Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le traitement des tumeurs cérébrales représente un défi d'envergure, puisqu'elles sont isolées du reste du corps par la barrière hémato-encéphalique. Il est donc impératif d'accroître nos connaissances sur les cellules composant ces tumeurs. L'une des hypothèses émergentes concerne la présence d'une sous-population spécifique de cellules au sein de la tumeur, les cellules souches cancéreuses (CSC), impliquées dans l'initiation et la récurrence des cancers. Les marqueurs de surfaces des CSC varient largement selon le tissu d'intérêt, mais il semble que CD133, une glycoprotéine membranaire, soit une signature commune à plusieurs CSC. S'il est courant de traiter le cancer en ciblant les cellules cancéreuses elles-mêmes, cibler le microenvironnement dans lequel évolue la tumeur est une avenue thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules endothéliales (CE) au sein d'une tumeur sont connues pour avoir des propriétés différentes des CE normales. Ces cellules endothéliales tumorales (CET) peuvent donc constituer une cible supplémentaire pour inhiber sélectivement la croissance tumorale. À l'aide d'une lignée de médulloblastome (DAOY), nous avons identifié et évalué de nouvelles caractéristiques cellulaires et moléculaires impliquées dans la régulation du phénotype invasif associé à la formation de structures comparables aux neurosphères formées par les CSC CD133(+). De plus, nous avons apporté de nouvelles informations concernant les propriétés chimiopréventives du sulforaphane (SFN), un composé naturel retrouvé principalement dans le brocoli, en ciblant spécifiquement les CET cérébrales possiblement impliquées dans la cooption vasculaire. En utilisant la technologie de l'ARN interférant, nous avons montré que MMP-9 et MT1-MMP, deux métalloprotéinases matricielles importantes pour l'invasion cellulaire, les métastases et la résistance à la radiation, avaient un rôle crucial dans la formation par les DAOY de structures apparentées aux neurosphères CD133(+). De plus, nous avons mis en évidence une inhibition presque complète (> 90 %) de la migration des HBMEC (human brain microvascular endothelial cell) activées par un carcinogène, le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Ainsi, nos résultats suggèrent que les molécules présentes dans notre diète pourraient cibler les CET cérébrales composant la masse tumorale. En somme, nous proposons que MMP-9 constitue une cible de choix pour le traitement du cancer, que ce soit au niveau du compartiment tumoral ou vasculaire. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellule souche cancéreuse (CSC), Cellule endothéliale tumorale (CET), Sulforaphane (SFN), Métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9), Tumeur cérébrale.

Depuis de nombreuses années, on observe un fort déclin des populations d'amphibiens à travers le monde et une augmentation marquée du taux de malformation des membres. Plusieurs causes sont suggérées pour expliquer l'émergence de ces effets sur le développement. Parmi celles-ci, la présence de fertilisants et de pesticides dans les cours d'eau semble être un facteur majeur impliqué dans ce phénomène étant donné que la peau des amphibiens est très perméable et parce que la plupart des malformations ont été répertoriées dans les marais avoisinant les zones d'agriculture intensive. Il est connu qu'un excès ou une carence en vitamine A (rétinol) durant le développement d'un organisme peut provoquer de graves effets sur le développement, voire même provoquer la mort au stade embryonnaire. Les rétinoïdes sont des molécules qui dérivent de la vitamine A, et l'acide rétinoïque (RA) est un des dérivés biologiquement actif. C'est un morphogène très puissant et ses effets sont assurés par la liaison et l'activation de récepteurs nucléaires spécifiques. Plusieurs pesticides sont connus pour affecter le développement et certains sont également connus pour interférer dans le métabolisme et les voies de signalisation de RA. L'objectif du présent projet était d'évaluer le potentiel tératogène de quelques contaminants d'origine agricole en mesurant leur capacité à affecter la différenciation cellulaire médiée par RA et le catabolisme de RA. Les cellules P19 de carcinome embryonnaire de souris ont été sélectionnées comme modèle d'étude. Ces cellules sont indifférenciées et peuvent se différencier en présence de différents inducteurs, dont RA. Un protocole de neurodifférenciation en agrégats et un second en monocouche ont été utilisés et le taux de différenciation cellulaire a été évalué par cytométrie de flux (FACS) à l'aide du marqueur de non-différenciation SSEA1 et du marqueur neuronal βIII-tubuline. La disparition de RA et sa métabolisation en dérivés polaires ont été mesurés par une méthode HPLC et un bioessai de métabolisation de courte durée permettant de tester de fortes concentrations de contaminants a été mis au point. L'atrazine, les nitrates et les nitrites ont été sélectionnés comme première série de contaminants étant donné que leur toxicité développementale n'est pas complètement documentée et parce qu'ils sont parmi les contaminants les plus abondants dans les cours d'eau avoisinant les zones agricoles. Le carbaryl et l'endosulfane ont été choisis pour une deuxième série d'analyses en considérant leurs effets déjà connus, le premier étant neurotoxique et le second étant tératogène et connu pour interférer dans le système des rétinoïdes. Les résultats ont montré qu'une augmentation de la concentration de RA diminuait SSEA 1 et augmentait βIII-tubuline de façon dose-dépendante. II a également été démontré que les cellules P19 métabolisent le RA, que ce métabolisme pouvait être inhibé partiellement par le clotrimazole (inhibiteur du cytochrome P450) et qu'il pouvait être suractivé suite à un prétraitement des cellules avec RA ou son analogue, le TTNPB. Les 3 premiers contaminants testés sur la différenciation neuronale en agrégats ont été utilisés à des concentrations de 100 à 10000 fois plus élevées que les normes canadiennes pour la protection de la vie aquatique. Les résultats n'ont pas permis de mesurer d'effets à des concentrations qui n'affectent pas la prolifération et/ou la viabilité cellulaire. Des concentrations de nitrites variant de 0 à 670 mg/L préviennent fortement la diminution de l'expression de SSEA1 et diminuent le nombre de cellules positives pour βlII-tubuline. Le carbaryl et l'endosulfane testés à 25 µM n'induisent pas la différenciation cellulaire de cellules cultivées en agrégats. Avec des cellules cultivées en monocouches, ces deux pesticides ont beaucoup affecté la prolifération et/ou la viabilité cellulaire et ont diminué le taux de cellules positives pour βIII-tubuline. Aucun des contaminants n'a affecté le métabolisme. Les résultats suggèrent que la cytotoxicité est probablement un facteur impliqué dans certains effets développementaux et que le système enzymatique impliqué dans la métabolisation de RA ne semble pas être une cible pour ces pesticides aux concentrations utilisées. Les effets de ces contaminants sur la liaison de RA à ses récepteurs, sur le métabolisme microsomal et/ou sur l'expression de diverses cibles cellulaires pourraient éventuellement être étudiés pour préciser les effets de type « rétinoïdiens ». ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acide rétinoïque, Cellules P19, Contaminants agricoles, Différenciation cellulaire, FACS, HPLC.

Récemment, des spécialistes en cancérologie ont identifié au sein des tumeurs une sous-population cellulaire réfractaire aux traitements de chimio et de radiothérapie. Les caractéristiques cellulaires propres à cette population avoisinent celles des cellules souches. Il semblerait qu'aussi peu que 100 de ces cellules souches retrouvées dans les tumeurs soient capables de réinitier un cancer in vivo. Plusieurs arguments supportent un modèle de cellules souches cancéreuses (CSC) responsable de l'initiation tumorale. Dans les cancers cérébraux, ces CSC expriment le marqueur membranaire de cellules souches neuronales CD133. Les traitements ciblant les tumeurs cérébrales demeurent peu efficaces en partie à cause de la résistance des CSC CD133(+) face à ces traitements. Le ciblage de ces CSC serait donc porteur d'espoir. Le marqueur CD133 permet l'isolation et l'enrichissement de la population de CSC retrouvée au sein des lignées cellulaires ou des tumeurs primaires cérébrales. À l'aide du marqueur CD133, les caractéristiques propres aux CSC peuvent être mieux définies permettant un traitement ciblé. Les tumeurs cérébrales ayant des niveaux d'expression élevés de CD133 sont hautement malignes et un des joueurs clés de l'invasion tissulaire est la métalloprotéinase membranaire de type 1 (MT1-MMP). La protéine MT1-MMP est une protéase capable de dégrader la matrice extracellulaire et d'activer d'autres protéases. Une autre protéine qui est surexprimée dans les gliomes hautement malins est la cyclooxygénase de type 2 (COX-2). L'enzyme COX-2 joue des rôles clés dans la biosynthèse de prostaglandines impliquées entre autres dans des conditions pathologiques en encourageant l'inflammation, la sudation, la douleur et la fièvre. Cependant, une activité constitutive de COX-2 est associée au maintien de la prolifération cellulaire et à la résistance à l'apoptose dans les tumeurs. Nous avons étudié l'expression des protéines MT1-MMP et COX-2 dans les CSC CD133(+) issues de tumeurs cérébrales. Les résultats obtenus montrent que les protéines COX-2 et MT1-MMP sont surexprimées dans les cellules CD133(+) enrichies d'une lignée cellulaire de tumeur cérébrale. La surexpression de ces deux protéines semble être régulée par un axe MT1-MMP/COX-2 dans les CSC CD133(+). En effet, MT1-MMP induit la surexpression de COX-2 dans les CSC CD133(+). Ce rôle de MT1-MMP dans les cascades signalétiques cellulaires nécessite une signalisation initiée via son domaine cytoplasmique. Nous avons aussi étudié la voie de signalisation qui régule l'axe MT1-MMP/COX-2 et avons découvert un rôle critique pour les facteurs de transcription de la famille de NF-кB. Ce nouvel axe pourrait être exploité dans l'optique d'une thérapie anti-cancer afin de diminuer le potentiel invasif des CSC CD133(+) et leur résistance aux traitements actuels. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellules souches cancéreuses, CD133, COX-2, MT1-MMP, Glioblastome.

L'OMS estime que d'ici 2030, le nombre de décès par cancer devrait poursuivre sa progression et atteindre 12 millions de personnes annuellement. À ce jour, le modèle des cellules souches cancéreuses (CSC) prend de plus en plus d'ampleur. Les CSC ont été j'objet de plusieurs hypothèses portant sur leurs propriétés de résistance à l'apoptose, à de nombreux médicaments ainsi qu'à l'irradiation. Ce modèle propose qu'une petite sous-population seulement de cellules au sein de la tumeur dispose d'une capacité significative de proliférer et de régénérer une nouvelle tumeur analogue à la tumeur primaire. Vu que le marqueur CD133 (prominine-1) a été identifié comme un des plus puissants marqueurs des CSC et que son expression est hautement significative dans les tumeurs récurrentes, nous avons voulu investiguer le phénotype invasif et inflammatoire associé à ce marqueur dans trois lignées cellulaire triées. La recherche présentée dans ce mémoire s'articule autour de trois axes de recherche principaux. Le premier concerne le potentiel invasif des CSC en réponse à des facteurs plaquettaires circulants, le S1P (sphingosine-1-phosphate) et le LPA (acide lysophosphatidique). Cette étude suggère la contribution de MT1-MMP au cours de la signalisation induite par le S1P. Le deuxième axe de recherche s'intéresse davantage à la modulation de l'expression des LRPs (low density lipoprotein receptor-associated protein), de Cox-2 et d'IkB dans un environnement inflammatoire, carcinogénique et hypoxique ; conditions qui miment l'environnement tumoral. Nos données expérimentales suggèrent que les différents traitements peuvent autant moduler l'expression génique des LRPs dans les cellules de la masse tumorale qu'affecter le niveau d'activité de liaison de ces récepteurs au sein des CSC CD133+. Notre étude nous amènent à proposer un modèle global dans lequel LRP apparaît comme un récepteur versatile au niveau de chaque condition engendrée et semble être également moduler dans le développement. Les fonctions de MT1-MMP ont également été investigué entre autre dans le phénotype inflammatoire des CSC CD133+. Les données de notre étude soutiennent la participation des fonctions de MT1-MMP dans l'expression de Cox-2 et cette contribution est impliquée à d'autres niveaux, autre que NFkB, dans la transcription de Cox-2. Finalement, le dernier volet de notre recherche traite du marqueur CD133, de son expression et de la corrélation entre le phénotype CD133 et la prolifération tumorale, Les difficultés rencontrées dans la détection et dans la purification des cellules CD133+ amène un questionnement à ce qui attrait à l'utilisation de CD133 comme marqueur exclusif de CSC cérébrales. L'ensemble de nos recherches vise donc à identifier de nouvelles voies de signalisation et des partenaires moléculaires influençant le phénotype invasif et inflammatoire des CSC. L'identification de MT1-MMP ou des axes MT1-MMP/S1P ou MT1-MMP/Cox-2 sont des cibles thérapeutiques prometteuses dans le traitement du cancer et également des CSC CD133+, De plus, cette étude nous permet d'affirmer qu'une investigation plus spécifique de l'expression des LRPs au sein de chaque type de cancer doit être effectuée afin de discerner le rôle versatile de ces récepteurs dans la progression tumorale et dans le développement. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellule souche cancéreuse, CD133, MMP, LRP, Cox-2, invasion, inflammation.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le cytosquelette d’actine régule la forme de la cellule au cours du temps. Pour lecomprendre, il faut étudier les mécanismes moléculaires qui le constituent. In vivo,ces mécanismes sont masqués par la complexité du vivant. Si nous parvenons àreproduire pièce par pièce le cytosquelette d’actine in vitro et si nous pouvons lecontrôler, aussi bien dans l’espace et dans le temps, alors nous pourrons élucider lessecrets de son fonctionnement. Cette thèse montre que nous avons maintenantdéveloppé la technologie qui nous permet de le faire pour certaines architectures ducytosquelette d’actine.Nous avons développé de nouvelles méthodes de « micropatterning » pour contrôlerla nucléation des monomères d’actine dans l’espace en deux dimensions. Ceci nous aamenés à la reconstitution et au guidage de réseaux de filaments d’actine parallèles àpolarité identique et à la reconstitution de l’anneau de cytocinèse.J’ai crée une puce microfluidique innovante pour contrôler la compositionbiochimique des systèmes d’actine reconstitués au cours du temps. Ceci nous a permisde contrôler la cinétique de polymérisation du filament d’actine individuel libre, et decontrôler la séquence d’intervention des protéines sur les réseaux de filamentsd’actine parallèles à polarité identique.Enfin, nous avons utilisé cette même puce microfluidique pour étudier ladifférentiation des cellules souches hématopoïétiques. / Actin cytoskeleton regulate cell shape over time. To understand that, we have to studymolecular mechanisms that constitute actin cytoskeleton. In vivo, those mechanismsare hidden by cellular complexity. If we achieve to reproduce piece by piece actincytoskeleton in vitro and if we can control it in space and time, then we are able toelucidate the secrets of it operate. This thesis show that we have developed thetechnology that allow us to do it for a few actin cytoskeleton architectures.We have developed new micro-patterning methods to control actin monomersnucleation into two-dimensional space. This led us to the reconstitution and guidanceof parallel actin filament networks with same polarity and allowed us to reconstituteactin contractil ring.I created an innovating microfluidic chip to control biochemical composition ofreconstituted actin systems over time. This allowed us to control kinetics of freeindividual actin filament polymerisation and to control the intervention sequence ofproteins on parallel actin filament networks.Finaly, we used the microfluidic chip to study hematopoïetic stem cellsdifferentiation.

Stem cells and cancer are inextricably linked and many tumours, including colorectal cancers, contain a small population of self-renewing cells, referred to as cancer stem cells (CSCs), able to give rise to proliferating but progressively differentiating cells that contribute to the cellular heterogeneity typical of solid tumours. Thus, the identification of CSCs and the factors that regulate their behaviour should have a profound impact on cancer treatment. Notch signalling controls the maintenance and differentiation of stem cells in several tissues, including the intestine, where it is essential for stem cells maintenance. Based on these premises, my work was aimed at identifying and characterising the cells that express the Notch1 receptor in intestinal tumours in vivo, with the objective of getting insights into the cellular hierarchy of colon cancer cells. We found that the Notch1 receptor is expressed in rare undifferentiated tumour cells that present self-renewal and multipotency in vivo, as they indefinitely give rise to marked differentiated tumour cells and fuel tumour growth. Our analysis on the transcriptomic profile of these cells confirmed our in vivo observations that Notch1+ tumour cells represent a specific population of highly proliferative tumour cells, expressing several, but not all, known markers of normal intestinal stem cells (ISCs). Indeed, their transcriptional signature highly correlates with normal ISCs. Given that the tumour cells we characterised appear not to carry Apc mutations, we hypothesise that during the earlies steps of tumourigenesis, normal Notch1+ ISCs are engulfed within the nascent tumour (in aberrant hyperproliferative crypts) and are able to grow and expand within this new ecosystem, as they are supported by extrinsic secreted growth factors from the neighbouring mutant cells. The concept that normal ISCs might contribute to tumour expansion highlights the complications that patients can encounter during treatment, since these cells share many features with their wild-type counterparts, making therapy deleterious to normal ISCs. / Les cellules souches et le cancer sont inextricablement liés et de nombreuses tumeurs, y compris les cancers colorectaux, contiennent une petite population de cellules auto-renouvelables, appelées cellules souches cancéreuses (CSCs), capables de donner naissance à des cellules proliférantes mais progressivement différenciatrices qui contribuent à l'hétérogénéité cellulaire typique des tumeurs solides. Ainsi, l'identification des CSC et des facteurs qui régissent leur comportement devrait avoir un impact profond sur le traitement du cancer. Notch signale le contrôle le maintien et la différenciation des cellules souches dans plusieurs tissus, y compris l'intestin, où elles sont essentielles au maintien des cellules souches. Sur la base de ces prémisses, mes travaux visaient à identifier et caractériser les cellules qui expriment le récepteur Notch1 dans les tumeurs intestinales in vivo, dans le but de mieux comprendre la hiérarchie cellulaire des cellules cancéreuses du colon. Nous avons constaté que le récepteur Notch1 s'exprime dans de rares cellules tumorales indifférenciées qui se renouvellent et se multiplient in vivo, car elles donnent lieu indéfiniment à une différenciation marquée des cellules tumorales et à une croissance tumorale. Notre analyse du profil transcriptomique de ces cellules a confirmé nos observations in vivo selon lesquelles les cellules tumorales Notch1+ représentent une population spécifique de cellules tumorales hautement prolifératives, exprimant plusieurs marqueurs connus, mais pas tous, des cellules souches intestinales normales (CSI). En effet, leur signature transcriptionnelle est fortement corrélée avec les CSI normaux. Étant donné que les cellules tumorales que nous avons caractérisées ne semblent pas être porteuses de mutations Apc, nous supposons que durant les premières étapes de la tumorigénèse, les CSI normales Notch1+ sont englouties dans la tumeur naissante (dans des cryptes hyperprolifératives aberrantes) et sont capables de croître et de s'étendre dans ce nouvel écosystème, car elles sont soutenues par les facteurs de croissance extrinsèques des cellules mutantes voisines. Le concept selon lequel les CSI normaux pourraient contribuer à l'expansion tumorale met en évidence les complications que les patients peuvent rencontrer pendant le traitement, puisque ces cellules partagent de nombreuses caractéristiques avec leurs homologues de type sauvage, ce qui rend le traitement délétère pour les CSI normaux.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.