améliorait les anomalies histologiques vasculaires. Ces résultats suggèrent une implication de la voie des AGE dans la dysfonction endothéliale liées au diabète. L'utilisation de molécules anti AGE ou inhibiteurs de l'interaction AGE-RAGE ouvre de larges perspectives thérapeutiques du diabète. En conclusion, l'ensemble de ces résultats suggèrent la possibilité de prévention de la dysfonction endothéliale et ainsi laisse espérer la diminution de survenue d'évènements cardiovasculaires

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Cette recherche visait à étudier l'impact des facteurs de croissance (FC) libérés dans les surnageants de plasmas riches en plaquettes (PRP) sur la prolifération des cellules endothéliales et à optimiser le potentiel mitogénique des PRP. Des anticorps spécifiques dirigés contre les FC d'intérêt ont été ajoutés aux surnageants de PRP et l'effet des neutralisations a été déterminé dans un modèle in vitro de prolifération des cellules endothéliales. En parallèle, nous avons déterminé le potentiel mitogénique de combinaisons de FC recombinants, supplémentés ou non de surnageants de PRP. Bien que les facteurs Epidermal Growth Factor (EGF), basic Fibroblast Growth Factor et Vascular Endothelial Growth Factor soient hautement mitogéniques pour les cellules endothéliales, seul EGF semble être libéré à des concentrations suffisantes pour engendrer un effet significatif sur la division cellulaire. Cette étude a également permis de démontrer que les surnageants de PRP sont hautement mitogéniques, et l'ajout de FC n'a pas permis d'optimiser cet effet.

Les métastases sont une complication souvent irréversibles et fatales du cancer. L'adhérence et la migration des cellules cancéreuses sur et à travers l'endothélium vasculaire sont des étapes critiques du processus métastatique. Nous avons étudié le rôle des molécules d'adhérence, E sélectine et intégrines, ainsi que celui de la kinase SAPK2/p38 dans la régulation de l'adhérence et la migration transendothéliale des cellules HT-29 provenant d’un carcinome du colon. Le TNFα augmente fortement l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales humaine HUVEC. Cet effet est indépendant de l'activation de SAPK2/p38 induit par le TNFα. L'adhérence des cellules HT-29 sur une monocouche de cellules HUVEC prétraitées au TNFα dépend de l'expression de la E-sélectine mais est indépendante de l'activité de SAPK2/p38 des cellules HUVEC et des cellules cancéreuses. Le blocage par des anticorps spécifiques des intégrines des cellules HT-29 révèle aussi la participation de l'intégrine β4 dans leur adhérence aux cellules HUVEC activées par le TNFα. L'adhérence par l’intégrine β4 est impliquée plus tardivement que l’adhérence par la E-sélectine. L'adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées mène à l'activation de SAPK2/p38 dans les cellules cancéreuses. De plus, une protéine chimérique de E-sélectine/Fc induit l'activation spécifique des kinases SAPK2/p38 et ERK des cellules HT-29. Ceci suggère que l'attachement des cellules HT-29 à la E-sélectine implique un récepteur fonctionnel et signalétique. Cependant, la liaison de la E-sélectine aux cellules HT-29 n’a pas conduit à la phosphorylation de l’intégrine β4, suggérant que ces deux événements ne sont pas liés signalétiquement. L’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées implique également un facteur soluble non identifié. Ceci suggère que l’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est comparable à celle des lymphocytes, c’est-à-dire qu’elle implique l’utilisation séquentielle de sélectines, chimiokines et intégrines. Le blocage de l'augmentation de l'activité de SAPK2/p38 induite par l’adhérence des cellules HT-29 empêche leur migration transendothéliale. Nos résultats suggèrent que la régulation de la migration transendothéliale des cellules cancéreuses implique deux étapes essentielles: une interaction spécifique avec l'endothélium par l'utilisation séquentielle de molécules d'adhérence, telles que la E-sélectine et l’intégrine β4, et une augmentation du potentiel migratoire par l'activation médiée par l’adhérence de la voie SAPK2/p38. / Metastasis is a dreadful complication of cancer. Adhesion and migration of tumor cells on and through the vascular endothelium are critical steps of the metastatic process. We investigated the roles of the adhesion molecules E-selectin and integrins, as well as the role of the MAP kinase SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2/p38), in modulating endothelial adhesion and transendothelial migration of HT-29 colon carcinoma cells. TNFα strongly increases the expression of E-selectin in human endothelial cells HUVEC. This effect is independent of the activation of SAPK2/p38 induced by TNFα. Adhesion of HT-29 cells on a monolayer of HUVEC pre-treated with TNFα is dependent on E-selectin expression but is independent of SAPK2/p38 activity of both HUVEC and tumor cells. Blocking the integrins from HT-29 cells (α2, α3, α6, αvβ5, β1 and β4) with specific antibodies reveals a role for β4 integrin in their adhesion to TNFα-treated HUVEC. The sequence of events showed that β4 integrin adhesion is involved later then E-selectin adhesion. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated HUVEC leads to the activation of SAPK2/p38 in the tumor cells, as reflected by the increased phosphorylation of its downstream target, the actin polymerizing factor HSP27. Moreover, a recombinant E-selectin/Fc chimera induces the specific activation of SAPK2/p38 and ERK (extracellular signal-regulated kinases) in HT-29 cells, suggesting that the binding of E-selectin to HT-29 cells involves a functional and signaling receptor. However, the binding of E-selectin to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of β4 integrin suggesting that the two adhesion events are not signalingly linked. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated HUVEC also implicates a soluble unidentified factor. This indicates that the adhesion of cancer cells to the endothelium uses the same sequence as lymphocytes namely, selectins, chemokines and integrins. Blocking the adhesion-mediated increase of SAPK2/p38 activity of HT-29 cells inhibits their transendothelial migration. Overall, our results suggest that the specific regulation of transendothelial migration of tumor cells involves two essential steps: 1) adhesion to the endothelium by the sequential use of adhesion molecules, such as E-selectin and β4 integrin, 2) increased motogenic potential through adhesion-mediated activation of the SAPK2p38 pathway.