Il est maintenant admis que l’activité anti-tumorale du TNF implique une destruction de la vascularisation de la tumeur par induction d’apoptose des cellules endothéliales. Si le traitement au TNF en thérapie humaine permet des rémissions complètes, il n’est applicable qu’aux membres isolés de la circulation systémique car les doses requises de TNF sont létales pour le patient. Mettre en évidence les mécanismes qui contrôlent l’apoptose de la cellule endothéliale devrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques favorisant l’effet thérapeutique du TNF tout en évitant le choc septique qu’il engendre. Nous avons abordé cette question en utilisant le modèle de la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) stimulée au TNF afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent le processus apoptotique et ce au cours des phases précoces de celui-ci. D’une part, nous avons identifié par une approche pharmacologique au moins trois voies de contrôle négatif d’induction de mort cellulaire par le TNF dans les cellules endothéliales : la première faisant intervenir une des protéines kinases C, une seconde la PI3-kinase et une troisième la protéine kinase p38. Cette dernière semble spécifiquement activée par le TNF et pourrait donc constituer une nouvelle cible pharmacologique visant à sensibiliser les cellules endothéliales de la vascularisation de la tumeur à l’action apoptotique du TNF. D’autre part nous avons mis en évidence et identifié par une approche protéomique au moins deux protéines montrant une rapide diminution de phosphorylation lorsque les cellules endothéliales sont stimulées par le TNF en présence de cycloheximide. Ces deux événements semblent en aval de l’activation d’une protéase de la famille des caspases. La première protéine est la sous-unité régulatrice de type II alpha (RIIα) de la protéine kinase A. Cependant, la relation entre cette déphosphorylation et le processus d’apoptose n’a pas pu être mise en évidence, une stimulation de l’activité PKA n’affectant pas l’induction d’apoptose des BAEC. La seconde est la protéine HDGF, connue pour être sur-exprimée dans certains cancers, mais dont la régulation par phosphorylation ainsi que son implication éventuelle lors du processus apoptotique n’avaient encore jamais été envisagées. Enfin, nous avons voulu mettre en évidence le rôle potentiel de la protéine hnRNP K qui subit une modification post-traductionnelle précoce lors de l’apoptose des BAEC. Notre étude, menée après surexpression de la protéine étiquetée, suggère une modification autre qu’une dégradation. Cependant, il ne nous a pas été permis de lui attribuer un rôle puisque la surexpression de cette protéine n’affecte pas l’apparition de différents marqueurs associés à l’apoptose.

Depuis les observations du Professeur Trousseau en 1865, le lien entre la progression tumorale et les désordres thrombotiques a été établi. Les patients atteints de cancer sont plus à risque de développer des coagulopathies dues au caractère pro-coagulant des cellules tumorales. Celles-ci induisent une hypercoagulation afin de synthétiser une matrice de fibrine qui servira de support pour la croissance tumorale. Suite à sa stabilisation matricielle, la tumeur sécrète plusieurs agents angiogéniques afin d'induire sa propre vascularisation. La suractivation du système de coagulation contribue alors à la croissance et à l'angiogenèse tumorale et le maillon commun semble être le facteur tissulaire. Cette glycoprotéine transmembranaire est exprimée de manière ubiquitaire dans les tissus subendothéliaux. Son rôle est d'initier la coagulation extrinsèque; lorsque l'intégrité vasculaire est atteinte, le facteur tissulaire est exposé au flux sanguin qui contient son ligand naturel, le facteur VIl. Ces derniers s'associent et le complexe pro-coagulant formé active la thrombine qui convertit le fibrinogène soluble en caillot de fibrine insoluble qui se loge au niveau de la blessure afin de rétablir l'hémostase. Le facteur tissulaire est également impliqué dans la vascularisation embryonnaire car selon certaines études, une délétion totale du gène entraîne une mort in utéro de l'embryon directement causé par un déficit de vascularisation. À l'inverse, sa surexpression entraîne un phénotype pathogénique tel qu'observé chez plusieurs lignées tumorales. Les objectifs de cette étude ont été d'évaluer l'effet de la surexpression du facteur tissulaire sur les propriétés angiogéniques des cellules endothéliales de l'aorte bovine ainsi que de caractériser la capacité du complexe pro-coagulant à induire la migration des cellules épithéliales issues de carcinome rénal humain. Les résultats indiquent que la surexpression endothéliale du facteur tissulaire induit la migration et la formation de structures de type capillaire de manière dépendante et indépendante des mécanismes de l'hémostase. De plus, le complexe pro-coagulant induit la migration des cellules épithéliales métastatiques de carcinome rénal mais non de leur contrepartie non-métastasique qui est caractérisée par une plus haute expression du facteur tissulaire. Finalement, les cellules épithéliales métastatiques et non-métastatiques induisent des différents profils d'activation de la protéine extracellular signal regulated kinase qui régule plusieurs processus cellulaires dont la migration. Ces résultats indiquent alors que le facteur tissulaire est impliqué dans l'angiogenèse et dans la progression tumorale selon des mécanismes qui impliquent ou non l'activité du complexe pro-coagulant. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Facteur tissulaire, Complexe pro-coagulant, Angiogenèse, Cellules endothéliales tumorales, Coagulopathies et cellules épithéliales de carcinome rénal.

Les cellules endothéliales (CE) vasculaires cérébrales jouent un rôle important en tant que composantes structurales et fonctionnelles de la barrière hémato-encéphalique. L'angiogenèse tumorale, un processus important pour la croissance tumorale et pour le processus métastasique, régule le recrutement des CE qui, lorsqu'activées, prolifèrent et se différencient pour générer des structures capillaires afin de livrer les nutriments et l'oxygène au sein du compartiment tumoral. Les recherches rapportées dans ce mémoire nous ont permis de cibler, d'un point de vue pharmacologique, l'angiogenèse tumorale cérébrale. Dans le premier volet de cette étude, nous avons évalué l'impact anti-angiogénique in vitro de l'AD4-015, un inhibiteur du transporteur du glucose-6-phosphate (G6PT), sur les CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une inhibition de la migration cellulaire, de la tubulogenèse in vitro et de l'inhibition de la sécrétion et de l'expression génique de la métalloprotéinase matricielle-9 induite par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), un carcinogène promoteur de tumeur. L'expression de la cyclooxygénase-2 (cox-2) était aussi inhibée. L'inhibition pharmacologique de G6PT pourrait être une importante avenue thérapeutique ciblant la néo-vascularisation tumorale. Dans le deuxième volet de notre étude, nous avons investigué les effets du 2-déoxy-D-glucose (2DG), un analogue du glucose ayant comme rôle d'inhiber la glycolyse par la déplétion d'ATP, sur les propriétés angiogéniques des CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une diminution de la tubulogenèse conséquente à une diminution du niveau d'ATP. L'induction de l'expression de cox-2 et de GRP78 a été potentialisée par la combinaison du 2DG avec le PMA. Le niveau de la sécrétion de protéine et de l'expression génique de MMP-9 a été diminué en présence du 2DG, un phénomène impliquant la signalisation par le facteur nucléaire kappa-B. Nous fournissons donc des preuves que l'ATP est nécessaire au processus de la tubulogenèse et nous établissons un lien entre le stress du réticulum endoplasmique et l'inflammation. Dans le troisième volet de notre étude, nous avons investigué les propriétés inhibitrices de plusieurs flavonoïdes et la voie de signalisation du facteur nucléaire kappa-B, qui est une voie commune pour la régulation de l'expression de cox-2 et de MMP-9. Nous avons observé une diminution de l'expression génique et des niveaux de protéines de cox-2 et de MMP-9 par la fisetine, l'apigénine et la lutéoline. Il a également été démontré qu'il y a inhibition des niveaux de phosphorylation d'IkB prouvant leur impact sur l'activité de phosphorylation des IkB kinases. Nos résultats démontrent donc que la perturbation de la barrière hémato-encéphalique pourrait être minimisée par certains flavonoïdes qui agissent comme des inhibiteurs de la voie de signalisation de NF-kB. Collectivement, nos résultats démontrent les effets de différents inhibiteurs sur la tubulogenèse médiée par les CE vasculaires cérébrales. Dans le futur, ceci permettra le ciblage pharmacologique de l'angiogenèse tumorale cérébrale avec l'utilisation de molécules inhibitrices comme l'analogue de la mumbaistatine, le 2DG et certains flavonoïdes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules endothéliales vasculaires cérébrales, angiogenèse, cox-2, MMP-9.

L'invasion des matrices de fibrine par les cellules endothéliales est un événement clé dans l'angiogenèse. Dans ce travail, nous avons utilisé un modèle d'angiogenèse in vitro qui consiste en des cellules endothéliales humaines cultivées dans une matrice de fibrine en trois dimensions (3D). Ce modèle reproduit au mieux le microenvironnement cellulaire en 3D in vivo. En parallèle, nous avons testé plusieurs molécules nutraceutiques sur ce modèle cellulaire afin de démontrer leur effet sur la fibrinolyse lors de l'angiogenèse. Nous démontrons que l'habilité des cellules endothéliales à pénétrer dans une matrice de fibrine en 3 dimensions est induite par le VEGF. La fibrinolyse dépendante du VEGF a été complètement contrée par le PAl-1, BB-94, aprotinine et TIMP-2 suggérant l'implication du système activateur de plasminogène/plasmine ainsi que celui des métalloprotéinases. De plus, les anticorps neutralisants anti t-PA ont complètement inhibé la fibrinolyse. Dans l'étude nutraceutique, nous avons prouvé que certaines molécules dérivées de l'alimentation ont un pouvoir antiangiogénique en bloquant la fibrinolyse dans notre modèle cellulaire en agissant principalement sur la sécrétion du t-PA. Ces résultats suggèrent une relation étroite entre le système des MMP et celui des activateurs du plasminogène pour une protéolyse efficace de la matrice de fibrine, et précise l'effet antiangiogénique des polyphénols par leur action sur le t-PA et probablement sur les MMP. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Activateur de type tissulaire du plasminogène, Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire, Dégradation de fibrine, Métalloprotéinases, Polyphénols, Antiangiogénèse.

L'endothéline-1 (ET-1), un peptide de 21 acides aminés, est un puissant vasoconstricteur principalement sécrété par les cellules endothéliales (CEs). Dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLVs), plusieurs études ont rapporté que les effets de l'ET-1 sont relayés via l'activation du récepteur ET[indice inférieur A]. Par contre, il a récemment été démontré que, tout comme le récepteur ET[indice inférieur A], le récepteur ET[indice inférieur B] est aussi présent dans les CMLVs humaines et qu'il contribue à l'effet de l'ET-1 dans ce type cellulaire. Dans les cellules endothéliales vasculaires (CEVs), il a été rapporté que le récepteur ET[indice inférieur B] est le seul récepteur et que les actions de l'ET-1, dont l'excitation-sécrétion, sont relayées via l'activation du récepteur ET[indice inférieur B]. Cependant, toutes ces études ont été faites sur des CEVs d'origine animale et sur des CEs de la veine ombilicale humaine qui ne constituent pas un modèle représentatif des CEVs humaines adultes. Dans cette étude, nous avons voulu vérifier l'hypothèse que, non seulement le récepteur de l'ET-1 de type ET[indice inférieur B] est présent dans les CEVAhs, mais aussi le récepteur ET[indice inférieur A] et que l'activation de ces récepteurs par l'ET-1 module le niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur c] et [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur n]. En utilisant l'immunofluorescence indirecte combinée à la microscopie confocale et des études par immunobuvardage western, nous avons démontré la présence de l'ET-1 et du récepteur ET[indice inférieur B], mais aussi, pour la première fois, la présence du récepteur ET[indice inférieur A] dans les CEVAhs. De plus, la distribution de l'ET-1 et de ses récepteurs s'est avérée hétérogène dans les cellules avec une densité de fluorescence beaucoup plus élevée au niveau nucléaire. De plus, la densité du récepteur ET[indice inférieur A] au niveau cytosolique représente environ 25% de sa densité dans la cellule totale alors que celle d'ET[indice inférieur B] n'est que d'environ 5%. Dans la deuxième partie de notre étude, la mesure du calcium intracellulaire total par l'utilisation de la sonde ratiométrique, le Fura-2, combinée à l'imagerie en 2D, nous a permis de démontrer que l'ET-1 induit une augmentation concentration-dépendante du niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur i] total avec un EC[indice inférieur 50] de près de 10[indice supérieur -10] M. Nous avons aussi démontré, avec la sonde calcique Fluo-3 combinée à la microscopie confocale en 3D, que l'ET-1 induit une augmentation calcique intracellulaire aux niveaux cytosolique et nucléaire avec des valeurs de EC[indice inférieur 50] entre 10[indice supérieur -12] M et 10[indice supérieur -11] M. Ceci suggère que l'augmentation du [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur n] est en grande partie responsable de l'augmentation du [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur c]. Finalement, pour démontrer l'implication des récepteurs dans la modulation calcique, nous avons utilisé des antagonistes non peptidiques spécifiques à chacun des récepteurs soit A-192621 et ABT-627 pour les récepteurs ET[indice inférieur B] et ET[indice inférieur A] respectivement. Ces résultats suggèrent que, dans les CEVAhs, l'augmentation du niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur i] total induite par l'ET-1 est relayée via le récepteur ET[indice inférieur A] alors que le récepteur ET[indice inférieur B] pourrait agir comme un frein sur le récepteur ET[indice inférieur A], en d'autres termes, comme un antagoniste physiologique. En conclusion, nos résultats ont démontré que le récepteur ET[indice inférieur A] est bien présent au niveau des cellules endothéliales aortiques humaines et que ce récepteur peut jouer un rôle important dans l'excitation-sécrétion dépendant du calcium intracellulaire.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’hypertension artérielle (HTA) constitue l’une des maladies les plus répandues dans notre société. L’une de ses causes consiste en une rigidité de la paroi artérielle. Cette dernière est régulée par une balance entre agents vasoconstricteurs et vasodilatateurs. L’oxyde nitrique (NO) est un vasodilatateur produit par les cellules endothéliales (CE) en réponse aux stimulations biochimiques (acétylcholine, insuline,…) ou mécanique (cisaillement). Son rôle principal consiste en la relaxation des cellules musculaires lisses (CML) afin d’adapter le vaisseau sanguin aux contraintes qui lui sont imposées. Il s’avère, selon la littérature, que NO est impliqué dans le mode d’action de certains médicaments dirigés contre l’HTA. Celui qui nous intéresse dans cette étude est le Nébivolol. Dans la littérature, il a été rapporté que la production de NO et la structure du cytosquelette d’actine sont intimement liées et que le Nébivolol entraîne la production de NO par les CE. Le but de ce travail a été d’étudier l’implication des filaments d’actine du cytosquelette dans le mode d’action du Nébivolol sur les CE, puis d’évaluer son impact sur l’activité de la eNOS. Nous avons trouvé que le Nébivolol entraîne une augmentation de la production de NO via la dépolymérisation des filaments d’actine pendant la première heure de culture. Cette dépolymérisation résulte en la libération, la translocation péri-nucléaire et la phosphorylation de la eNOS par les Akt. Au-delà d’une heure d’incubation avec le Nébivolol, les monomères d’actine se repolymérisent, entraînant la déphosphorylation de la eNOS et la diminution de la production de NO. Toutefois, il semblerait que la formation des fibres de stress ne soit pas le seul mécanisme d’inhibition de la eNOS. En effet, nous avons montré que la translocation de l’enzyme dans la région péri-membranaire contribue à son inhibition à la suite de la perturbation de l’organisation des filaments d’actine. / Hypertension is one of the most widespread diseases which is caused by a rigidity of the vascular wall. The arteries rigidity is controlled by several vasoconstrictor and vasodilator agents. Nitric oxide (NO) is a vasodilator agent, produced by the endothelial cell (EC) in response to biochemical (acetylcholine, insulin,…) or mechanical (shearing) stimulations. Its main function is to induce smouth muscle cells (SMC) relaxation to adapt the blood vessel to the imposed forces. It has been shown in the literature, that NO is implicated in the target action of some drugs, as Nébivolol, which is directed against hypertension. We know according to the literature that NO production and the structure of the actin cytoskleton are linked and that Nébivolol induces NO production. The aim of this work was to study the implication of cytoskeleton actin filaments in the Nébivolol action in EC and to evaluate the eNOS involvement in the mechanism. We found that Nébivolol increased NO production via a depolymerization of actin filaments during the first hour of incubation. This depolymerization resulted in the peri-nuclear translocation and the phosphorylation of the eNOS by Akt. After the first hour of incubation with Nébivolol, actin monomers were repolymerized leading to the dephosphorylation of the eNOS and the reduction in the NO production. However, it seems that the stress fibers formation is not the only mechanism required for eNOS inhibition. In fact, we have shown that eNOS translocation in the peri-membranar area, inhibited the enzyme activity after actin filaments disruption.

Les microparticules (MPs) sont des fragments de la membrane plasmique libérés suite à une stimulation cellulaire ou apoptotique. Des études récentes ont montré que les MPs peuvent être impliquées dans la modulation de l'angiogenèse, un processus essentiel du système cardio-vasculaire pendant les états physiologiques et pathologiques. De plus, les MPs dérivées des cellules T humaines activées et apoptotiques sont porteuses du morphogène Sonic Hedgehog (Shh), lequel a aussi un rôle dans la formation des vaisseaux. En conséquence, l'objectif de cette étude est d'élucider l'implication des MPs porteuses de Shh (MPsShh+) sur les différentes étapes associées à l'angiogenèse. Dans les cellules endothéliales, les MPsShh+ provoquent la formation des structures capillaires. Également, les MPsShh+ sont capables de moduler la prolifération, l'adhésion et le niveau d'expression des ARNm des facteurs pro-angiogéniques dans les cellules endothéliales. De plus, l'inhibition de l'expression du récepteur de Shh, ou l'utilisation de la cyclopamine, un inhibiteur pharmacologique de Shh, restitue la capacité des MPsShh+ de former des capillaires et aussi diminue l'expression des facteurs pro-angiogéniques. Ensuite, nous avons évalué les effets des MPsShh+ sur la neovascularization post-ischémique en utilisant le modèle in vivo de la ligature de l'artère fémorale chez la souris. Une meilleure récupération du flux sanguin est observée chez les souris traitées avec les MPsShh+ par rapport aux témoins. Dans le muscle squelettique, les MPsShh+ augmentent l'expression de la eNOS et diminuent celle de la caveoline-1. L'inhibition pharmacologique de la voie Shh prévient l'amélioration du flux sanguin et les effets induits sur l'expression de la eNOS. L'ensemble des résultats suggère que les MPsShh+ pourraient être utilisées comme de nouveaux outils thérapeutiques dans certaines pathologies caractérisées par une angiogenèse défaillante et elles pourraient représenter une nouvelle cible dans les pathologies associées à une angiogenèse exagérée, comme le cancer.

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie orpheline, progressive, incurable, caractérisée par un remodelage intense de la paroi des artérioles pulmonaires résistives conduisant à l’augmentation des résistances vasculaires pulmonaires. Des anomalies génétiques associées à des mutations du gène codant pour le récepteur de type 2 de morphogenèse osseuse (BMPR2) ont été mises en évidence chez près de 70% des formes héréditaires d’HTAP. Dans le présent travail et ce à l’aide de cultures cellulaires primaires réalisées à partir de biopsies pulmonaires collectées chez des patients souffrant d’HTAP idiopathique et des sujets contrôles, nous nous sommes intéressés aux mécanismes responsables de l’hyperplasie des cellules musculaires lisses présente dans l’HTAP, plus particulièrement à l’implication de la voie angiopoîétine (Ang)/Tie2 dans la communication intercellulaire existant entre cellules endothéliales (CE) et cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires (CML-AP), ainsi qu’à la voie des BMP/BMPR2 chez des patients HTAP porteurs de mutations BMPR2. Contrairement aux expressions inchangées des Ang1 et Ang2, l’expression du récepteur endothélial Tie2 est augmentée tant au niveau pulmonaire que cellulaire dans l’HTAP. Les CML-AP isolées à partir de patients souffrant d’HTAP présentent in vitro un phénotype prolifératif accru et ce d’autant plus en présence de surnageants de culture collectés à partir de CE pulmonaires (CE-P). Cet effet prolifératif est d’autant plus intense que les CE-P proviennent de patients HTAP et qu’elles ont été préalablement stimulées par l’Ang1. La fluoxétine, un inhibiteur du transporteur de la sérotonine (5-HT) inhibe ces effets prolifératifs, alors que le bosentan, un antagoniste non sélectif des récepteurs A et B à l’endothéline (ET) n’a pas d’effet. De plus, l’activation du récepteur Tie2 induit la synthèse et la libération de 5-HT et d’ET1 par les CE-P isolées à partir de patients souffrant d’HTAP. La voie angiopoïétine/Tie2 joue donc un rôle central dans le dialogue croisé existant entre l’endothélium et le muscle lisse vasculaire pulmonaire et son activation contribue à la prolifération accrue des CML-AP responsable du remodelage vasculaire pulmonaire chez les patients souffrant d’HTAP idiopathique. L’expression du BMPR2 est diminuée tant au niveau pulmonaire, que cellulaire chez les patients souffrant d’HTAP et porteurs de mutations BMPR2. Dans ces CML-AP mutées, le BMP4 ne freine pas la prolifération et n’induit pas l’apoptose, normalement induites dans les cellules isolées à partir de contrôles et de patients souffrant d’HTAP non porteurs de mutations BMPR2. Ces particularités fonctionnelles sont associées à une activation de la voie p38MAPK et un défaut d’activation de la voie Smad. Parmi les 9 mutations BMPR2 étudiées, seule la mutation par délétion de 22 paires de bases dans le domaine transmembranaire ne présente pas ces particularités fonctionnelles. Des anomalies génétiques, telles les mutations BMPR2 concourent donc à une perte du contrôle de la prolifération cellulaire associé à l’activation de la voie p38MAPK, présentant les mutations BMPR2 étudiées, comme des facteurs de risque supplémentaires au développement de l’hyperplasie médiale dans l’HTAP.