Cette recherche visait à étudier l'impact des facteurs de croissance (FC) libérés dans les surnageants de plasmas riches en plaquettes (PRP) sur la prolifération des cellules endothéliales et à optimiser le potentiel mitogénique des PRP. Des anticorps spécifiques dirigés contre les FC d'intérêt ont été ajoutés aux surnageants de PRP et l'effet des neutralisations a été déterminé dans un modèle in vitro de prolifération des cellules endothéliales. En parallèle, nous avons déterminé le potentiel mitogénique de combinaisons de FC recombinants, supplémentés ou non de surnageants de PRP. Bien que les facteurs Epidermal Growth Factor (EGF), basic Fibroblast Growth Factor et Vascular Endothelial Growth Factor soient hautement mitogéniques pour les cellules endothéliales, seul EGF semble être libéré à des concentrations suffisantes pour engendrer un effet significatif sur la division cellulaire. Cette étude a également permis de démontrer que les surnageants de PRP sont hautement mitogéniques, et l'ajout de FC n'a pas permis d'optimiser cet effet.

En modulant en permanence une production d’insuline adaptée au besoin de l’organisme, la cellule béta pancréatique joue un rôle crucial dans l’homéostasie glucidique. L’adaptation de cette production d’insuline est l’opération d’une machinerie cellulaire responsable de la production de l’insuline hautement adaptative et d’une augmentation de la masse des cellules bêta-pancréatiques. Cette plasticité des cellules béta est particulièrement critique dans des périodes de modifications de la physiologie de l’organisme, telles que la prise de poids, la grossesse ou le développement du nouveau-né jusqu’au sevrage. Une perte de la fonctionnalité et de la masse des cellules béta sont à l’origine du diabète, une des causes principales de mortalité dans le monde.Chez les vertébrés, les sérine-thréonine kinases (STKs) dirigent des voies de signalisation importantes permettant aux cellules de répondre à l’environnement. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les voies de signalisation responsables du développement de la masse de cellules bêta à la naissance, au cours de la grossesse et de l’obésité, afin de mieux comprendre le dysfonctionnement et la perte de la masse des cellules béta induite par l’environnement diabétogène (ex : LDL-oxydées, hyperglycémie, hyperlipidémie,..) du patient diabétique. En étudiant la plasticité des cellules béta des rats nouveau-nés, nous avons découvert une élévation importante de l’expression de la protéine Dual Leucine Zipper Kinase (DLK) dans les îlots des rats nouveau-nés de 10 jours lorsqu’ils sont comparés aux îlots des rats adultes. Dans les îlots des ratons, l’augmentation de l’expression de DLK coïncide avec une très forte prolifération des cellules béta et l’activation de la signalisation «cJun-amino terminal Kinase 3» (JNK3), une STK de la famille des «mitogen activated protein kinase» (MAPKs). Comme observé pour DLK, dans les îlots des ratons, l’invalidation de JNK3, réduit considérablement le nombre de cellules sécrétrices de l’insuline. Nous avons aussi observé que les MAPKs sont directement impliquées dans la mort des cellules béta induite par des LDL-oxydées via un mécanisme cellulaire impliquant le stress du réticulum endoplasmique et le stress oxydant. Nos résultats montrent l’importance de la signalisation des MAPKs dans le contrôle de la survie et de la prolifération des cellules béta et de son implication dans le diabète. / Pancreatic beta cell constantly tunes insulin production to meet the body needs. The insulin production adaptation is achieved thanks to highly adaptive beta cell metabolism, signaling, secretory machinery and mass. The beta-cell function and mass plasticity are particularly critical during nutritional, body growth and physiological changes such as obesity, pregnancy and postnatal development of newborn. Functional beta cell demise account for diabetes is one of the leading causes of death worldwide.In vertebrates, serine-threonine kinases (STKs) drive key signaling pathways for adaptive cells response to the environment. The overall goal of the thesis was to identify the signaling pathways responsible for the development of beta cell mass during postnatal development, pregnancy and obesity. Identification of these signaling pathways may help in understanding the functional beta cell mass demise induced by the diabetogenic environment (e.g oxidized LDL, hyperglycemia, hyperlipidemia, etc.) in diabetic patients. By investigating beta cell mass plasticity in 10 day old neonate rats, we found a significant increase in the expression of Dual Leucine Zipper Kinase (DLK) protein when compared to islets from adult rats. In islets of pups, the increase of DLK expression coincides with a very high proliferative rate of beta cells and activation of "cJun-amino terminal Kinase 3" (JNK3) signaling, an STK belonging to “mitogen activated protein kinase” (MAPKs) family. As observed for DLK, in islets of rat pups, the genetic disruption of JNK3 drastically reduces the number of beta cells leading to glucose intolerance. Finally, we also observed that MAPKs link oxidized LDL to beta cell death via mechanisms involving endoplasmic reticulum stress and oxidative stress. Our results show the critical importance of MAPK signaling in controlling beta cell survival and proliferation in response to physiological condition and diabetes.

La mycotoxine déoxynivalénol (DON) et son métabolite déépoxy-déoxynivalenol (DOM-1) ont des effets significatifs sur la modification de la fonction des cellules thècales de l’ovaire bovin. L'objectif de cette étude était d'identifier les différentes voies de signalisation impliquées dans le mécanisme d'action de DON et DOM-1 par la spectrométrie de masse. Méthodes: Les cellules thécales de l'ovaire bovin ont été récoltées à partir des vaches adultes, indépendamment du stade du cycle œstral, et ont été cultivées à une densité de 500000 cellules viables dans 1 ml de milieu de McCoy pendant 5 jours. Les cellules ont ensuite été traitées au jour 5 de la culture avec 1 ng/ml de DON ou DOM-1 pendant 30 minutes et des échantillons cellulaires de protéins totales ont été préparés pour spectrométrie de masse. Résultats: la spectrométrie de masse a montré que DON et DOM-1 induisent une surexpression simultanée de ERK1/2, MAPK14 (p38alpha) et MAPK13 (p38delta). La spectrométrie de masse a également indiqué que 94 peptides ont été surexprimés tels que GNGT1, EDN1 et YWHAB. Ils régulent la plupart des voies de prolifération des cellules et sont impliqués dans la biosynthèse des lipides et des glucides. Néanmoins, 255 peptides ont été régulés à la baisse, tels que CALR3, PTGES3, RAD21, ACVR2B et TGFBR1 dont leurs activités sont principalement l'activation ou la désactivation des processus apoptotiques, et le métabolisme du glucose et de la choline. Nos résultats montrent que DON et DOM-1, à une dose de 1 ng/ml, ont le potentiel de stimuler la surexpression de MAPK distinctes et réguler négativement les voies de signalisation spécifiques qui stimulent la prolifération les cellules de la thèque de l’ovaire de bovin. / The mycotoxin deoxynivalenol (DON) and its metabolite deepoxy-DOM-1 have significant effects on bovine ovarian theca cell function. The objective of this study was to identify different signaling pathways involved in the mechanism of action of DON and DOM-1 by mass spectrometry. Methods: bovine ovarian theca cells were harvested from adult cows independently of the stage of the estrous cycle, and were cultured at a density of 500000 viable cells in 1 ml McCoy’s medium for 5 days. The cells were then treated on day 5 of culture with 1 ng/mL DON or DOM-1 for 30 minutes and total cell protein was collected for mass spectrometry. Results from mass spectrometry showed that both DON and DOM-1 induce simultaneous upregulation of ERK1/2 , MAPK14 (p38alpha) and MAPK13 (p38delta). Mass spectrometry also indicated that 94 peptides such as GNGT1, EDN1 and YWHAB were upregulated. They mostly regulate cell proliferation pathways and are involved in biosynthesis of lipid and carbohydrates. Nevertheless, 255 peptides such as CALR3, PTGES3, RAD21, ACVR2B and TGFBR1 were downregulated whose activities are mainly activation or deactivation of apoptotic processes, and glucose and choline metabolism. Our findings show that both DON and DOM-1 at least at a low dose (1 ng/ml) have the potential to stimulate upregulation of distinct MAPKs and downregulate specific signaling pathways that stimulate bovine ovarian theca cell proliferation.

Ce projet consiste à fractionner le Sérum Foetal Bovin (FBS) dans l'espoir de découvrir de nouveaux facteurs mitogéniques. Une plateforme de séparation a été conçue comprenant différentes techniques de manière itérative séquentielle: l'utilisation d'agents chaotropiques suivie par l'ultrafiltration et la chromatographie d'échange d'anions. Les fractions obtenues sont testées pour leur effet sur l'expansion cellulaire, individuellement et en combinaison selon une méthode de planification statistique des expériences (DOE). Le rétentat du FBS dénaturé avec l'urée a été identifié comme la fraction la plus prometteuse par rapport à la prolifération des cellules précurseurs de muscle et a été séparé dans une seconde étape par échange anionique produisant cinq fractions différentes. Le traitement d'images a été utilisé afin de réduire le temps, l'effort, et l'erreur, associés à l'application de l'hémaecytomètre pour les comptes cellulaires. L'analyse par electrophorèse sur gel a également été réalisée afin d'identifier les facteurs enjeu dans ce liquide biologique.

Les performances reproductrices des espèces d’intérêt agronomique sont dépendantes d’une régulation minutieuse de la folliculogenèse ovarienne. Parmi les régulateurs impliqués, il y a les facteurs de croissance fibroblastiques (FGFs), stimulant notamment la phosphorylation des protéines kinases activées par des agents mitogènes (MAPKs), afin de contrôler le devenir du follicule mais aussi les évènements qui y sont associés tels que la stéroïdogenèse, l’angiogenèse, la formation du corps jaune. Dans plusieurs types cellulaires non ovariens, des phosphatases à double spécificité (DUSPs), dont l’expression est induite en réponse à des facteurs de croissance, déphosphorylent les MAPKs. La présence et la régulation des DUSPs dans l’ovaire des mammifères est cependant peu documentée. Ces travaux de thèse avaient ainsi pour objectifs, (1) de déterminer la présence des DUSPs, (2) leur régulation par les FGFs et (3) leur rôle dans les cellules de granulosa de vache et de brebis. Dans la première étude effectuée chez la brebis, les ARNm codant pour 16 DUSPs ont été détectés, et leur profil d’expression a été dressé dans des cellules de granulosa issues de follicules antraux. Puis, les niveaux d’ARNm pour DUSP1, DUSP2, DUSP5 et DUSP6, ainsi que les niveaux de protéines pour DUSP1 et DUSP6 ont été augmentés par FGF2 mais pas par FGF8 ou FGF18. L’inhibition de DUSP1/6 et DUSP1 a également suggéré un rôle pour DUSP6 dans la déphosphorylation de MAPK8 chez la brebis. Avec la deuxième étude chez la vache, il ressort que la régulation de ces trois DUSPs semble bien conservée car les niveaux d’ARNm pour DUSP1, DUSP5 et DUSP6 et de protéines pour DUSP5 et DUSP6 ont été augmentés en réponse à FGF2. De plus, en s’intéressant au contrôle de l’expression de DUSP1, DUSP5 et DUSP6, il est ressorti que l’accumulation d’ARNm pour DUSP5 et DUSP6 nécessitait l’activation de MAPK3/1, et la signalisation calcique pour les ARNm pour DUSP6. D’après l’ensemble de ces données, DUSP1, DUSP5 et DUSP6 sont régulées de manière complexe dans les cellules de granulosa, et peuvent être désignées comme des phosphatases participant à la signalisation des FGFs ; cela contribue ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes régulatoires de la folliculogenèse chez les ruminants. / The reproductive performance of species of agronomic interest is dependent on the careful regulation of ovarian folliculogenesis. Among the regulators involved are fibroblast growth factors (FGFs) that stimulate the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) to control the fate of the follicle and associated events such as steroidogenesis, angiogenesis and corpus luteum formation. In several non-ovarian cell types, dual specificity phosphatases (DUSPs), whose expression is induced in response to growth factors, dephosphorylate MAPKs. However, the presence and regulation of DUSPs in the mammalian ovary are poorly documented. The objectives of this thesis were (1) to determine the presence of DUSPs, (2) their regulation by FGFs and (3) their role in cow and sheep granulosa cells. In the first study in sheep, mRNAs encoding 16 DUSPs were detected and profiled in granulosa cells from antral follicles. Subsequently, DUSP1, DUSP2, DUSP5 and DUSP6 mRNA levels, as well as proteins for DUSP1 and DUSP6, were increased by FGF2 but not FGF8 or FGF18. Inhibition of DUSP1/6 and DUSP1 also suggested a role for DUSP6 in the dephosphorylation of MAPK8 in sheep. In the second study in the cow, the regulation of these three DUSPs appeared to be well conserved as DUSP1, DUSP5 and DUSP6 mRNA levels and DUSP5, DUSP6 protein levels were increased in response to FGF2. In addition, by focusing on the control of DUSP1, DUSP5 and DUSP6 expression, it was found that the accumulation of DUSP5 and DUSP6 mRNAs required the activation of MAPK3/1, and calcium signaling for DUSP6 mRNA. Taken together, these data suggest that DUSP1, DUSP5 and DUSP6 are regulated in a complex manner in granulosa cells, and can be designated as phosphatases involved in FGF signaling, thus contributing to a better understanding of the regulatory mechanisms of folliculogenesis in ruminants.