Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Il est maintenant admis que l’activité anti-tumorale du TNF implique une destruction de la vascularisation de la tumeur par induction d’apoptose des cellules endothéliales. Si le traitement au TNF en thérapie humaine permet des rémissions complètes, il n’est applicable qu’aux membres isolés de la circulation systémique car les doses requises de TNF sont létales pour le patient. Mettre en évidence les mécanismes qui contrôlent l’apoptose de la cellule endothéliale devrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques favorisant l’effet thérapeutique du TNF tout en évitant le choc septique qu’il engendre. Nous avons abordé cette question en utilisant le modèle de la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) stimulée au TNF afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent le processus apoptotique et ce au cours des phases précoces de celui-ci. D’une part, nous avons identifié par une approche pharmacologique au moins trois voies de contrôle négatif d’induction de mort cellulaire par le TNF dans les cellules endothéliales : la première faisant intervenir une des protéines kinases C, une seconde la PI3-kinase et une troisième la protéine kinase p38. Cette dernière semble spécifiquement activée par le TNF et pourrait donc constituer une nouvelle cible pharmacologique visant à sensibiliser les cellules endothéliales de la vascularisation de la tumeur à l’action apoptotique du TNF. D’autre part nous avons mis en évidence et identifié par une approche protéomique au moins deux protéines montrant une rapide diminution de phosphorylation lorsque les cellules endothéliales sont stimulées par le TNF en présence de cycloheximide. Ces deux événements semblent en aval de l’activation d’une protéase de la famille des caspases. La première protéine est la sous-unité régulatrice de type II alpha (RIIα) de la protéine kinase A. Cependant, la relation entre cette déphosphorylation et le processus d’apoptose n’a pas pu être mise en évidence, une stimulation de l’activité PKA n’affectant pas l’induction d’apoptose des BAEC. La seconde est la protéine HDGF, connue pour être sur-exprimée dans certains cancers, mais dont la régulation par phosphorylation ainsi que son implication éventuelle lors du processus apoptotique n’avaient encore jamais été envisagées. Enfin, nous avons voulu mettre en évidence le rôle potentiel de la protéine hnRNP K qui subit une modification post-traductionnelle précoce lors de l’apoptose des BAEC. Notre étude, menée après surexpression de la protéine étiquetée, suggère une modification autre qu’une dégradation. Cependant, il ne nous a pas été permis de lui attribuer un rôle puisque la surexpression de cette protéine n’affecte pas l’apparition de différents marqueurs associés à l’apoptose.

Depuis les observations du Professeur Trousseau en 1865, le lien entre la progression tumorale et les désordres thrombotiques a été établi. Les patients atteints de cancer sont plus à risque de développer des coagulopathies dues au caractère pro-coagulant des cellules tumorales. Celles-ci induisent une hypercoagulation afin de synthétiser une matrice de fibrine qui servira de support pour la croissance tumorale. Suite à sa stabilisation matricielle, la tumeur sécrète plusieurs agents angiogéniques afin d'induire sa propre vascularisation. La suractivation du système de coagulation contribue alors à la croissance et à l'angiogenèse tumorale et le maillon commun semble être le facteur tissulaire. Cette glycoprotéine transmembranaire est exprimée de manière ubiquitaire dans les tissus subendothéliaux. Son rôle est d'initier la coagulation extrinsèque; lorsque l'intégrité vasculaire est atteinte, le facteur tissulaire est exposé au flux sanguin qui contient son ligand naturel, le facteur VIl. Ces derniers s'associent et le complexe pro-coagulant formé active la thrombine qui convertit le fibrinogène soluble en caillot de fibrine insoluble qui se loge au niveau de la blessure afin de rétablir l'hémostase. Le facteur tissulaire est également impliqué dans la vascularisation embryonnaire car selon certaines études, une délétion totale du gène entraîne une mort in utéro de l'embryon directement causé par un déficit de vascularisation. À l'inverse, sa surexpression entraîne un phénotype pathogénique tel qu'observé chez plusieurs lignées tumorales. Les objectifs de cette étude ont été d'évaluer l'effet de la surexpression du facteur tissulaire sur les propriétés angiogéniques des cellules endothéliales de l'aorte bovine ainsi que de caractériser la capacité du complexe pro-coagulant à induire la migration des cellules épithéliales issues de carcinome rénal humain. Les résultats indiquent que la surexpression endothéliale du facteur tissulaire induit la migration et la formation de structures de type capillaire de manière dépendante et indépendante des mécanismes de l'hémostase. De plus, le complexe pro-coagulant induit la migration des cellules épithéliales métastatiques de carcinome rénal mais non de leur contrepartie non-métastasique qui est caractérisée par une plus haute expression du facteur tissulaire. Finalement, les cellules épithéliales métastatiques et non-métastatiques induisent des différents profils d'activation de la protéine extracellular signal regulated kinase qui régule plusieurs processus cellulaires dont la migration. Ces résultats indiquent alors que le facteur tissulaire est impliqué dans l'angiogenèse et dans la progression tumorale selon des mécanismes qui impliquent ou non l'activité du complexe pro-coagulant. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Facteur tissulaire, Complexe pro-coagulant, Angiogenèse, Cellules endothéliales tumorales, Coagulopathies et cellules épithéliales de carcinome rénal.

L’endothélium joue un rôle primordial dans la régulation de l’homéostasie vasculaire, en partie, par la libération de facteurs relaxants [le monoxyde d’azote (NO), le facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF) et la prostacycline (PGI2)] et contracturants (les prostanoïdes). Le vieillissement vasculaire est associé à une dysfonction endothéliale caractérisée par une diminution des composantes relaxantes mais également par une augmentation des réponses contractiles dépendantes de l’endothélium. Le but de ce travail était d’évaluer les effets préventifs et curatifs de produits naturels riches en polyphénols (extraits du vin rouge et d’aubépine) contre la dysfonction endothéliale liée au vieillissement chez le rat et l’induction d’une sénescence réplicative dans des cellules endothéliales en culture. Ces produits naturels ont des propriétés préventives et curatives vis-à-vis de la dysfonction endothéliale liée au vieillissement qui se manifestent par une amélioration des composantes NO et EDHF de relaxation et par une diminution des réponses contractiles dépendantes de l’endothélium. Ces effets protecteurs sont vraisemblablement dus à une diminution du stress oxydant et une normalisation du système angiotensine dans la paroi artérielle. Les polyphénols retardent la sénescence réplicative des cellules endothéliales probablement par augmentation de l’expression de la eNOS, de la formation de NO et la diminution de l’expression et de l’activité de p21. Les résultats de ce travail de recherche confirment les données cliniques indiquant que la consommation régulière d’aliments riches en polyphénols diminue le risque cardiovasculaire et augmente l’espérance de vie. / The endothelium plays a crucial role in the regulation of vascular homeostasis, in part, by the release of relaxing factors [nitric oxide (NO), endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) and prostacyclin (PGI2)] and contracting factors (prostanoids). Vascular aging is associated with an endothelial dysfunction characterized by decreased endothelium-dependent relaxation, but also by increased endothelium-dependent contractile responses. The purpose of this research was to evaluate the preventive and curative effects of polyphenols-rich natural products (red wine and Crataegus extracts) against both aging-related endothelial dysfunction in rat mesenteric artery and replicative senescence in porcine coronary artery endothelial cells. Polyphenols have preventive and curative properties against the aging-related endothelial dysfunction. They improved NO- and EDHF-mediated relaxations and decreased endothelium-dependent contractile responses. These protective effects are associated to a decrease in oxidative stress and normalization of angiotensin system in the arterial wall. Polyphenols delay replicative senescence in endothelial cell most likely by preventing the downregulation of eNOS expression and activity, and the upregulation of p53/p21 pathway. The results of this research confirm the clinical data indicating that regular consumption of foods rich in polyphenols reduces cardiovascular risk and increased life expectancy.

Les cellules endothéliales (CE) vasculaires cérébrales jouent un rôle important en tant que composantes structurales et fonctionnelles de la barrière hémato-encéphalique. L'angiogenèse tumorale, un processus important pour la croissance tumorale et pour le processus métastasique, régule le recrutement des CE qui, lorsqu'activées, prolifèrent et se différencient pour générer des structures capillaires afin de livrer les nutriments et l'oxygène au sein du compartiment tumoral. Les recherches rapportées dans ce mémoire nous ont permis de cibler, d'un point de vue pharmacologique, l'angiogenèse tumorale cérébrale. Dans le premier volet de cette étude, nous avons évalué l'impact anti-angiogénique in vitro de l'AD4-015, un inhibiteur du transporteur du glucose-6-phosphate (G6PT), sur les CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une inhibition de la migration cellulaire, de la tubulogenèse in vitro et de l'inhibition de la sécrétion et de l'expression génique de la métalloprotéinase matricielle-9 induite par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), un carcinogène promoteur de tumeur. L'expression de la cyclooxygénase-2 (cox-2) était aussi inhibée. L'inhibition pharmacologique de G6PT pourrait être une importante avenue thérapeutique ciblant la néo-vascularisation tumorale. Dans le deuxième volet de notre étude, nous avons investigué les effets du 2-déoxy-D-glucose (2DG), un analogue du glucose ayant comme rôle d'inhiber la glycolyse par la déplétion d'ATP, sur les propriétés angiogéniques des CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une diminution de la tubulogenèse conséquente à une diminution du niveau d'ATP. L'induction de l'expression de cox-2 et de GRP78 a été potentialisée par la combinaison du 2DG avec le PMA. Le niveau de la sécrétion de protéine et de l'expression génique de MMP-9 a été diminué en présence du 2DG, un phénomène impliquant la signalisation par le facteur nucléaire kappa-B. Nous fournissons donc des preuves que l'ATP est nécessaire au processus de la tubulogenèse et nous établissons un lien entre le stress du réticulum endoplasmique et l'inflammation. Dans le troisième volet de notre étude, nous avons investigué les propriétés inhibitrices de plusieurs flavonoïdes et la voie de signalisation du facteur nucléaire kappa-B, qui est une voie commune pour la régulation de l'expression de cox-2 et de MMP-9. Nous avons observé une diminution de l'expression génique et des niveaux de protéines de cox-2 et de MMP-9 par la fisetine, l'apigénine et la lutéoline. Il a également été démontré qu'il y a inhibition des niveaux de phosphorylation d'IkB prouvant leur impact sur l'activité de phosphorylation des IkB kinases. Nos résultats démontrent donc que la perturbation de la barrière hémato-encéphalique pourrait être minimisée par certains flavonoïdes qui agissent comme des inhibiteurs de la voie de signalisation de NF-kB. Collectivement, nos résultats démontrent les effets de différents inhibiteurs sur la tubulogenèse médiée par les CE vasculaires cérébrales. Dans le futur, ceci permettra le ciblage pharmacologique de l'angiogenèse tumorale cérébrale avec l'utilisation de molécules inhibitrices comme l'analogue de la mumbaistatine, le 2DG et certains flavonoïdes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules endothéliales vasculaires cérébrales, angiogenèse, cox-2, MMP-9.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Récemment, l'utilisation de la technique d'assemblage couche par couche de polyélectrolytes naturels a été suggérée comme une nouvelle procédure de modification de surface. Le but de notre travail était de développer des films à base de CHI et de HA fonctionnalisés et réticulés. La biocompatibilité a été évaluée par MEB et visualisation des filaments d'actine. La différenciation endothéliale des CSMs a été suivie par Western Blot. Ensuite, la fonctionnalité des cellules a été évaluée par immunofluorescence du vWF et marquage au Dil-Ac-LDL. Le MEB a montré une morphologie fibroblastique des cellules sur CHI/HA et CHI-SH/HA-Thio. L'analyse par WB des cellules différenciées a montré une augmentation de l'expression de CD31, VEGF-R2 et VE-cadhérine sur CHI-SH/HA-Thio et CHI/HA. Les films CHI-SH/HA-Thio étaient biocompatibles et promouvaient le potentiel de différenciation endothéliale / Recently, the use L-b-L assembly of natural polyelectrolytes has been suggested as a new technique of surface modification. The aim of our work was to develop multilayered films based on CHI and HA polymers bearing chemical. WJ-MSCs were seeded on these substrates. Biocompatibility was assessed by SEM and actin visualization. WJ-MSCs differentiation into endothelial phenotype was followed by western blot. First of all, SEM showed a fibroblastic morphology of adherent cells on CHI/HA and CHI-SH/HA-Thio as for control. WB analysis showed a rise of CD31, VEGF-R2 and VE-cadherin expression on CHI-SH/HA-Thio and CHI/HA. Films CHI-SH/HA-Thio were biocompatible and promoted endothelial differentiation potential

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité dans le monde, et un tiers de ces décès sont causés par la maladie coronaire et la rupture de plaques d'athérome vulnérables. L'altération hétérogène de la microcirculation coronaire est un phénomène précoce lié à de nombreux facteurs de risque cardiovasculaire qui peut fortement présager du développement ultérieur de la maladie coronaire, et conduire à l'apparition d'une hétérogénéité de la perfusion myocardique. La médecine nucléaire permet l'étude de la perfusion myocardique en routine clinique grâce à la réalisation de scintigraphies après injection d'un traceur radioactif du débit sanguin coronaire. L'analyse des images scintigraphiques de la perfusion permet actuellement le dépistage de l'ischémie myocardique, mais la capacité de la technique à mesurer l'hétérogénéité de la perfusion dans des zones apparemment normalement perfusées est inconnue. La première partie de cette thèse porte sur une étude clinique rétrospective visant à déterminer la faisabilité de la quantification de l'hétérogénéité de la perfusion du myocarde mesurée par tomographie d'émission monophotonique (TEMP) au Thallium-201 chez des patients diabétiques par rapport à des sujets sains. L'étude clinique a démontré la capacité du Thallium-201 en imagerie TEMP de routine à quantifier une hétérogénéité de la perfusion du myocarde plus importante chez des patients diabétiques par rapport à des individus normaux. La seconde partie de cette thèse teste l'hypothèse que l'hétérogénéité de la perfusion du myocarde pourrait être quantifiée en imagerie du petit animal TEMP au Thallium-201 et/ou au Technetium-99m-MIBI par une étude expérimentale chez deux modèles animaux de diabète, et serait en corrélation avec des altérations histologiques. L'absence de différence d'hétérogénéité de la perfusion myocardique entre les animaux diabétiques et contrôles suggère que les modèles animaux sont peu adaptés, ou que la technologie actuellement disponible ne semble pas satisfaisante pour obtenir des résultats similaires à l'étude clinique.

L'invasion des matrices de fibrine par les cellules endothéliales est un événement clé dans l'angiogenèse. Dans ce travail, nous avons utilisé un modèle d'angiogenèse in vitro qui consiste en des cellules endothéliales humaines cultivées dans une matrice de fibrine en trois dimensions (3D). Ce modèle reproduit au mieux le microenvironnement cellulaire en 3D in vivo. En parallèle, nous avons testé plusieurs molécules nutraceutiques sur ce modèle cellulaire afin de démontrer leur effet sur la fibrinolyse lors de l'angiogenèse. Nous démontrons que l'habilité des cellules endothéliales à pénétrer dans une matrice de fibrine en 3 dimensions est induite par le VEGF. La fibrinolyse dépendante du VEGF a été complètement contrée par le PAl-1, BB-94, aprotinine et TIMP-2 suggérant l'implication du système activateur de plasminogène/plasmine ainsi que celui des métalloprotéinases. De plus, les anticorps neutralisants anti t-PA ont complètement inhibé la fibrinolyse. Dans l'étude nutraceutique, nous avons prouvé que certaines molécules dérivées de l'alimentation ont un pouvoir antiangiogénique en bloquant la fibrinolyse dans notre modèle cellulaire en agissant principalement sur la sécrétion du t-PA. Ces résultats suggèrent une relation étroite entre le système des MMP et celui des activateurs du plasminogène pour une protéolyse efficace de la matrice de fibrine, et précise l'effet antiangiogénique des polyphénols par leur action sur le t-PA et probablement sur les MMP. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Activateur de type tissulaire du plasminogène, Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire, Dégradation de fibrine, Métalloprotéinases, Polyphénols, Antiangiogénèse.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / L'hypertension artérielle (HTA) associée à l'insuffisance rénale chronique (IRC) est une cause importante de morbidité-mortalité chez les patients dialysés. La physiopathologie de cette HTA est encore imprécise et implique un ensemble de désordres hémodynamiques incluant une expansion volémique et un changement de l'activité du système nerveux autonome et du système rénine-angiotensine. La dysfonction endothéliale constitue un facteur majeur de maintien et de progression de cette HTA. La diminution de la relâche endothéliale du monoxyde d'azote (NO) apparaît comme l'un des déterminants les plus importants de cette dysfonction endothéliale. En plus d'avoir un puissant effet vasodilatateur, le NO inhibe la production d'endothéline-1 (ET-1), module le taux de filtration glomérulaire (GFR) et est impliqué dans le processus de stress oxydatif. Cette étude vise à déterminer l'effet de la surexpression de l'enzyme NO synthase endothéliale (eNOS) sur la progression de l'HTA et de l'IRC chez le rat urémique. Un adénovirus codant pour la eNOS est administré par voie intraveineuse à des rats en urémie induite par néphrectomie sub-totale 5/6. Le transfert du gène est observé uniquement dans l'endothélium des vaisseaux. Après quatre semaines de suivi, le traitement avec l'AdeNOS/GFP a freiné l'élévation de la pression artérielle systolique (PAS), préservé la fonction rénale et prévenu l'apparition des dommages tissulaires rénaux. Ces effets protecteurs sont associés à une augmentation de la concentration circulante et urinaire de nitrites et de nitrates (NO2-/NO3-) indiquant une augmentation de la relâche de NO. Ainsi, la surexpression de la eNOS entraîne une augmentation de la biodisponibilité du NO et atténue le développement de l'HTA chez le rat urémique en plus de ralentir la progression de l'IRC, probablement en prévenant la dysfonction endothéliale.