La stérilité affecte à l’heure actuelle près de 15-20 % des couples et sa prévalence est en progression depuis quatre à cinq décennies. Cette progression évolue parallèlement à la prévalence de l’épidémie d’obésité et de syndrome métabolique dans le monde. De multiples arguments physiologiques et épidémiologiques chez l’Homme soutiennent l’hypothèse de l’influence de l’homéostasie des lipides sur la fonction gonadique. En particulier, le cholestérol est un facteur clef dans la régulation de la stéroïdogenèse et de la gamétogenèse. Bien que les atteintes gonadiques semblent multifactorielles, les mécanismes moléculaires restent méconnus dans la majorité des cas. Les Liver X receptors (LXRα et β) sont des récepteurs nucléaires activés par les oxystérols. Ce sont classiquement des régulateurs du métabolisme lipidique. Plusieurs études ont démontré l’importance de ces récepteurs dans la physiologie des gonades. Ce travail identifie les rôles multiples des LXRs dans le maintien de la fertilité masculine et féminine, et décrit l’effet de l’homéostasie du cholestérol sur la maturation des cellules germinales dans le testicule et l’ovaire. Ce travail se concentre sur l’analyse comparative d’une lignée de souris ré-exprimant LXRβ (Lxrαϐ-/-:AMHLxrϐ) sous contrôle de promoteur d’AMH humain (expression spécifique dans les cellules de Sertoli dans le testicule et les cellules de granulosa dans l’ovaire) sur un fond génétique de souris Lxrαϐ-/-. L’absence d’un isoforme d LXR aboutit à des défauts spécifiques dans un type cellulaire du testicule. Néanmoins, le dysfonctionnement d’un type cellulaire est compensé. En effet, de multiples défauts sont nécessaires pour aboutir à la stérilité. LXR dans les cellules de granulosa est critique pour la maturation et la survie des ovocytes, l’ovulation, et par conséquence pour la fertilité. Ainsi, LXRβ est une cible potentielle pour réguler la fertilité féminine et la prévention de syndrome d’hyperstimulation ovarienne. Nos résultats ouvrent des perspectives pour des nouvelles cibles diagnostiques et pronostiques dans la fertilité. / Sterility affects 15 % of French population and its prevalence is propagating since four or five decades. Many human physiological and epidemiological arguments support the impact of lipid homeostasis on the gonads; indeed, cholesterol is a key regulator of steroidogenesis and gametogenesis. Nevertheless, the molecular mechanisms remain hidden. Liver X receptors alpha and beta (LXRα and β) belong to the superfamily of nuclear receptors and are activated upon binding to oxysterols. LXRs are mainly implicated in cholesterol homeostasis. Increasing bulk of literature identified these non-steroid nuclear receptors as major regulators of the gonad physiology. This work uncovers previously unidentified putative roles of LXRs and ability of cholecterol excess to alter male and female germ cell maturation. Herein, we analyse a new mouse strain (Lxrαϐ-/-:AMHLxrϐ) re-expressing LXRβ under control of AMH promoter (specific to Sertoli in testis and granulosa cells in ovary) in a background of Lxrαϐ-/- mouse. Our results identify LXRs as primordial to maintain male and female fertility. They have pleotropic « non-classical » roles ranging from lipid homeostasis to the regulation of germ cell maturation and bi-directional control of steroid synthesis. If the cellular defects in the absence of LXRs within the testis are significant, they are generally compensated and consequently, single cell compartment is tolerated. Unlike the testis, LXRβ in the granulosa cells is « the regulator » of multiple mechanisms essential for follicle maturation, ovocyte survival and for controlled ovulation. LXRβ is therefore a potnetial target to regulate female fertility and to prevent ovarian hyperstimulation syndrome. Our results open the perspectives for the identification of new diagnostic and/or prognostic markers in both male and female fertility.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La régulation transcriptionnelle des gènes est un processus indispensable sans lequel la diversité phénotypique des cellules ainsi que l’adaptation à leur environnement serait inexistant. L’identification des éléments de régulation dans le génome est d’une importance capitale afin de comprendre les mécanismes gouvernant l’expression des gènes spécifiques à un type cellulaire donné. Ainsi, suite au pic de LH, le follicule ovarien entre dans un programme intensif de différentiation cellulaire, orchestré par des modifications majeures du profile transcriptionnel des cellules de granulosa, déclenchant ultimement l’ovulation et la lutéinisation, processus indispensables à la fertilité femelle. L’hypothèse supportée par cette étude stipule qu’une réorganisation de la structure chromatinienne survient aux régions régulatrices d’une panoplie de gènes dans les heures suivant le pic de LH et qu’en isolant et identifiant ces régions, il serait possible de retrouver des éléments essentiels aux processus d’ovulation et de lutéinisation. Ainsi, en utilisant un protocole standard de superovulation chez la souris, les éléments de régulation se modifiant 4h suivant l’administration de hCG ont été isolés et identifiés dans les cellules de granulosa en utilisant la méthode FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combinée à un séquençage haut débit. Cette étude a démontré que suite au stimulus ovulatoire, les cellules de granulosa subissent une reprogrammation majeure des éléments de régulation, qui est corrélée avec une modification drastique de leurs fonctions biologiques. De plus, cette étude a mis en évidence une association majoritaire des éléments de régulation à des régions intergéniques distales et à des introns, indiquant que ces régions ont une importance capitale dans la régulation transcriptionnelle dans les cellules de granulosa. Cette étude a également permis d’identifier une panoplie de régulateurs transcriptionnels reconnus pour être essentiels à la fonction ovarienne, ainsi que leur sites de liaison dans le génome, démontrant que la méthode FAIRE est une méthode assez puissante pour permettre la prédiction d’événements moléculaires précis ayant un sens physiologique réel. / Identification of regulatory elements in the genome is of paramount importance to understanding the mechanisms governing the expression of specific genes in a given cell type. Following the LH surge, the ovarian peri-ovulatory follicle enters an intensive program of cellular differentiation, orchestrated by major changes in the transcriptional profile of granulosa cells, ultimately triggering ovulation and luteinization, processes essentials for fertility in females. In the mouse, several genes essential to the success of this program are induced 2 to 6 hours after the ovulatory stimulus. Using a standard protocol for superovulation in mice, the regulatory elements were isolated and identified in granulosa cells 4h after administration of hCG using the method FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combined with next generation sequencing. The results of this analysis demonstrate that after the ovulatory stimulus, granulosa cells undergo a major reprogramming of regulatory elements, which is correlated with the extensive changes in their biological functions. In addition, this study showed that most regulatory elements were associated with distal intergenic regions and introns, indicating that these regions are important in transcriptional regulation in granulosa cells. A variety of transcriptional regulators known to be essential for ovarian function, and their binding sites were also identified in this analysis, demonstrating that the FAIRE method has the power to predict molecular events that have correlates in the known physiology of ovarian processes.

No description available.

La régulation transcriptionnelle des gènes est un processus indispensable sans lequel la diversité phénotypique des cellules ainsi que l’adaptation à leur environnement serait inexistant. L’identification des éléments de régulation dans le génome est d’une importance capitale afin de comprendre les mécanismes gouvernant l’expression des gènes spécifiques à un type cellulaire donné. Ainsi, suite au pic de LH, le follicule ovarien entre dans un programme intensif de différentiation cellulaire, orchestré par des modifications majeures du profile transcriptionnel des cellules de granulosa, déclenchant ultimement l’ovulation et la lutéinisation, processus indispensables à la fertilité femelle. L’hypothèse supportée par cette étude stipule qu’une réorganisation de la structure chromatinienne survient aux régions régulatrices d’une panoplie de gènes dans les heures suivant le pic de LH et qu’en isolant et identifiant ces régions, il serait possible de retrouver des éléments essentiels aux processus d’ovulation et de lutéinisation. Ainsi, en utilisant un protocole standard de superovulation chez la souris, les éléments de régulation se modifiant 4h suivant l’administration de hCG ont été isolés et identifiés dans les cellules de granulosa en utilisant la méthode FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combinée à un séquençage haut débit. Cette étude a démontré que suite au stimulus ovulatoire, les cellules de granulosa subissent une reprogrammation majeure des éléments de régulation, qui est corrélée avec une modification drastique de leurs fonctions biologiques. De plus, cette étude a mis en évidence une association majoritaire des éléments de régulation à des régions intergéniques distales et à des introns, indiquant que ces régions ont une importance capitale dans la régulation transcriptionnelle dans les cellules de granulosa. Cette étude a également permis d’identifier une panoplie de régulateurs transcriptionnels reconnus pour être essentiels à la fonction ovarienne, ainsi que leur sites de liaison dans le génome, démontrant que la méthode FAIRE est une méthode assez puissante pour permettre la prédiction d’événements moléculaires précis ayant un sens physiologique réel. / Identification of regulatory elements in the genome is of paramount importance to understanding the mechanisms governing the expression of specific genes in a given cell type. Following the LH surge, the ovarian peri-ovulatory follicle enters an intensive program of cellular differentiation, orchestrated by major changes in the transcriptional profile of granulosa cells, ultimately triggering ovulation and luteinization, processes essentials for fertility in females. In the mouse, several genes essential to the success of this program are induced 2 to 6 hours after the ovulatory stimulus. Using a standard protocol for superovulation in mice, the regulatory elements were isolated and identified in granulosa cells 4h after administration of hCG using the method FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combined with next generation sequencing. The results of this analysis demonstrate that after the ovulatory stimulus, granulosa cells undergo a major reprogramming of regulatory elements, which is correlated with the extensive changes in their biological functions. In addition, this study showed that most regulatory elements were associated with distal intergenic regions and introns, indicating that these regions are important in transcriptional regulation in granulosa cells. A variety of transcriptional regulators known to be essential for ovarian function, and their binding sites were also identified in this analysis, demonstrating that the FAIRE method has the power to predict molecular events that have correlates in the known physiology of ovarian processes.

L'efficacité de la reproduction bovine a considérablement diminué dans les dernières décennies et cette diminution constitue un problème économique majeur. Pour mieux contrer ce problème, la physiologie des cellules stéroïdogéniques ovariennes dont les cellules de granulosa (CG) doit être mieux comprise au cours des dernières étapes de la croissance folliculaire, de l'ovulation et de la lutéinisation. En ce sens, nous avons précédemment identifié divers gènes induits dans les CG des follicules ovulatoires bovins par la LH/hCG incluant Ankyrin-repeat and SOCS-box protein 9 (ASB9). Cependant, les mécanismes d’action d’ASB9 dans les CG étaient encore indéfinis. Les objectifs de cette étude étaient d'élucider le rôle d'ASB9 dans les CG ainsi que ses effets sur ses partenaires spécifiques PAR1, TSG6 et TAOK1. Un modèle in vivo de CG provenant de follicules à différentes phases de développement: petits follicules (SF), follicules dominants (DF) et follicules ovulatoires (OF), et un modèle in vitro de CG en culture ont été utilisées. L'inhibition d’ASB9 dans les CG via CRISPR/Cas9 a montré une augmentation significative de PAR1, PCNA, CCND2 et CCNE2 et une diminution significative de TAOK1, TSG6 et CASP3. Dans le modèle in vivo, PAR1 a été différentiellement exprimé dans DF et TSG6 et TAOK1 ont été induits dans OF. L'inhibition de l'ASB9 a aussi entraîné une diminution de l'apoptose des CG et de l'activité caspase3/7. Des analyses Western blot ont démontré que l'induction d'ASB9 dans OF, après l'injection d'hCG, était concomitante avec une diminution significative des niveaux de phosphorylation de MAPK3/1 tandis que pMAPK3/1 augmentait après l'inhibition d'ASB9. Ces résultats supportent qu'ASB9 pourrait être un régulateur de l'activité et de la fonction des CG en ciblant des protéines spécifiques qui affectent la signalisation MAPK, limitant la prolifération des CG. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de l’activité ovarienne et de la reproduction bovine. / The efficiency of bovine reproduction has considerably decreased in recent decades and this decrease constitutes a major economic problem. To better counter this problem, the physiology of ovarian steroidogenic cells including granulosa (CG) cells needs to be better understood during the later stages of follicular growth, ovulation and luteinization. In this sense, we have previously identified various genes induced in the CGs of bovine ovulatory follicles by LH / hCG including Ankyrin-repeat and SOCS-box protein 9 (ASB9). However, ASB9 mechanisms of action in GC were still undefined. The objectives of this study were to elucidate the role of ASB9 in CG as well as its effects on target partners PAR1, TSG6 and TAOK1, and on MAPK signaling. An in vivo model of GC from follicles at different developmental stages: small follicles (SF), dominant follicles (DF), and ovulatory follicles (OF) and an in vitro model of cultured GC along with the CRISPR/Cas9 approach to inhibit ASB9 were used. Inhibition of ASB9 in GC resulted in significant increase in PAR1, PCNA, CCND2, and CCNE2 and significant decrease in TAOK1, TNFAIP6, and CASP3 expression. From in vivo samples, PAR1 was differentially expressed in DF as compared to OF while TSG6 and TAOK1 were induced in OF. Further analyses showed an increase in GC number and a decrease in apoptosis and caspase3/7 activity following ASB9 inhibition. Western blot analyses demonstrated that ASB9 induction in OF by hCG was concomitant with a significant decrease in MAPK3/1 phosphorylation levels while pMAPK3/1 increased following ASB9 inhibition. These results provide strong evidence that ASB9 is a regulator of GC activity and function by modulating MAPK signaling pathway likely through specific binding partners such as PAR1, therefore controlling GC proliferation. These results contribute to a better understanding of ovarian activity and bovine reproduction.

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Janus kinase 3 (JAK3) est un membre de la famille JAK de protéines tyrosine kinase impliquées dans la transduction du signal intracellulaire médiée par les récepteurs de cytokines via la voie de signalisation JAK/STAT. JAK3 s'est avéré exprimé de manière différentielle dans les cellules de la granulosa (GC) des follicules pré-ovulatoires bovins et régulé à la baisse par l'hormone lutéinisante. Ces observations suggèrent que la régulation de JAK3 pourrait moduler la prolifération des GC, l'activité stéroïdienne et l'activation/l'inhibition des cibles en aval. Pour étudier les mécanismes des actions de JAK3 dans GC, nous avons utilisé JANEX-1, un inhibiteur pharmacologique de JAK3, et des traitements FSH et analysé des marqueurs de prolifération, des enzymes stéroïdogènes et la phosphorylation de protéines cibles, y compris STAT3 et les partenaires JAK3 précédemment identifiés CDKN1B/p27Kip1 et MAPK8IP3/JIP3. Les GC en culture ont été traités avec ou sans FSH en présence ou non de JANEX-1. L'ARN total et les protéines ont été extraits et analysés par RT-qPCR, western blot et UHPLC-MS/MS. L'expression de l'enzyme stéroïdogène CYP11A1, mais pas du CYP19A1, était significativement régulée à la hausse dans les GC traités avec la FSH et les deux étaient significativement diminuées lorsque JAK3 était inhibé par rapport au contrôle. Les marqueurs de prolifération CCND2 et PCNA ont été significativement réduits dans les GC traités au JANEX-1 et régulés positivement par la FSH. Les analyses Western blots ont montré que le traitement JANEX-1 réduisait de manière significative les quantités de pSTAT3 tandis que la surexpression de JAK3 augmentait pSTAT3. De même, le traitement à la FSH a augmenté pSTAT3 même dans les GC traités au JANEX-1. Les analyses UHPLC-MS/MS ont montré une phosphorylation et des modifications supplémentaires de résidus d'acides aminés spécifiques dans JAK3 ainsi que ses partenaires de liaison CDKN1B et MAPK8IP3 révélant une activation ou une inhibition possible de JAK3 après des traitements FSH ou JANEX-1, respectivement. L'abondance de la protéine totale JAK3 a augmenté après le traitement par FSH et a diminué de manière significative, avec MAPK8IP3, dans le GC traité par JANEX-1, tandis que l'abondance totale de CDKN1B a été modifiée après FSH et augmentée après JANEX-1. Nous montrons que JAK3 influence l'activité GC par la phosphorylation de protéines cibles en réponse à des stimulations telles que la FSH, ce qui conduit à l'activation de JAK/STAT et module probablement d'autres voies de signalisation impliquant CDKN1B et MAPK8IP3. / Janus kinase 3 (JAK3) is a member of the JAK family of tyrosine kinase proteins involved in cytokine receptor-mediated intracellular signal transduction through the JAK/STAT signaling pathway. JAK3 was shown as differentially expressed in granulosa cells (GC) of bovine preovulatory follicles and downregulated by the luteinizing hormone. These observations suggested JAK3 regulation could modulate GC proliferation, steroidogenic activity and activation/inhibition of downstream targets. To investigate the mechanisms of JAK3 actions in GC, we used JANEX-1, a pharmacological JAK3 inhibitor, and FSH treatments and analyzed proliferation markers, steroidogenic enzymes and phosphorylation of target proteins including STAT3 and previously identified JAK3 partners CDKN1B/p27Kip1 and MAPK8IP3/JIP3. Cultured GCs were treated with or without FSH in the presence or not of JANEX-1. Total RNA and proteins were extracted and analyzed by RT-qPCR, western blotting and UHPLC-MS/MS. Expression of steroidogenic enzyme CYP11A1, but not CYP19A1, was significantly upregulated in GC treated with FSH and both were significantly decreased when JAK3 was inhibited as compared to control. Proliferation markers CCND2 and PCNA were significantly reduced in JANEX-1-treated GC and upregulated by FSH. Western blots analyses showed that JANEX-1 treatment significantly reduced pSTAT3 amounts while JAK3 overexpression increased pSTAT3. Similarly, FSH treatment increased pSTAT3 even in JANEX-1-treated GC. UHPLC-MS/MS analyses showed phosphorylation and additional modifications of specific amino acid residues within JAK3 as well as its binding partners CDKN1B and MAPK8IP3 revealing possible activation or inhibition of JAK3 following FSH or JANEX-1 treatments, respectively. Abundance of JAK3 total protein was increased post-FSH treatment and significantly decreased, along with MAPK8IP3, in JANEX-1-treated GC while CDKN1B total abundance was altered post-FSH and increased post-JANEX-1. We show that JAK3 influences GC activity through phosphorylation of target proteins in response to stimulations such as FSH, which leads to the activation of JAK/STAT and likely modulating other signaling pathways involving CDKN1B and MAPK8IP3.

Au cours des processus de croissance folliculaire et d'ovulation, les cellules stéroïdogéniques, y compris les cellules de granulosa (CG), jouent un rôle crucial dans la maturation et la libération de l'ovocyte. Notre laboratoire a identifié et caractérisé pour la première fois tribbles pseudokinase 2 (TRIB2) dans les CG de follicules ovariens. Des études ont démontré que TRIB2 joue un rôle dans la coordination de la mitose et la morphogenèse chez la drosophile alors que chez la souris, son expression dans les cellules du cumulus serait liée à la maturation ovocytaire. Cependant, le rôle exact de TRIB2 dans la fonction des CG et ses effets sur les voies de signalisation impliquées dans la croissance folliculaire restait à être défini. La présente étude de doctorat avait donc pour but d’étudier la fonction et les partenaires de liaison de TRIB2 dans les CG de follicules ovariens bovins. À l’aide d’un modèle d’étude in vivo consistant en des CG obtenues à partir de follicules à différents stades de développement, nous avons démontré une régulation à la baisse de TRIB2 par l’hormone lutéinisante (LH) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) aussi bien au niveau du messager que de la protéine. De plus, les analyses utilisant un modèle in vitro de CG en culture ont montré que la FSH stimule l'expression de TRIB2 tandis que l'inhibition de TRIB2 via CRISPR/Cas9 entraîne une réduction significative de la prolifération des CG (P<0,05). Les analyses Western blot ont montré une augmentation des niveaux de phosphorylation d’ERK1/2 (MAPK3/1) et p38MAPK (MAPK14) suite à la surexpression de TRIB2. Ces résultats suggèrent un rôle de TRIB2 dans la croissance folliculaire et la modulation des voies MAPK. Avec l’approche double hybride chez la levure, nous avons identifié CALM1, INHBA, INPPL1, NT5E, SCD, SDHB et RAB14 comme partenaires de liaison de TRIB2. Les analyses RT-PCR ont montré que ces partenaires sont régulés différemment au cours du développement folliculaire et les manipulations de l’expression de TRIB2 (inhibition ou surexpression) résulte en une régulation différente (augmentation ou diminution) de l’expression des partenaires dans les CG. Ces résultats suggèrent un rôle de TRIB2 dans la régulation de cibles effectrices en lien avec la fonction des CG et le développement folliculaire. Enfin, un modèle de CG provenant de vaches en période post-partum a été utilisé pour mieux comprendre le contrôle de l’activité des CG. Des analyses complémentaires avec ce modèle ont révélé une réduction significative de TRIB2 chez les vaches ayant un taux élevé de BHB (>1.4mmol/L) comparé à celles ayant un faible taux de BHB (<1.2mmol/L). Cette réduction était concomitante à une augmentation d’interleukines pro-inflammatoires et une réduction d’interleukines anti-inflammatoires dans les CG. L’ensemble de ces résultats supporte un rôle de TRIB2 dans la modulation de la signalisation MAPK dans les CG, apporte une preuve solide que TRIB2 pourrait agir comme un régulateur de la prolifération et de la fonction des CG et de l’expression de gènes cibles, et suggère que TRIB2 pourrait affecter la stéroïdogenèse au cours du développement folliculaire et lors de la période post-partum. / During the processes of follicular growth and ovulation, steroidogenic cells, including granulosa cells, play a crucial role in the maturation and release of the oocyte. Our lab identified and characterized for the first time tribble pseudokinase 2 (TRIB2) in GC of ovarian follicles. Previous studies have shown that TRIB2 plays a role in the coordination of mitosis and morphogenesis in Drosophila while in mice its expression in cumulus cells is linked to oocyte maturation. However, the exact mechanism of action of TRIB2 as well as its function and effects on signaling pathways in GC during follicular growth remained to be defined. This study aimed therefore to further investigate TRIB2 function and identify its binding partners in GC. TRIB2 inhibition and overexpression experiments were conducted using, respectively, CRISPR/Cas9 technology and the pQE1 system. Using an in vivo model consisting of GC obtained from follicles at different stages of development, we demonstrated a downregulation of TRIB2 by the endogenous luteinizing hormone (LH) and human Chorionic Gonadotropin (hCG) at both the messenger and protein levels. In addition, analyzes using an in vitro model of cultured GC, we showed that FSH stimulates the expression of TRIB2 while inhibition of TRIB2 via CRISPR-Cas9 resulted in a significant reduction in GC proliferation (P<0.05). Western blot analyzes showed an increase in the phosphorylation levels of ERK1/2 (MAPK3/1) and p38MAPK (MAPK14) following TRIB2 overexpression. These results suggested a role of TRIB2 in follicular growth and modulation of MAPK pathways. In the second part of the thesis, we identified CALM1, INHBA, INPPL1, NT5E, SCD, SDHB and RAB14 as binding partners of TRIB2 in GC using the yeast two-hybrid approach. RT-qPCR analyzes showed that all of these partners are present in the dominant follicles but are differently regulated during follicular development. Moreover, TRIB2 manipulation (inhibition or overexpression) results in a different regulation (up- or down-regulation) of these partners expression in GC. These results suggest a role of TRIB2 in the regulation of effector targets genes related to follicular development and GC activity. In the third part of the thesis, a GC model from postpartum cows was also used to better understand the control of GC activity. Further analyses using this model revealed a significant decrease of TRIB2 in cows with high level of BHB (>1.4 mmol/L) as compared to those with a low BHB levels (<1.2 mmol/L). This reduction of TRIB2 was concomitant with an increase in pro-inflammatory interleukins and a reduction in anti-inflammatory interleukins in GC. Overall, these results support a role of TRIB2 in the modulation of MAPK signaling in GC, provide strong evidence that TRIB2 could act as a regulator of GC proliferation and function as well as expression of target genes in GC, and suggests that TRIB2 might affect steroidogenesis during follicular development and during the post-partum period.