Le contrôle de la transparence de la cornée dépend de l'intégrité de l'endothélium cornéen mono-stratifié qui est classiquement considéré dès la naissance, dépourvu de capacité de régénération chez l'homme. Dans des conditions pathologiques conduisant à la cécité par œdème cornéen, les pertes significatives en cellules endothéliales (CE) ne sont pas remplacée efficacement, ce qui signifie que ni de nouvelles CE provenant de cellules souches (CS), ni la division des cellules voisines des lésions ne peuvent contribuer à la régénération endothéliale. Toutefois, plusieurs travaux ont prouvé depuis 25 ans que les CE possédaient une capacité proliférative résiduelle ex vivo et deux équipes ont suggéré l'existence de CS ou de progéniteurs à la périphérie de l'endothélium cornéen. Dans notre travail de thèse, nous avons tout d'abord optimisé, en la systématisant, une technique d'immunomarquage spécialement adaptée à l'endothélium cornéen intact de cornées montées à plat. A l'issue de ces développements, nous disposons de protocoles simples de fixation à température optimale et de démasquages antigéniques susceptibles de permettre la révélation de nombreuses protéines. A partir d'une importante série de cornées humaines non conservées et d'autres conservées en organoculture, et grâce à cet outil désormais efficace, nous avons étudié le cycle cellulaire des CE et la localisation de potentielles CS sur l'endothélium cornéen humaine. Nos résultats démontrent que dans ces conditions, les CE expriment de façon homogène des régulateurs positifs (PCNA, MCM2, cycline D1, cycline E et cycline A) et des régulateurs négatifs du cycle cellulaire (P16, P27); certaines particularités ont par ailleurs pu être décrites de façon innovante, comme la localisation cytoplasmique diffuse de MCM2, paranucléaire de la cycline D1, l'absence de P21. L'ensemble des marquages pourrait suggérer que les CE sont arrêtées en fin de G1, après le point de restriction et que de nombreux mécanismes de réparation de l'ADN sont mis en jeux dans les CE exposées à un stress oxydant important tout au long de l'existence. Nous avons identifié une nouvelle organisation de la micro-anatomie de la périphérie et de l'extrême périphérie de l'endothélium où des cellules regroupées en multiples clusters pluristratifiés semblent alimenter des colonnes de CE radiaires longues d'un millimètre. Ces éléments, associés à l'observation d'une moindre différenciation et d'une compétence proliférative plus élevés en périphérie suggèrent un nouveau modèle d'homéostasie endothéliale humaine in vivo: toute la vie, des CS périphériques alimentent de façon très lente la périphérie cornéenne en CE qui migrent de façon centripète pour assurer la stabilité du centre cornéen dont les propriétés optiques primordiales sont sous-tendues par un endothélium qui ne perd que 0,6% de CE par an. A la différence de l'épithélium cornéen, ce système ne peut être accéléré lors de circonstances pathologiques. Les perspectives de nos travaux sont désormais d'essayer d'isoler de l'extrême périphérie les CS endothéliales ou les progéniteurs et de les cultiver en recréant un microenvironnement favorable. La possibilité de produire un grand nombre de CE in vitre non pas à partir de CE sénescentes prélevées sur la totalité de l'endothélium comme cela a été tenté par la passé, mais cette fois à partir de CS ou des progéniteurs ouvriraient la voie d'une véritable thérapie cellulaire endothéliale. L'enrichissement des greffons pendant la durée de leur conservation à la banque de cornée pourrait constituer une première étape majeure avant d'envisager créer de novo un endothélium sur un support greffable pour une greffe endothéliale du 3e type qui deviendrait ainsi enfin indépendante des aléas de la découpe du greffon. Enfin, l'ïdentification de la CS endothéliale et de son microenvironnement permettra aussi d'envisager une thérapie cellulaire in vivo pour traiter les stades précoces des pathologies endothéliales cornéennes

L’apoptose endothéliale initie le processus menant au remodelage vasculaire et au développement de la néointima dans la vasculopathie du greffon. La formation de néointima résulte de l’accumulation de leucocytes, de matrice extracellulaire et de cellules positives pour l’actine musculaire lisse alpha (αSMA+) dans l’intima des artères, artérioles et capillaires du greffon. Les cellules αSMA+ dans la néointima sont des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) dérivées du donneur ainsi que des cellules souches dérivées du receveur, dont des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’acquisition d’un phénotype anti-apoptotique chez ces cellules est déterminante pour le développement de la néointima. Le laboratoire de Dre Hébert a démontré que les cellules endothéliales (CE) apoptotiques libèrent des médiateurs induisant une résistance à l’apoptose chez les CMLV et les fibroblastes. Notamment, les CE apoptotiques relâchent la cathepsine L qui clive le perlécan et ainsi libère un fragment C-terminal correspondant au troisième motif laminine G du domaine V du perlécan (LG3). Le LG3 est anti-apoptotique pour les fibroblastes. Nous avons donc émis l’hypothèse que le LG3 est un des médiateurs clés libéré par les CE apoptotiques favorisant le développement de la néointima via l’induction d’un phénotype anti-apoptotique chez les cellules néointimales αSMA+. Nous avons démontré que les médiateurs libérés par les CE apoptotiques induisent un phénotype anti-apoptotique chez les CSM dépendant de l’activation de la voie ERK1/2. De plus, le LG3 active la voie ERK1/2 via son interaction avec les intégrines beta 1 et induit une réponse anti-apoptotique chez ces cellules. Cependant l’activation de ERK1/2 par le LG3 est plus faible en comparaison de son activation par le milieu conditionné par des CE apoptotiques. Nos résultats suggèrent que les CE apoptotiques libèrent aussi de l’EGF qui agit de façon paracrine sur les CSM en coopération avec le LG3 pour induire un phénotype anti-apoptotique chez les CSM. Nous avons poursuivi l’étude de l’effet du LG3 in vivo sur le remodelage vasculaire en transplantation. Nous avons pour cela développé un modèle murin de rejet vasculaire qui consiste en une transplantation aortique entre des souris alloincompatibles. Nous avons ensuite injecté du LG3 chez les souris receveuses en post-transplantation. Nous avons observé dans ce modèle que des niveaux augmentés de LG3 sérique augmentent la formation de néointima, favorisent l’accumulation de cellules néointimales αSMA+ et diminuent le nombre de cellules CD31+ au niveau du greffon aortique. Parallèlement nous avons vérifié que le LG3 induit aussi un phénotype anti-apoptotique chez les CMLV et nous avons démontré un nouvel effet du LG3, soit une activité pro-migratoire, qui dépend de l’activation de la voie ERK1/2 chez les CMLV. Nous avons complété cette étude par l’analyse des niveaux de LG3 sérique dans une cohorte de patients receveurs d’allogreffe rénale. Nous avons observé chez ces patients, une association entre des niveaux élevés de LG3 sérique et un rejet vasculaire. Le LG3 contribue à la formation de néointima par son activité pro-migratoire et pro-survie chez les cellules néointimales et aussi de par son activité angiostatique. Nos résultats suggèrent que le LG3 est un nouveau médiateur important dans le remodelage vasculaire en transplantation / In allogeneic transplanted organs, endothelial apoptosis is associated with vascular remodeling and neointima formation which in turn leads to allograft vasculopathy, a maladaptive form of vascular repair. In allograft vasculopathy, neointima results from the accumulation of leukocytes, extracellular matrix and alpha-smooth muscle actin positive (αSMA+) cells in the intima of allogeneic arteries, arterioles and capillaries. Neointimal αSMA+ cells comprise vascular smooth muscle cells (VSMC) derived from the donor and stem cells derived from the recipient, including mesenchymal stem cells (MSC). Acquisition of an anti-apoptotic phenotype of neointimal cells is central to the development of vascular obliterative changes. Dr Hébert’s team demonstrated that apoptotic endothelial cells release mediators which in turn induce a state of resistance to apoptosis of VMSC and fibroblasts. Apoptotic endothelial cells release cathepsin-L which cleaves perlecan therefore releasing a C-terminal fragment harbouring a laminin G motif and referred to as LG3. LG3 is anti-apoptotic for fibroblasts. We hypothesized that LG3 is a key mediator produced by endothelial apoptosis of importance in favoring neointima formation via the induction of an anti-apoptotic phenotype in αSMA+ neointimal cells We demonstrated that mediators released by endothelial apoptosis induce an ERK1/2-dependent anti-apoptotic phenotype in MSC. We identified LG3 as one of the mediators implicated in the induction of this anti-apoptotic response. Interactions between LG3 and beta 1 integrins expressed on MSC trigger ERK1/2 activation albeit to a lesser degree than medium conditioned by apoptotic endothelial cells. We showed that apoptotic endothelial cells also release EGF which cooperates with LG3 to induce an anti-apoptotic phenotype on MSC through cross-talk between EGF receptor and integrin-dependent pathways. Next, we characterized the impact of LG3 on allogeneic vascular remodeling in vivo. We developed a murine model of vascular rejection based on orthotopic transplantation of an aortic segment between two fully MHC-incompatible mice in absence of immunosuppression. Recombinant LG3 was injected intravenously post-transplantation in recipients resulting in higher circulating levels of LG3. In LG3-injected mice, accumulation of αSMA+ neointimal cells was enhanced resulting in significantly increased intima/media ratios in the allogeneic aortic graft. Aortic grafts of LG3-injected allografts also showed decreased CD31+ cells. We also demonstrated, using cell-based approaches, that LG3 exerts a pro-migratory activity on VSMC through beta 1-integrin and ERK1/2 -dependent pathways. In line with these observations we also reported augmented serum LG3 in human renal transplant patients in association with acute vascular rejection episodes. Collectively these results suggest that the pro-migratory, pro-survival and angiostatic activities of LG3 contribute to neointima formation. Our results suggest that LG3 is a novel mediator of importance in the development of obliterative vascular remodeling associated with rejection of allogeneic organs.

L’apoptose endothéliale initie le processus menant au remodelage vasculaire et au développement de la néointima dans la vasculopathie du greffon. La formation de néointima résulte de l’accumulation de leucocytes, de matrice extracellulaire et de cellules positives pour l’actine musculaire lisse alpha (αSMA+) dans l’intima des artères, artérioles et capillaires du greffon. Les cellules αSMA+ dans la néointima sont des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) dérivées du donneur ainsi que des cellules souches dérivées du receveur, dont des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’acquisition d’un phénotype anti-apoptotique chez ces cellules est déterminante pour le développement de la néointima. Le laboratoire de Dre Hébert a démontré que les cellules endothéliales (CE) apoptotiques libèrent des médiateurs induisant une résistance à l’apoptose chez les CMLV et les fibroblastes. Notamment, les CE apoptotiques relâchent la cathepsine L qui clive le perlécan et ainsi libère un fragment C-terminal correspondant au troisième motif laminine G du domaine V du perlécan (LG3). Le LG3 est anti-apoptotique pour les fibroblastes. Nous avons donc émis l’hypothèse que le LG3 est un des médiateurs clés libéré par les CE apoptotiques favorisant le développement de la néointima via l’induction d’un phénotype anti-apoptotique chez les cellules néointimales αSMA+. Nous avons démontré que les médiateurs libérés par les CE apoptotiques induisent un phénotype anti-apoptotique chez les CSM dépendant de l’activation de la voie ERK1/2. De plus, le LG3 active la voie ERK1/2 via son interaction avec les intégrines beta 1 et induit une réponse anti-apoptotique chez ces cellules. Cependant l’activation de ERK1/2 par le LG3 est plus faible en comparaison de son activation par le milieu conditionné par des CE apoptotiques. Nos résultats suggèrent que les CE apoptotiques libèrent aussi de l’EGF qui agit de façon paracrine sur les CSM en coopération avec le LG3 pour induire un phénotype anti-apoptotique chez les CSM. Nous avons poursuivi l’étude de l’effet du LG3 in vivo sur le remodelage vasculaire en transplantation. Nous avons pour cela développé un modèle murin de rejet vasculaire qui consiste en une transplantation aortique entre des souris alloincompatibles. Nous avons ensuite injecté du LG3 chez les souris receveuses en post-transplantation. Nous avons observé dans ce modèle que des niveaux augmentés de LG3 sérique augmentent la formation de néointima, favorisent l’accumulation de cellules néointimales αSMA+ et diminuent le nombre de cellules CD31+ au niveau du greffon aortique. Parallèlement nous avons vérifié que le LG3 induit aussi un phénotype anti-apoptotique chez les CMLV et nous avons démontré un nouvel effet du LG3, soit une activité pro-migratoire, qui dépend de l’activation de la voie ERK1/2 chez les CMLV. Nous avons complété cette étude par l’analyse des niveaux de LG3 sérique dans une cohorte de patients receveurs d’allogreffe rénale. Nous avons observé chez ces patients, une association entre des niveaux élevés de LG3 sérique et un rejet vasculaire. Le LG3 contribue à la formation de néointima par son activité pro-migratoire et pro-survie chez les cellules néointimales et aussi de par son activité angiostatique. Nos résultats suggèrent que le LG3 est un nouveau médiateur important dans le remodelage vasculaire en transplantation / In allogeneic transplanted organs, endothelial apoptosis is associated with vascular remodeling and neointima formation which in turn leads to allograft vasculopathy, a maladaptive form of vascular repair. In allograft vasculopathy, neointima results from the accumulation of leukocytes, extracellular matrix and alpha-smooth muscle actin positive (αSMA+) cells in the intima of allogeneic arteries, arterioles and capillaries. Neointimal αSMA+ cells comprise vascular smooth muscle cells (VSMC) derived from the donor and stem cells derived from the recipient, including mesenchymal stem cells (MSC). Acquisition of an anti-apoptotic phenotype of neointimal cells is central to the development of vascular obliterative changes. Dr Hébert’s team demonstrated that apoptotic endothelial cells release mediators which in turn induce a state of resistance to apoptosis of VMSC and fibroblasts. Apoptotic endothelial cells release cathepsin-L which cleaves perlecan therefore releasing a C-terminal fragment harbouring a laminin G motif and referred to as LG3. LG3 is anti-apoptotic for fibroblasts. We hypothesized that LG3 is a key mediator produced by endothelial apoptosis of importance in favoring neointima formation via the induction of an anti-apoptotic phenotype in αSMA+ neointimal cells We demonstrated that mediators released by endothelial apoptosis induce an ERK1/2-dependent anti-apoptotic phenotype in MSC. We identified LG3 as one of the mediators implicated in the induction of this anti-apoptotic response. Interactions between LG3 and beta 1 integrins expressed on MSC trigger ERK1/2 activation albeit to a lesser degree than medium conditioned by apoptotic endothelial cells. We showed that apoptotic endothelial cells also release EGF which cooperates with LG3 to induce an anti-apoptotic phenotype on MSC through cross-talk between EGF receptor and integrin-dependent pathways. Next, we characterized the impact of LG3 on allogeneic vascular remodeling in vivo. We developed a murine model of vascular rejection based on orthotopic transplantation of an aortic segment between two fully MHC-incompatible mice in absence of immunosuppression. Recombinant LG3 was injected intravenously post-transplantation in recipients resulting in higher circulating levels of LG3. In LG3-injected mice, accumulation of αSMA+ neointimal cells was enhanced resulting in significantly increased intima/media ratios in the allogeneic aortic graft. Aortic grafts of LG3-injected allografts also showed decreased CD31+ cells. We also demonstrated, using cell-based approaches, that LG3 exerts a pro-migratory activity on VSMC through beta 1-integrin and ERK1/2 -dependent pathways. In line with these observations we also reported augmented serum LG3 in human renal transplant patients in association with acute vascular rejection episodes. Collectively these results suggest that the pro-migratory, pro-survival and angiostatic activities of LG3 contribute to neointima formation. Our results suggest that LG3 is a novel mediator of importance in the development of obliterative vascular remodeling associated with rejection of allogeneic organs.

Il est maintenant admis que l’activité anti-tumorale du TNF implique une destruction de la vascularisation de la tumeur par induction d’apoptose des cellules endothéliales. Si le traitement au TNF en thérapie humaine permet des rémissions complètes, il n’est applicable qu’aux membres isolés de la circulation systémique car les doses requises de TNF sont létales pour le patient. Mettre en évidence les mécanismes qui contrôlent l’apoptose de la cellule endothéliale devrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques favorisant l’effet thérapeutique du TNF tout en évitant le choc septique qu’il engendre.<p><p>Nous avons abordé cette question en utilisant le modèle de la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) stimulée au TNF afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent le processus apoptotique et ce au cours des phases précoces de celui-ci.<p><p>D’une part, nous avons identifié par une approche pharmacologique au moins trois voies de contrôle négatif d’induction de mort cellulaire par le TNF dans les cellules endothéliales :la première faisant intervenir une des protéines kinases C, une seconde la PI3-kinase et une troisième la protéine kinase p38. Cette dernière semble spécifiquement activée par le TNF et pourrait donc constituer une nouvelle cible pharmacologique visant à sensibiliser les cellules endothéliales de la vascularisation de la tumeur à l’action apoptotique du TNF. <p>D’autre part nous avons mis en évidence et identifié par une approche protéomique au moins deux protéines montrant une rapide diminution de phosphorylation lorsque les cellules endothéliales sont stimulées par le TNF en présence de cycloheximide. Ces deux événements semblent en aval de l’activation d’une protéase de la famille des caspases. La première protéine est la sous-unité régulatrice de type II alpha (RIIα) de la protéine kinase A. Cependant, la relation entre cette déphosphorylation et le processus d’apoptose n’a pas pu être mise en évidence, une stimulation de l’activité PKA n’affectant pas l’induction d’apoptose des BAEC. La seconde est la protéine HDGF, connue pour être sur-exprimée dans certains cancers, mais dont la régulation par phosphorylation ainsi que son implication éventuelle lors du processus apoptotique n’avaient encore jamais été envisagées.<p><p>Enfin, nous avons voulu mettre en évidence le rôle potentiel de la protéine hnRNP K qui subit une modification post-traductionnelle précoce lors de l’apoptose des BAEC. Notre étude, menée après surexpression de la protéine étiquetée, suggère une modification autre qu’une dégradation. Cependant, il ne nous a pas été permis de lui attribuer un rôle puisque la surexpression de cette protéine n’affecte pas l’apparition de différents marqueurs associés à l’apoptose. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

LYL1 (Lymphoblastic leukemia-derived sequence 1) est un facteur de transcription basic hélice-boucle-hélice (bHLH) exprimé dans les lymphocytes B, les cellules myéloïdes et les cellules endothéliales (CE). Les souris déficientes pour Lyl1 (Lyl1-/-) sont viables et chez la souris adulte, LYL1 a un rôle majeur dans la maturation des vaisseaux sanguins nouvellement formés et dans le contrôle de la perméabilité vasculaire basale, suggérant l'importance de LYL1 dans le maintien de la quiescence et/ou stabilisation des CE. Les vaisseaux sanguins représentent une barrière entre le sang et le tissu conjonctif. Ils peuvent également jouer le rôle de niche vasculaire contenant des progéniteurs des différentes cellules murines (par exemple, des cellules hématopoïétiques, des cellules β-pancréatiques, des cellules neuronales, des cellules hépatiques et des cellules adipeuses). Les deux tissus adipeux, blancs et bruns (WAT et BAT), sont très vascularisés. Jusqu'à présent, rien n'était connu sur le rôle de LYL1 dans le tissu adipeux. Les résultats présentés dans cette thèse montrent que l'augmentation significative du poids corporel des mâles Lyl1-/- par rapport aux souris sauvages (WT), sous régime normal, n'est pas associée à des troubles métaboliques. Ils présentent également un poids plus élevé de tissus adipeux (WAT et BAT) et de plus grandes gouttelettes lipidiques. In vivo, la perte de Lyl1 accélère le processus de différenciation des cellules souches adipeuses (CSA), puisque les adipocytes blancs et bruns sont matures et actifs plus tôt. De plus, les CSA sont moins nombreuses dans les tissus adipeux, ce qui confirme que la perte de Lyl1 favorise la différenciation des CSA vers adipocytes matures. Nous avons également démontré que Lyl1 est exprimée dans les CSA et les pré-adipocytes, suggérant un rôle direct dans LYL1 dans la différenciation adipocytaire. D'autre part, les vaisseaux des WAT des souris Lyl1-/- sont mal recouverts de cellules murales et plus perméables, suggérant que la niche vasculaire des tissus adipeux pourrait être perturbée. Sous alimentation riche en graisses (HFD), le poids corporel et le poids du tissu adipeux sont plus faibles chez les souris Lyl1-/- par rapport à WT. De plus les souris Lyl1-/- présentent de plus petites gouttelettes lipidiques que les WT, sous HFD. Ces résultats préliminaires, suggèrent que les souris Lyl1-/- pourraient être protégées contre l'obésité induite par l'alimentation. Cependant d'autres expériences sont nécessaires pour valider ces résultats. Il existe probablement un mécanisme de compensation qui se met en place chez les souris Lyl1-/- sous HFD. Ce travail a démontré que, sans Lyl1, la différenciation adipocytaire est accélérée et que la niche vasculaire adipocytaire est perturbée. / LYL1 (Lymphoblastic leukemia-derived sequence 1) is a basic helix-loop-helix (bHLH) transcriptional factor, which is expressed in B lymphocytes, myeloid cells and endothelial cells (EC). Lyl1 deficient (Lyl1-/-) mice are viable and in adult mice, LYL1 has an active role in the maturation of newly formed blood vessels and is also involved in the control of basal vascular permeability, suggesting that LYL1 is required for the maintenance of EC quiescence and stabilization. Blood vessels provide a barrier between connective tissue and blood. They also have been described as “vascular niche” containing progenitors of different murine cells (e.g. hematopoietic cells, pancreatic β-cells, neuronal cells, liver cells and adipose cells). Both white and brown adipose tissues (WAT and BAT) are highly vascularized. Up to now, nothing was known concerning the role of LYL1 in adipose tissue. The results presented in this thesis revealed that the significant increase in body weight of Lyl1-/- males compared to their wild type (WT) littermates under chow diet is not due to any metabolic disorders. They also showed higher adipose tissue weights (BAT and WAT) and bigger lipid droplets. In vivo Lyl1 deficiency cause early differentiation process of adipose stem cells (ASCs) since both white and brown adipocytes are mature and active faster. In addition, ASCs are less numerous in Lyl1-/- adipose tissues, which confirm that Lyl1 deficiency favors the differentiation of ASCs towards mature adipocytes. We also demonstrated that Lyl1 is expressed both in ASCs and pre-adipocytes, suggesting a direct role of LYL1 in adipocyte differentiation. On the other hand, the vessels in Lyl1-/- WAT are poorly covered with mural cells and more permeable, proposing that adipose stem cell vascular niche could be disturbed. Under high fat diet (HFD), total body weight and adipose tissue weight are lower in Lyl1-/- mice compared to WT. Moreover smaller lipid droplets were observed in Lyl1-/- mice under HFD. These preliminary results suggest that Lyl1-/- mice could be protected from diet-induced obesity. However more experiments are needed to validate these results. Probably there is a compensatory type of mechanism going on under HFD in Lyl1-/- mice. This work demonstrated that under Lyl1 deficiency adipocyte differentiation process becomes faster and adipose tissue vascular niche could be disturbed.

L’obstruction des vaisseaux est responsable d’ischémie tissulaire dans différents territoires périphériques, cardiaques et cérébraux. Un des mécanismes d’adaptation du tissu à l’ischémie est la formation de néo-vaisseaux. Plusieurs données récentes mettent en évidence un rôle de la voie de signalisation Wnt/Frizzled (Fzd) dans le développement vasculaire. Le travail de cette thèse s’est focalisé sur l’étude du récepteur Frizzled7 (Fzd7) et de son rôle dans la formation des vaisseaux. Le modèle des corps embryoïdes, un modèle de différenciation des cellules souches embryonnaires vers le phénotype endothélial, nous a permis de démontrer que Fzd7 était exprimé au cours des différentes étapes de différenciation endothéliale. Des études sur des cellules endothéliales matures nous ont permis de montrer que Fzd7 régulait différentes propriétés des cellules endothéliales dont la migration et la formation de tubes endothéliaux, mais pas la prolifération. De plus, Fzd7 participe à la stabilité des jonctions cellulaires en interagissant avec la VE-cadhérine. Concernant les mécanismes moléculaires mis en jeu par Fzd7, nous avons pu montrer que celui-ci était capable d’activer la voie Wnt/PCP via la phosphorylation de la protéine JNK. Enfin, une étude in vivo dans le modèle du poisson Zèbre, nous a permis de mettre en évidence un rôle de Fzd7 dans la formation des vaisseaux intersomitiques. La deuxième partie de ce travail concerne le rôle de la voie Wnt/Fzd dans les propriétés angiogèniques des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’objectif de cette étude était de définir comment les CSM participaient à la formation des vaisseaux et si le système Wnt/Frizzled était nécessaire. Nous avons pu montrer que sFRP1, un modulateur de la voie Wnt, améliore la fonction cellulaire des CSM et contribue à la maturation des néo-vaisseaux. De plus, nous avons pu montrer que les CSM implantées dans un modèle d’ischémie du membre inférieur amélioraient la réponse angiogénique lorsque celles-ci étaient préconditionnées en hypoxie. Nous avons mis en évidence le rôle de Wnt4 dans ce processus. / The obstruction of the vessels is responsible for ischemia in various outlying areas, heart and brain. One of the mechanisms of tissue adaptation to ischemia is the formation of neo-vessels. Several recent data show a role of Wnt/Frizzled (Fzd) pathway in vascular development.The work of this thesis focused on the study of receptor Frizzled7 (Fzd7) and its role in vessel formation. Using the model of embryoid bodies, a model of embryonic stem cell differentiation toward the endothelial lineage, we demonstrated that Fzd7 was expressed during different stages of endothelial cell differentiation. Studies on mature endothelial cells have shown that Fzd7 regulates endothelial cells properties including migration and endothelial tube formation but not proliferation. In addition, Fzd7 participates in the stability of cell junctions by interacting with VE-cadherin. Regarding the molecular mechanisms involved in Fzd7 signalling, we could show that this receptor was capable of activating the Wnt/PCP pathway via phosphorylation of JNK protein. Finally, an in vivo study in zebrafish model, allowed us to highlight a role of Fzd7 in intersomitic vessel formation.The second part of this work concerns the role of the Wnt/Fzd pathway in the angiogenic properties of mesenchymal stem cells (MSC). The objective of this study was to determine how CSM participated in vessel formation and if the Wnt/Frizzled pathway was necessary. We show that sFRP1, a modulator of the Wnt pathway, improves cellular function of MSCs and contributes to the maturation of neo-vessels. In addition, we have shown that MSCs implanted in a model of lower limb ischemia improved the angiogenic response when they were preconditioned by hypoxia. We have highlighted the role of Wnt4 in this process.

L’apoptose des cellules endothéliales (CE) représente un évènement initial dans le développement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique d’allogreffe et la sclérose systémique. Nous avons démontré que les médiateurs issus des CE apoptotiques entraîne la différenciation myofibroblastique et la résistance à l’apoptose, deux mécanismes centraux à la fibrogénèse. L’activation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractérise ces deux mécanismes. Un fragment C-terminal du perlécan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe l’apoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail étaient de : 1. définir les récepteurs et la signalisation impliqués dans la réponse anti-apoptotique et 2. caractériser les médiateurs fibrogéniques responsables de la différenciation myofibroblastique. En ce qui a trait à la réponse anti-apoptotique, l’inhibition des intégrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prévient la résistance à l’apoptose et la phosphorylation d’Akt normalement induites par le milieu conditionné par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces résultats suggèrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un état de résistance à l’apoptose chez les fibroblastes par des voies α2β1integrines/SFK/PI3K dépendantes. Le LG3 n’induit cependant pas la différenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractérisé le milieu SSC de façon à identifier les médiateurs responsables de la différenciation myofibroblastique. Les milieux conditionnés par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont été analysés comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectrométrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrogénique connu augmenté dans le milieu SSC. L’inhibition de la caspase-3 chez les CE prévient la relâche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, l’inhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prévient la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. L’anticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) n’est pas en mesure de bloquer la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanées de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entraîne une augmentation de l’épaisseur de la peau et des niveaux protéiques d’SMA, de vimentine et de collagène I. Cette réponse fibrogénique est réduite chez les souris qui ont reçu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodéplété de son CTGF. Ces résultats apportent de nouvelles issues mécanistiques au niveau de la réponse fibrogénique activée par la mort des CE. L’activation des caspases chez les CE apoptotiques entraîne la production de LG3 et de CTGF qui, à leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dépendantes chez les fibroblastes, et ce indépendamment du TGF-. / Apoptosis of endothelial cells (EC) is an early event in various fibrotic diseases including chronic allograft vasculopathy and systemic sclerosis. We showed previously that mediators released by apoptotic EC activate myofibroblast differentiation and resistance to apoptosis, two mechanisms pivotal to fibrogenesis. PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) activation was found to be central to these two mechanisms. A C-terminal fragment of perlecan (LG3) produced by apoptotic EC was found to inhibit apoptosis of fibroblasts. The aims of the present project were : 1. to define the receptors and pathways implicated in this anti-apoptotic response and 2. to characterize the fibrogenic mediators implicated in myofibroblast differentiation. Concerning the anti-apoptotic response, the inhibition of 21 integrin activity in fibroblasts exposed to either medium conditioned by apoptotic EC (SSC) or LG3 prevented resistance to apoptosis and was associated with decreased levels of Akt phosphorylation. Neutralizing Src family kinases (SFK) activity in fibroblasts produced the same effects. These results suggest that LG3 produced by apoptotic EC initiate a state of resistance to apoptosis in fibroblasts via an α2β1integrin/SFK/PI3K dependent pathway. LG3 did not induce myofibroblast differentiation. We went on to identify which mediators present in SSC are implicated in myofibroblast differentiation. Media conditioned by apoptotic and non-apoptotic EC (respectively SSC and SSC-ZVAD) were analyzed comparatively by 2-dimension liquid chromatography, western blotting and mass spectrometry. Connective tissue growth factor (CTGF) was the only known fibrogenic factor increased in SSC. Caspase-3 silencing of EC demonstrated that CTGF is released by apoptotic EC downstream of caspase-3 activation. In fibroblasts, blocking the activation of SFK or silencing the proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) blocked myofibroblast differentiation triggered by either SSC or recombinant CTGF in vitro. Exposure to a pan-transforming growth factor (TGF-β) neutralizing antibody failed to attenuate myofibroblast differentiation in fibroblasts exposed to either SSC or CTGF. Subcutaneous injection of mouse SSC to C3H mice daily for three weeks led to increased skin thickness, increased protein levels of αSMA, vimentin and collagen I. This fibrogenic response was blunted in mice injected with either SSC-ZVAD or SSC immunodepleted of CTGF. These results bring new mechanistic insights into the fibrogenic pathways activated by EC death. Caspase activation in apoptotic EC triggers the production of LG3 and CTGF which in turn activate SFK/PI3K dependant pathways in fibroblasts thus activating a TGF-β-independent fibrogenic response.

Les cellules endothéliales forment une couche semi-perméable entre le sang et les organes. La prolifération, la migration et la polarisation des cellules endothéliales sont essentielles à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, soit l’angiogenèse. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) peut activer la synthase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS) et induire la production de monoxyde d’azote (NO) nécessaire pour la régulation de la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse. β- caténine est une composante essentielle du complexe des jonctions d’ancrage ainsi qu’un régulateur majeur de la voie de signalisation de Wnt/β-caténine dans laquelle elle se joint au facteur de transcription TCF/LEF et module l’expression de nombreux gènes, dont certains sont impliqués dans l’angiogenèse. La S-nitrosylation (SNO) est un mécanisme de régulation posttraductionnel des protéines par l’ajout d’un groupement nitroso au niveau de résidus cystéines. Le NO produit par eNOS peut induire la S-nitrosylation de la β−caténine au niveau des jonctions intercellulaires et moduler la perméabilité de l’endothélium. Il a d’ailleurs été montré que le NO peut contrôler l’expression génique par la transcription. Le but de cette thèse est d’établir le rôle du NO au sein de la transcription des cellules endothéliales, spécifiquement au niveau de l’activité de β-caténine. Le premier objectif était de déterminer si la SNO de la β-caténine affecte son activité transcriptionnelle. Nous avons montré que le NO inhibe l’activité transcriptionnelle de β- caténine ainsi que la prolifération des cellules endothéliales induites par l’activation de la voie Wnt/β-caténine. Il est intéressant de constater que le VEGF, qui induit la production de NO via eNOS, réprime l’expression de AXIN2 qui est un gène cible de Wnt s’exprimant suite à la i i stimulation par Wnt3a et ce, dépendamment de eNOS. Nous avons identifié que la cystéine 466 de la β-caténine est un résidu essentiel à la modulation répressive de son activité transcriptionnelle par le NO. Lorsqu’il est nitrosylé, ce résidu est responsable de la perturbation du complexe de transcription formé de β-caténine et TCF-4 ce qui inhibe la prolifération des cellules endothéliales induite par la stimulation par Wnt3a. Puisque le NO affecte la transcription, nous avons réalisé l’analyse du transcriptome afin d’obtenir une vue d’ensemble du rôle du NO dans l’activité transcriptionnelle des cellules endothéliales. L’analyse différentielle de l’expression des gènes de cellules endothéliales montre que la répression de eNOS par siRNA augmente l’expression de gènes impliqués au niveau de la polarisation tels que : PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 et TJ3. Cette analyse suggère que le NO peut réguler la polarisation des cellules et a permis d’identifier des gènes responsables de l’intégrité des cellules endothéliales et de la réponse immunitaire. De plus, l’analyse de voies de signalisation par KEGG montre que certains gènes modulés par l’ablation de eNOS sont enrichis dans de nombreuses voies de signalisation, notamment Ras et Notch qui sont importantes lors de la migration cellulaire et la différenciation des cellules de têtes et de tronc (tip/stalk). Le regroupement des gènes exprimés chez les cellules traitées au VEGF (déplétées de eNOS ou non) révèle que le NO peut affecter l’expression de gènes contribuant au processus angiogénique, dont l’attraction chimiotactique. Notre étude montre que le NO module la transcription des cellules endothéliales et régule l’expression des gènes impliqués dans l’angiogenèse et la fonction endothéliale. / induce the production of nitric oxide (NO), which is critical for vascular permeability and angiogenesis. β-catenin is an essential component of the adherens junction as well as Wnt/β-catenin signaling pathway and it binds T-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor, regulating expression of numerous genes including those involved in angiogenesis. S-nitrosylation (SNO) is a mechanism used by NO to regulate protein activity by adding a nitroso group to cysteine residues. eNOS derived-NO is capable to induce SNO of β-catenin at cell-cell junction and modulate endothelial permeability. Additionally, NO has been implicated in the transcriptional control of gene expression. Therefore, the goals of our studies were to investigate the regulatory roles of NO on transcription in endothelial cells, in particular to the modulation of the transcriptional activity of β-catenin. The objective of the first study is to investigate whether the SNO of β-catenin affect its transcriptional activity. We found that NO inhibits β-catenin transcriptional activity and endothelial cell proliferation induced by activation of Wnt/β-catenin signaling. Interestingly, VEGF, which can activate eNOS to produce NO in endothelial cells, repressed Wnt3a-induced expression of Wnt target gene AXIN2 in an eNOS-dependent manner. Moreover, we identified that Cys466 on β-catenin is a critical residue for the repressive effects of NO on β-catenin transcriptional activity. Furthermore, we showed that Cys466 is responsible for the disruption iv of β-catenin/TCF4 transcriptional complex, and NO-dependant inhibition of Wnt3a-simulated endothelial cell proliferation. Given the known effects of NO on transcription, whole transcriptome sequencing was performed in order to understand the transcriptional regulation of NO in endothelial cells. By analyzing gene differential expression in cells transfected with control and eNOS siRNA, we show that eNOS knockdown upregulates the expression of genes involved in cell polarization, such as PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 and TJ3. The up-regulation of these genes was confirmed by qRT-PCR analysis, suggesting that NO may regulate cell polarization. The analysis also showed that genes regulated by eNOS knockdown were involved in endothelial cell integrity and immune response. In addition, KEGG signaling pathway analysis showed that genes regulated by eNOS were enriched in many signal pathways including Ras signaling, which are important for endothelial cell migration. Moreover, clustering of differentially expressed genes in VEGF-treated cells and VEGF-treated eNOS-depleted cells revealed that NO may affect expression of genes in angiogenesis in response to VEGF, including those genes involved in chemotaxis. Our studies show that NO affects transcription in endothelial cells and regulates expression of genes involved in angiogenesis and endothelial cell function.

Le contrôle de la transparence de la cornée dépend de l'intégrité de l'endothélium cornéen mono-stratifié qui est classiquement considéré dès la naissance, dépourvu de capacité de régénération chez l’homme. Dans des conditions pathologiques conduisant à la cécité par œdème cornéen, les pertes significatives en cellules endothéliales (CE) ne sont pas remplacée efficacement, ce qui signifie que ni de nouvelles CE provenant de cellules souches (CS), ni la division des cellules voisines des lésions ne peuvent contribuer à la régénération endothéliale. Toutefois, plusieurs travaux ont prouvé depuis 25 ans que les CE possédaient une capacité proliférative résiduelle ex vivo et deux équipes ont suggéré l’existence de CS ou de progéniteurs à la périphérie de l’endothélium cornéen. Dans notre travail de thèse, nous avons tout d'abord optimisé, en la systématisant, une technique d’immunomarquage spécialement adaptée à l'endothélium cornéen intact de cornées montées à plat. A l’issue de ces développements, nous disposons de protocoles simples de fixation à température optimale et de démasquages antigéniques susceptibles de permettre la révélation de nombreuses protéines. A partir d’une importante série de cornées humaines non conservées et d’autres conservées en organoculture, et grâce à cet outil désormais efficace, nous avons étudié le cycle cellulaire des CE et la localisation de potentielles CS sur l’endothélium cornéen humaine. Nos résultats démontrent que dans ces conditions, les CE expriment de façon homogène des régulateurs positifs (PCNA, MCM2, cycline D1, cycline E et cycline A) et des régulateurs négatifs du cycle cellulaire (P16, P27); certaines particularités ont par ailleurs pu être décrites de façon innovante, comme la localisation cytoplasmique diffuse de MCM2, paranucléaire de la cycline D1, l’absence de P21. L’ensemble des marquages pourrait suggérer que les CE sont arrêtées en fin de G1, après le point de restriction et que de nombreux mécanismes de réparation de l’ADN sont mis en jeux dans les CE exposées à un stress oxydant important tout au long de l’existence. Nous avons identifié une nouvelle organisation de la micro-anatomie de la périphérie et de l'extrême périphérie de l’endothélium où des cellules regroupées en multiples clusters pluristratifiés semblent alimenter des colonnes de CE radiaires longues d'un millimètre. Ces éléments, associés à l’observation d'une moindre différenciation et d’une compétence proliférative plus élevés en périphérie suggèrent un nouveau modèle d’homéostasie endothéliale humaine in vivo: toute la vie, des CS périphériques alimentent de façon très lente la périphérie cornéenne en CE qui migrent de façon centripète pour assurer la stabilité du centre cornéen dont les propriétés optiques primordiales sont sous-tendues par un endothélium qui ne perd que 0,6% de CE par an. A la différence de l’épithélium cornéen, ce système ne peut être accéléré lors de circonstances pathologiques. Les perspectives de nos travaux sont désormais d’essayer d’isoler de l’extrême périphérie les CS endothéliales ou les progéniteurs et de les cultiver en recréant un microenvironnement favorable. La possibilité de produire un grand nombre de CE in vitre non pas à partir de CE sénescentes prélevées sur la totalité de l’endothélium comme cela a été tenté par la passé, mais cette fois à partir de CS ou des progéniteurs ouvriraient la voie d'une véritable thérapie cellulaire endothéliale. L'enrichissement des greffons pendant la durée de leur conservation à la banque de cornée pourrait constituer une première étape majeure avant d’envisager créer de novo un endothélium sur un support greffable pour une greffe endothéliale du 3e type qui deviendrait ainsi enfin indépendante des aléas de la découpe du greffon. Enfin, l’ïdentification de la CS endothéliale et de son microenvironnement permettra aussi d'envisager une thérapie cellulaire in vivo pour traiter les stades précoces des pathologies endothéliales cornéennes / The control of corneal transparency depends on the integrity of the mono-stratified corneal endothelium, which is considered devoid of regenerative capacity after birth in humans. In pathological conditions leading to blindness by irreversible corneal edema, the significant losses of endothelial cells (ECs) are not replaced efficiently, indicating that neither new ECs derived from stem cells (SC) nor the division of ECs neighboring the lesions can contribute to a form of regeneration. However, several works of the last 25 years demonstrated that ECs possess residual capacity of proliferation ex vivo, and more recently, two teams suggested the existence of SC or endothelial progenitors located in the corneal periphery. In this thesis work, we have firstly optimized an immunostaining technique specially adapted to intact endothelium of flat mounted whole corneas. Consequently, we now have simple protocols of fixation at the right temperature, and of antigen retrieval that allow detecting multiple proteins with a clear subcellular localization. Using important series of non-stored and of organ cultured corneas, and thanks to this technique, we investigated the cell cycle status of ECs and the location of potential SC in human corneal endothelium. Our results indicate that ECs homogeneously express positive regulators (PCNA, MCM2, cyclin D1, cyclin E and cyclin A) as well as negative regulators of the cell cycle (P16, P27); several original descriptions have been made: diffuse cytoplasmic location of MCM2, paranuclear location of cyclin D1, absence of P21. The expression patterns suggest that ECS could be arrested after the restriction point of the G1 phase and that numerous mechanism of DNA repair are stimulated in ECs exposed to an important oxidative stress throughout live. We identified a novel organization of the micro-anatomy of the endothelial periphery and extreme-periphery, where cells accumulate in multiple small multilayered clusters connected radial centripetal cell rows of nearly 1 mm of length. Associated with the observation of a lesser differentiation and an increased proliferation capacity in this area, these elements suggest a novel model of endothelial homeostasis in humans: during life, SC continuously and extremely slowly sustain the endothelial periphery with new ECs that migrate toward centre forming cells rows. These cells ensure the stability of the center, which optical fundamental properties require a perfect stability, as indicated by an annual cell loss of only 0.6%. Contrary to the corneal epithelium, this system is incapable of accelerations in case of important cell loss. Further studies are necessary to understand this limitation. Our works offer several perspectives: the next step is to isolate the SC or the progenitors from the extreme periphery and to cultivate them in an adapted microenvironment. The possibility to cultivate endothelial cells directly from SC or progenitors and not, as previously tried in the past, from senescent EC from the whole endothelium open the way of a true endothelial cell therapy. The increase of endothelial cell density during corneal storage by eye banks could be a first step before developing bioengineered endothelium on a specific carrier that could be implanted in the recipient eye. Finally, the identification of SC and of its microenvironment would allow developing the basis of an in vivo cell therapy able to treat early stages of endothelial dysfunctions

L’apoptose des cellules endothéliales (CE) représente un évènement initial dans le développement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique d’allogreffe et la sclérose systémique. Nous avons démontré que les médiateurs issus des CE apoptotiques entraîne la différenciation myofibroblastique et la résistance à l’apoptose, deux mécanismes centraux à la fibrogénèse. L’activation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractérise ces deux mécanismes. Un fragment C-terminal du perlécan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe l’apoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail étaient de : 1. définir les récepteurs et la signalisation impliqués dans la réponse anti-apoptotique et 2. caractériser les médiateurs fibrogéniques responsables de la différenciation myofibroblastique. En ce qui a trait à la réponse anti-apoptotique, l’inhibition des intégrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prévient la résistance à l’apoptose et la phosphorylation d’Akt normalement induites par le milieu conditionné par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces résultats suggèrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un état de résistance à l’apoptose chez les fibroblastes par des voies α2β1integrines/SFK/PI3K dépendantes. Le LG3 n’induit cependant pas la différenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractérisé le milieu SSC de façon à identifier les médiateurs responsables de la différenciation myofibroblastique. Les milieux conditionnés par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont été analysés comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectrométrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrogénique connu augmenté dans le milieu SSC. L’inhibition de la caspase-3 chez les CE prévient la relâche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, l’inhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prévient la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. L’anticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) n’est pas en mesure de bloquer la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanées de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entraîne une augmentation de l’épaisseur de la peau et des niveaux protéiques d’SMA, de vimentine et de collagène I. Cette réponse fibrogénique est réduite chez les souris qui ont reçu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodéplété de son CTGF. Ces résultats apportent de nouvelles issues mécanistiques au niveau de la réponse fibrogénique activée par la mort des CE. L’activation des caspases chez les CE apoptotiques entraîne la production de LG3 et de CTGF qui, à leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dépendantes chez les fibroblastes, et ce indépendamment du TGF-. / Apoptosis of endothelial cells (EC) is an early event in various fibrotic diseases including chronic allograft vasculopathy and systemic sclerosis. We showed previously that mediators released by apoptotic EC activate myofibroblast differentiation and resistance to apoptosis, two mechanisms pivotal to fibrogenesis. PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) activation was found to be central to these two mechanisms. A C-terminal fragment of perlecan (LG3) produced by apoptotic EC was found to inhibit apoptosis of fibroblasts. The aims of the present project were : 1. to define the receptors and pathways implicated in this anti-apoptotic response and 2. to characterize the fibrogenic mediators implicated in myofibroblast differentiation. Concerning the anti-apoptotic response, the inhibition of 21 integrin activity in fibroblasts exposed to either medium conditioned by apoptotic EC (SSC) or LG3 prevented resistance to apoptosis and was associated with decreased levels of Akt phosphorylation. Neutralizing Src family kinases (SFK) activity in fibroblasts produced the same effects. These results suggest that LG3 produced by apoptotic EC initiate a state of resistance to apoptosis in fibroblasts via an α2β1integrin/SFK/PI3K dependent pathway. LG3 did not induce myofibroblast differentiation. We went on to identify which mediators present in SSC are implicated in myofibroblast differentiation. Media conditioned by apoptotic and non-apoptotic EC (respectively SSC and SSC-ZVAD) were analyzed comparatively by 2-dimension liquid chromatography, western blotting and mass spectrometry. Connective tissue growth factor (CTGF) was the only known fibrogenic factor increased in SSC. Caspase-3 silencing of EC demonstrated that CTGF is released by apoptotic EC downstream of caspase-3 activation. In fibroblasts, blocking the activation of SFK or silencing the proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) blocked myofibroblast differentiation triggered by either SSC or recombinant CTGF in vitro. Exposure to a pan-transforming growth factor (TGF-β) neutralizing antibody failed to attenuate myofibroblast differentiation in fibroblasts exposed to either SSC or CTGF. Subcutaneous injection of mouse SSC to C3H mice daily for three weeks led to increased skin thickness, increased protein levels of αSMA, vimentin and collagen I. This fibrogenic response was blunted in mice injected with either SSC-ZVAD or SSC immunodepleted of CTGF. These results bring new mechanistic insights into the fibrogenic pathways activated by EC death. Caspase activation in apoptotic EC triggers the production of LG3 and CTGF which in turn activate SFK/PI3K dependant pathways in fibroblasts thus activating a TGF-β-independent fibrogenic response.