Drosophila melanogaster extends its telomeres by transposition of special telomeric retroelements (HeT-A, TART and TAHRE) targeted specifically to chromosome ends. Retroelement HeT-A is the most studied of telomeric elements and recent studies revealed significant sequence variability of the element HeT-A, not only along its length but also in areas with regulatory activity. This thesis is focused on the activity of different HeT-A promotors during the whole Drosophila development and comparision of transgenic lines with HeT-A promotor and reporter Tomato transgen and it was confirmed the sequence variability of the promotor HeT-A element and its tissue and organ specificity.

Instead of using telomerase, Drosophila melanogaster extends its telomeres by transposition of special telomeric retroelements (HeT-A, TART and TAHRE) targeted specifically to chromosome ends. One key step of the transposition mechanism is a transcription of the elements. Using the expression of a reporter Tomato transgene under HeT-A promoter control we obtained a spatial and temporal visualization of HeT-A promoter activity during the whole Drosophila development. This analysis confirmed that the activity of the HeT-A promoter is up-regulated by cell proliferation, however HeT-A promoter activity is not limited only to proliferating diploid cells. One important outcome of this study is the observation of variation in HeT-A promoter activity in both location and intensity.

DYRK1A is the most studied member of the DYRK family of protein kinases, because is one of the human chromosoma 21 proteins for which changes in gene dosage result in neuropathological alterations. DYRKs are activated by autophosphorylation on a tyrosine residue in the activation loop, a one-off event that takes place during translation. Accordingly, DYRK1A would be constitutively active once is synthesized. However, DYRK1A is extremely sensitive to gene dosage, and thus it is predictable that not only its activity but also its actual protein amounts have to be tightly regulated by mechanisms not yet characterized. In the present study, the protein kinase NLK has been identified as a novel regulator of DYRK1A protein stability. DYRK1A interacts with NLK in physiological conditions. The interaction results in the phosphorylation of DYRK1A at multiple sites, which have been identified by mass spectrometry analysis. These phosphorylation events promote DYRK1A proteasome-dependent degradation. Moreover, DYRK1A degradation is induced by stimulating cells with Wnt1 or Wnt3a, or overexpressing elements of the Wnt signaling cascade such as the Frizzled-1 receptor or NLK activators such as HIPK2. In addition, DYRK1A interacts with and phosphorylates -catenin and TCF-4 and enhances -catenin-dependent transcriptional activity, at least by phosphorylation of -catenin. Thus, these results suggest that DYRK1A acts as a positive factor in the Wnt--catenin signaling pathway and NLK acts as a negative regulator by targeting both DYRK1A and TCF/LEF transcription factors for proteasome-mediated degradation. / DYRK1A es el miembro más estudiado de la familia de proteína quinasas DYRK, porque es una de las proteínas de la cromosoma humano 21 para la que cambios en la dosis génica dan lugar a alteraciones neuropatológicas. Las quinasas DYRK se activan por autofosforilación en un residuo tirosina localizado en el lazo de activación, un evento único que ocurre durante la traducción. Como consecuencia, DYRK1A sería constitutivamente activa una vez se ha sintetizado. Sin embargo, DYRK1A es extremadamente sensible a la dosis génica, y por tanto es predecible que no sólo su actividad, pero también los niveles de proteína han de estar estrictamente controlados por mecanismos reguladores que todavía no han sido caracterizados. En este trabajo, la proteína quinasa NLK ha sido identificada como un nuevo regulador de la estabilidad de DYRK1A. DYRK1A interacciona con NLK en condiciones fisiológicas, y la interacción tiene como resultado la fosforilación de DYRK1A en residuos serina/treonina, varios de los cuales han sido identificados por espectrometría de masas. La interacción con NLK y la subsecuente fosforilación promueven la degradación de DYRK1A vía el proteasoma. Además, la degradación de DYRK1A es inducida por estimulación de la células con Wnt1 o Wnt3a, o por sobreexpresión de miembros de la cascada de señalización de Wnt, como el receptor Frizzled-1 o de un activador de NLK como HIPK2. Finalmente, se ha demostrado que DYRK1A se une y fosforila -catenina y TCF-4. La fosforilación de, al menos, -catenina es responsable del incremento de la actividad transcripcional dependiente de esta proteína en presencia de DYRK1A. Todos estos resultados sugieren que DYRK1A actúa como un factor positivo en la vía de señalización Wnt--catenina y NLK actúa como un regulador negativo al inducir la degradación vía proteasoma no sólo de los factores de transcripción TCF/LEF sino también del modulador positivo DYRK1A.

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Les cellules endothéliales forment une couche semi-perméable entre le sang et les organes. La prolifération, la migration et la polarisation des cellules endothéliales sont essentielles à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, soit l’angiogenèse. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) peut activer la synthase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS) et induire la production de monoxyde d’azote (NO) nécessaire pour la régulation de la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse. β- caténine est une composante essentielle du complexe des jonctions d’ancrage ainsi qu’un régulateur majeur de la voie de signalisation de Wnt/β-caténine dans laquelle elle se joint au facteur de transcription TCF/LEF et module l’expression de nombreux gènes, dont certains sont impliqués dans l’angiogenèse. La S-nitrosylation (SNO) est un mécanisme de régulation posttraductionnel des protéines par l’ajout d’un groupement nitroso au niveau de résidus cystéines. Le NO produit par eNOS peut induire la S-nitrosylation de la β−caténine au niveau des jonctions intercellulaires et moduler la perméabilité de l’endothélium. Il a d’ailleurs été montré que le NO peut contrôler l’expression génique par la transcription. Le but de cette thèse est d’établir le rôle du NO au sein de la transcription des cellules endothéliales, spécifiquement au niveau de l’activité de β-caténine. Le premier objectif était de déterminer si la SNO de la β-caténine affecte son activité transcriptionnelle. Nous avons montré que le NO inhibe l’activité transcriptionnelle de β- caténine ainsi que la prolifération des cellules endothéliales induites par l’activation de la voie Wnt/β-caténine. Il est intéressant de constater que le VEGF, qui induit la production de NO via eNOS, réprime l’expression de AXIN2 qui est un gène cible de Wnt s’exprimant suite à la i i stimulation par Wnt3a et ce, dépendamment de eNOS. Nous avons identifié que la cystéine 466 de la β-caténine est un résidu essentiel à la modulation répressive de son activité transcriptionnelle par le NO. Lorsqu’il est nitrosylé, ce résidu est responsable de la perturbation du complexe de transcription formé de β-caténine et TCF-4 ce qui inhibe la prolifération des cellules endothéliales induite par la stimulation par Wnt3a. Puisque le NO affecte la transcription, nous avons réalisé l’analyse du transcriptome afin d’obtenir une vue d’ensemble du rôle du NO dans l’activité transcriptionnelle des cellules endothéliales. L’analyse différentielle de l’expression des gènes de cellules endothéliales montre que la répression de eNOS par siRNA augmente l’expression de gènes impliqués au niveau de la polarisation tels que : PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 et TJ3. Cette analyse suggère que le NO peut réguler la polarisation des cellules et a permis d’identifier des gènes responsables de l’intégrité des cellules endothéliales et de la réponse immunitaire. De plus, l’analyse de voies de signalisation par KEGG montre que certains gènes modulés par l’ablation de eNOS sont enrichis dans de nombreuses voies de signalisation, notamment Ras et Notch qui sont importantes lors de la migration cellulaire et la différenciation des cellules de têtes et de tronc (tip/stalk). Le regroupement des gènes exprimés chez les cellules traitées au VEGF (déplétées de eNOS ou non) révèle que le NO peut affecter l’expression de gènes contribuant au processus angiogénique, dont l’attraction chimiotactique. Notre étude montre que le NO module la transcription des cellules endothéliales et régule l’expression des gènes impliqués dans l’angiogenèse et la fonction endothéliale. / induce the production of nitric oxide (NO), which is critical for vascular permeability and angiogenesis. β-catenin is an essential component of the adherens junction as well as Wnt/β-catenin signaling pathway and it binds T-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor, regulating expression of numerous genes including those involved in angiogenesis. S-nitrosylation (SNO) is a mechanism used by NO to regulate protein activity by adding a nitroso group to cysteine residues. eNOS derived-NO is capable to induce SNO of β-catenin at cell-cell junction and modulate endothelial permeability. Additionally, NO has been implicated in the transcriptional control of gene expression. Therefore, the goals of our studies were to investigate the regulatory roles of NO on transcription in endothelial cells, in particular to the modulation of the transcriptional activity of β-catenin. The objective of the first study is to investigate whether the SNO of β-catenin affect its transcriptional activity. We found that NO inhibits β-catenin transcriptional activity and endothelial cell proliferation induced by activation of Wnt/β-catenin signaling. Interestingly, VEGF, which can activate eNOS to produce NO in endothelial cells, repressed Wnt3a-induced expression of Wnt target gene AXIN2 in an eNOS-dependent manner. Moreover, we identified that Cys466 on β-catenin is a critical residue for the repressive effects of NO on β-catenin transcriptional activity. Furthermore, we showed that Cys466 is responsible for the disruption iv of β-catenin/TCF4 transcriptional complex, and NO-dependant inhibition of Wnt3a-simulated endothelial cell proliferation. Given the known effects of NO on transcription, whole transcriptome sequencing was performed in order to understand the transcriptional regulation of NO in endothelial cells. By analyzing gene differential expression in cells transfected with control and eNOS siRNA, we show that eNOS knockdown upregulates the expression of genes involved in cell polarization, such as PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 and TJ3. The up-regulation of these genes was confirmed by qRT-PCR analysis, suggesting that NO may regulate cell polarization. The analysis also showed that genes regulated by eNOS knockdown were involved in endothelial cell integrity and immune response. In addition, KEGG signaling pathway analysis showed that genes regulated by eNOS were enriched in many signal pathways including Ras signaling, which are important for endothelial cell migration. Moreover, clustering of differentially expressed genes in VEGF-treated cells and VEGF-treated eNOS-depleted cells revealed that NO may affect expression of genes in angiogenesis in response to VEGF, including those genes involved in chemotaxis. Our studies show that NO affects transcription in endothelial cells and regulates expression of genes involved in angiogenesis and endothelial cell function.