Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'utilisation récente des nanoparticules (NPs) comme vecteurs pour l'imagerie et l'adressage d'agents thérapeutiques en nano-médecine nécessite la compréhension de leurs mécanismes d'internalisation et de transport au niveau des barrières biologiques. Dans ce contexte, l'objectif de cette étude est de caractériser l'interaction et la transcytose de NPs de silice fluorescentes en fonction de leur taille (15, 50 et 100 nm) dans un modèle in-vitro de barrière endothéliale pulmonaire humaine. L'internalisation et le transport trans-endothélial des NPs a été analysé quantitativement à l'échelle nanométrique par microscopie électronique à transmission (MET) combinée à de la stéréologie. Un transport trans-endothélial a été observé pour toutes les tailles de NPs. Néanmoins, l'analyse de la distribution intracellulaire révèle une tendance à l'accumulation dans les voies de dégradation cellulaires pour les NPs de 50 et 100 nm. Cette accumulation est moindre pour les NPs de 15 nm. L'internalisation des NPs a également été analysée par cytométrie en flux et MET en présence de différents inhibiteurs de l'endocytose dans le but d'identifier leurs voies d'internalisation. En fonction de la taille des NPs, les mécanismes d'endocytose varient, suggérant une dépendance du transport trans-cellulaire à certains mécanismes d'endocytose. L'internalisation des NPs de 15 nm par la voie d'endocytose cavéole dépendante pourrait ainsi expliquer l'efficacité de leur transport du côté basal. Les méthodologies développées pour l'étude du transport trans-cellulaire des NPs de silice peuvent être appliquées à l'étude de NPs synthétiques plus complexes ou de NPs biologiques, telles que les lipoprotéines de basse-densité, et ce dans un contexte pathologique. / The recent use of nanoparticles (NPs) as carriers for imaging and delivery of therapeutics agents in nanomedecine involves understanding their endocytosis and transcytosis mechanisms at biological barriers. In this context, the aim of this study was to characterize the interaction and transcytosis of fluorescent silica NPs in function of their size (15, 50, and 100 nm) in an in-vitro model of human pulmonary endothelial barrier. NPs internalization and trans-endothelial transport has been quantitatively analyzed at nanometer resolution using transmission electron microscopy (TEM) combined with stereology. Trans-endothelial transport has been observed for each size of NPs. However cellular distribution analysis shows an accumulation in the cellular degradation pathways for 50 nm and 100 nm NPs. Whereas 15 nm NPs are less accumulated. NPs uptake was also analyzed by flow cytometry and TEM in the presence of different inhibitors to decipher NPs internalization pathways. Depending on NPs size, the involved endocytosis pathways were different, suggesting a dependency of trans-cellular transport toward endocytic mechanisms. The specific internalization of 15 nm NPs by the caveolin dependant pathway could explain the efficacy of their release at the basal side. Techniques developed for the study of the trans-cellular transport of silica NPs can also be applied to more complex synthetic NPs or biological NPs, such as low-density lipoproteins, in a pathological context.

Afin d'identifier de nouvelles cibles organo-spécifiques de l'endothélium, nous avons comparé l'expression de gènes entre deux lignées de hautes cellules endothéliales et mis en évidence la protéine ARM-1. Des expériences de RT-PCR ont montré une expression spécifique d'ARM-1 dans certaines lignées de cellules endothéliales et de lymphocytes. La surexpression d'ARM-1 dans des cellules endothéliales de peau, n'exprimant pas cette protéine, augmente de façon préférentielle l'adhésion de certaines lignées lymphocytaires sur ces cellules. Ceci renforce l'hypothèse d'un rôle particulier d'ARM-1 au sein des cellules endothéliales. Une étude de fractionnement cellulaire a montré qu'ARM-1 était une protéine sécrétée, pouvant être associée à la membrane. Des expériences d'immunolocalisation n'ont cependant démontré aucune expression d'ARM-1 à la surface cellulaire. Ces résultats suggèrent une action indirecte d'ARM-1 dans l'adhésion plutôt qu'un rôle direct en tant que molécule d'adhésion.

Les cellules endothéliales (CE), monocouche de cellules hexagonales jointives situées à la face interne de la cornée, assurent la transparence de ce tissu essentiel à la vision. Peu avant la naissance, ces CE perdent leur capacité proliférative en restant bloquées en phase G1du cycle cellulaire. Le non remplacement des cellules mortes est responsable de certaines pathologies cécitantes dont la cornea gutatta et les dystrophies bulleuses du pseudophaque sont les prototypes et comptent parmi les premières indications de greffe de cornée. Les mécanismes moléculaires impliqués dans l'arrêt de la prolifération de ces CE restent très partiellement expliqués. La première partie de cette thèse a pour objectif d'identifier si des changements d'expression transcriptionnelle des gènes régulateurs du cycle cellulaire interviennent au cours de l'organoculture (OC) et de la culture in vitro, afin de définir au mieux les cibles potentielles à inhiber ou celles à surexprimer pour re-déclencher une prolifération cellulaire contrôlée. Pour la première fois, nous avons mis en évidence des profils transcriptionnels variables en fonction de l'environnement des CE, avec une activation globale de l'expression des gènes en OC de routine et en culture primaire et l'expression accrue de gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire en différents points comme DIRAS3, GADD45A, p15 p16, p18 et p19 ou impliqués dans la régulation du cycle des CE comme le complexe ubiquitine/protéasome (culines, APC...), laissant supposer que les freins antiprolifératifs sont encore plus complexes. Dans la seconde partie, nous avons développé une méthode d'analyse de la viabilité de l'endothélium pan-cornéenne afin d'évaluer au mieux la viabilité des cellules endothéliales sur les greffons. Nous avons développé un outil innovant de mesure combinant un triple marquage Hoechst/Ethidium/Calcéine AM à l'analyse pan-endothéliale permettant d'évaluer de définir la notion originale de densité en cellules viables d'une cornée. Cette technique peut être appliquée à l'analyse de n'importe quel procédé chirurgical ou non, susceptible d'altérer directement ou indirectement l'endothélium cornéen

L'endothélium vasculaire est la première couche de cellules en contact avec le flux sanguin. Au cours de processus pathologiques, les cellules endothéliales subissent des remaniements notoires dus à la présence de nombreux facteurs. Dans ce cas, l'intégrité de l'endothélium, assurée principalement par les jonctions adhérentes endothéliales dont la V(ascular)E(ndothelial)-cadhérine est la protéine clé, est perturbée. La phospho-VE-cadhérine est une caractéristique des cellules endothéliales activées in vitro. Notre laboratoire a montré l'existence d'une forme phosphorylée de VE-cadhérine in vivo au cours de l'angiogenèse physiologique. Des tyrosines importantes ont été identifiées : la tyrosine 685, qui est la cible directe de la tyrosine kinase Src en réponse au VEGF ainsi que les tyrosines 658 et 731. De plus, la VE-cadhérine peut être sensible à la protéolyse. Dans ce travail, la phosphorylation de la VE-cadhérine a été étudiée dans un contexte pathologique d'inflammation et de cancer à l'aide de deux modèles murins de tumeurs hépatiques ou cérébrales. J'ai démontré l'existence in vivo d'une forme phosphorylée de VE-cadhérine sur le site Y658. L'analyse d'une tyrosine kinase particulière, Syk, par si RNA ainsi que par des expériences de phosphorylation in vitro suggèrent fortement l'implication de SYK dans cette phosphorylation. En parallèle, dans le cadre d'une étude sur plusieurs pathologies, nous avons mis en évidence la présence d'une forme circulante de VE-cadhérine. La VE-cadhérine, tant par sa phosphorylation que par sa présence dans les fluides biologiques, pourrait être une signature de l'endothélium activé (phosphorylation) et/ou agressé (protéolyse).

Cardiac transplantation is governed by complex immunological mechanisms contributing to different types of allograft rejection. Early non-specific graft failure and chronic rejection (cardiac allograft vasculopathy) represent the main limitations for the recipients’ short- and long-term survival respectively. To date, the pathogenesis of both rejection types remains ill-defined. However, it is believed that they are related to an immunologically mediated potent inflammatory process, occurring whether early after transplantation (acute), or lasting for the lifetime of the graft (chronic). The initiating mechanisms of chronic rejection in solid organ transplantation remain ill-defined. Emerging evidence sustains that graft vasculopathy is primarily driven by alloreactive CD4+ T lymphocytes sensitized by the indirect pathway of allorecognition. To date, whereas the nature of APCs involved in this particular pathway has yet to be identified, it appears challenging to speculate that recipient-derived endothelial cells (ECs) repopulating the graft may represent the main cell targets recognized by indirectly primed alloreactive CD4+ T cells to mediate the rejection of cardiac transplants. In the first part of this thesis, we specifically studied the indirect pathway of allorecognition with a transgenic mice (Marilyn mice) model that expresses a T cell receptor (TCR) transgene which recognizes the male antigen H-Y in an I-Ab-restricted fashion. Our results provide evidence that graft endothelium replacement by recipient-type cells expressing MHC Class II molecules is required for the chronic rejection of vascularized cardiac transplants mediated by indirect pathway alloreactive CD4+ T cells. The purpose of the second part of the thesis was to investigate the potential implication of interleukin-22 (IL-22), an early phase secreted proinflammatory cytokine of the IL-10 family, in the acute rejection of cardiac allografts. IL-22 was recently described as an effector key modulator of the inflammatory process produced mainly by differentiated CD4+ T cells of the Th17 lineage. As being closely related to IL-10 and IL-17, both involved in the rejection process of vascularized heart allografts, we attempted to determine the precise role of IL-22 in this process. Experiments were conducted with a recently developed murine model deficient for the IL-22 gene (IL-22KO). The results of the second part of the thesis show that IL-22 is not an effector cytokine in cardiac allograft rejection. In contrast, as being early expressed into the allograft, likely IL-22 plays a protective role in the inflammation leading to acute cardiac rejection, probably depending on a neutrophil-related mechanism. In conjunction with current understanding of inflammatory and antigen-specific events in allografts, overall, our results provide new insights into the mechanisms of chronic and acute cardiac rejection, thus prompting to further interrogations and appealing novel therapeutic strategies. Pharmacologic manipulation of endothelium is challenging. Given their capacity to sense and rapidly respond to the local environment, ECs are the ideal targets for rapid systemic delivery of therapeutic agents. Combination therapy is required to reduce inflammatory reaction and endothelial activation, to modulate endothelial dysfunction and promote endothelial survival. Also, given that IL-22 may alleviate tissue destruction during inflammatory responses, therapies that enhance its production and protective action in the transplanted organs seem attractive to specifically affect tissue responses, without exerting direct effects on the immune response.

La fonction de barrière de l'endothélium vasculaire est affectée par des modifications de la cadhérine des cellules endothéliales (VE-cadhérine) telles que la phosphorylation sur tyrosine dans son domaine cytoplasmique et le clivage de son domaine extracellulaire (sVE). Ce travail s'est articulé en deux parties : 1- Etude de ces modifications dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde (PR), et les mécanismes sous-tendus. Ce travail a permis de montrer que la VE-cadhérine est une cible du TNFα, une cytokine essentielle dans la PR, qui induit de la libération de sVE de façon dépendante de l'activité kinase de Src, suggérant l'implication d'un mécanisme de phosphorylation sur tyrosine dans ce processus. De plus, la VE-cadhérine est aussi la cible des protéases de la matrice extracellulaire telles que MMP-2. L'application de ces données fondamentales à la clinique a permis de montrer que sVE était retrouvée dans le sang de patients PR (n=63) et que son taux était corrélé à l'activité de la maladie. Ainsi, le dosage de sVE est d'intérêt dans la prise en charge des patients. 2-Etude de la phosphorylation de la VE-cadhérine dans un contexte d'angiogenèse hormono-régulée au cours du cycle ovarien chez la souris. Les résultats ont montré que le site Y685 de la VE-cadhérine est phosphorylé dans l'ovaire et l'utérus de souris de façon régulée pendant le cycle, ce qui permet de proposer ce modèle physiologique pour étudier la phosphorylation de la VE-cadhérine in vivo. L'analyse de souris knock-in Y685F de la VE-cadhérine (VE-Y685F) a montré que l'absence du site confère une perméabilité accrue dans l'ovaire et l'utérus mais aussi dans les petits capillaires de la peau. De plus, dans deux modèles d'induction d'arthrite, les souris VE-Y685F ont présenté un taux de sVE plus élevé que les contrôles. Au total, sVE et la phosphorylation de la VE-cadhérine ont un vaste champ d'application dans le traitement de la PR ainsi que pour le développement de nouvelles thérapies pouvant s'étendre à d'autres pathologies vasculaires.

Les maladies cardio-vasculaires demeurent une cause majeure de mortalité et morbidité dans les sociétés développées. La recherche de déterminants prédictifs d’évènements vasculaires représente toujours un enjeu d’actualité face aux coûts croissants des dépenses reliées aux soins médicaux et à l’élargissement des populations concernées, notamment face à l’occidentalisation des pays émergeants comme l’Inde, le Brésil et la Chine. La cardiologie nucléaire occupe depuis trente ans, une place essentielle dans l’arsenal des méthodes diagnostiques et pronostiques des cardiopathies. De plus, de nouvelles percées permettront de dépister d’une façon plus précoce et précise, la maladie athérosclérotique cardiaque et périphérique chez les populations atteintes ainsi qu’en prévention primaire. Nous présenterons dans cette thèse, deux approches nouvelles de la cardiologie nucléaire. La dysfonction endothéliale est considérée comme le signal pathologique le plus précoce de l’athérosclérose. Les facteurs de risques cardiovasculaires traditionnels atteignent la fonction endothéliale et peuvent initier le processus d’athérosclérose même en l’absence de lésion endothéliale physique. La quantification de la fonction endothéliale coronarienne comporte donc un intérêt certain comme biomarqueur précoce de la maladie coronarienne. La pléthysmographie isotopique, méthodologie développée lors de ce cycle d’étude, permet de quantifier la fonction endothéliale périphérique, cette dernière étant corrélée à la fonction endothéliale coronarienne. Cette méthodologie est démontrée dans le premier manuscrit (Harel et. al., Physiol Meas., 2007). L’utilisation d’un radiomarquage des érythrocytes permet la mesure du flot artériel au niveau du membre supérieur pendant la réalisation d’une hyperémie réactive locale. Cette nouvelle procédure a été validée en comparaison à la pléthysmographie par jauge de contrainte sur une cohorte de 26 patients. Elle a démontré une excellente reproductibilité (coefficient de corrélation intra-classe = 0.89). De plus, la mesure du flot artérielle pendant la réaction hyperémique corrélait avec les mesure réalisées par la méthode de référence (r=0.87). Le deuxième manuscrit expose les bases de la spectroscopie infrarouge comme méthodologie de mesure du flot artériel et quantification de la réaction hyperémique (Harel et. al., Physiol Meas., 2008). Cette étude utilisa un protocole de triples mesures simultanées à l’aide de la pléthysmographie par jauge de contrainte, radio-isotopique et par spectroscopie infrarouge. La technique par spectroscopie fut démontrée précise et reproductible quant à la mesure des flots artériels au niveau de l’avant-bras. Cette nouvelle procédure a présenté des avantages indéniables quant à la diminution d’artéfact et à sa facilité d’utilisation. Le second volet de ma thèse porte sur l’analyse du synchronisme de contraction cardiaque. En effet, plus de 30% des patients recevant une thérapie de resynchronisation ne démontre pas d’amélioration clinique. De plus, ce taux de non-réponse est encore plus élevé lors de l’utilisation de critères morphologiques de réponse à la resynchronisation (réduction du volume télésystolique). Il existe donc un besoin urgent de développer une méthodologie de mesure fiable et précise de la dynamique cardiaque. Le troisième manuscrit expose les bases d’une nouvelle technique radio-isotopique permettant la quantification de la fraction d’éjection du ventricule gauche (Harel et. al. J Nucl Cardiol., 2007). L’étude portant sur 202 patients a démontré une excellente corrélation (r=0.84) avec la méthode de référence (ventriculographie planaire). La comparaison avec le logiciel QBS (Cedar-Sinai) démontrait un écart type du biais inférieur (7.44% vs 9.36%). De plus, le biais dans la mesure ne démontrait pas de corrélation avec la magnitude du paramètre pour notre méthodologie, contrairement au logiciel alterne. Le quatrième manuscrit portait sur la quantification de l’asynchronisme intra-ventriculaire gauche (Harel et. al. J Nucl Cardiol, 2008). Un nouveau paramètre tridimensionnel (CHI: contraction homogeneity index) (médiane 73.8% ; IQ 58.7% - 84.9%) permis d’intégrer les composantes d’amplitude et du synchronisme de la contraction ventriculaire. La validation de ce paramètre fut effectuée par comparaison avec la déviation standard de l’histogramme de phase (SDΦ) (médiane 28.2º ; IQ 17.5º - 46.8º) obtenu par la ventriculographie planaire lors d’une étude portant sur 235 patients. Ces quatre manuscrits, déjà publiés dans la littérature scientifique spécialisée, résument une fraction des travaux de recherche que nous avons effectués durant les trois dernières années. Ces travaux s’inscrivent dans deux axes majeurs de développement de la cardiologie du 21ième siècle. / Cardiovascular diseases remain a major cause of mortality and morbidity in developed countries. The search for predictive determinants of vascular events represents a relevant and timely goal, considering the increasing costs of medical care and the progress in developing countries such as India, Brazil and China. Nuclear cardiology has, for 30 years, played an essential role in the diagnosis and prognosis of various cardiac and vascular diseases. Moreover, new developments will allow earlier and more specific detection of cardiac and peripheral atherosclerosis disease in affected individuals and in primary prevention. In this thesis, we will focus on advances in two major themes of nuclear cardiology. Endothelial dysfunction is regarded as the earliest pathological markers of atherosclerosis. Traditional cardiovascular risks factors impair endothelial function and can initiate the atherosclerosis process, even in the absence of overt endothelial disruption. Quantification of coronary endothelial function is, therefore, of considerable interest as an early biomarker for coronary disease. The radionuclide plethysmography methodology developed during the course of my doctoral studies allows the quantification of peripheral endothelial function, which has been correlated with coronary endothelial function. This methodology is detailed in the first manuscript (Harel et. al., Physiol Meas., 2007). The use of red blood cell radio-labeling permits arterial flow to be measured in the upper limb during local reactive hyperemia. This new procedure was validated against strain gauge plethysmography in a cohort of 26 patients with excellent reproducibility (intraclass coefficient of correlation = 0.89). Moreover, the arterial measurements of flow during the hyperemic reaction correlated well with the reference method (r=0.87). The second manuscript exposes the basis of infrared spectroscopy as a method for measuring arterial flow and quantifying the hyperemic reaction (Harel et. al., Physiol Meas., 2008). The study protocol consisted of simultaneous measurements by strain gauge, radionuclide and infrared spectroscopy plethysmography. The spectroscopy technique was shown to be precise and reproducible for forearm measurement of arterial blood flow. This novel procedure came major advantages in reducing artifacts and in its ease of use. The second axis of my thesis relates to the analysis of cardiac contraction synchrony. Indeed, more than 30% of patients receiving resynchronization therapy do not show clinical improvement. Moreover, this non-response rate is even higher if we consider morphological criteria of resynchronization (end-systolic volume reduction). There is therefore, an urgent need to improve a methodology to reliably and precisely measure cardiac dynamics so as to identify and monitor potential responders. The third manuscript exposes the basis of a new radionuclide technique to quantify left ventricle ejection fraction (Harel et. al. J Nucl Cardiol., 2007). The study of 202 patients showed an excellent correlation (r=0.84) with the reference method (planar ventriculography). The comparison with QBS software (Cedar-Sinai), showed a lower standard deviation of bias (7.44% vs 9.36%). Moreover, unlike the alternative software, the bias did not correlate with the magnitude of the ejection fraction. The fourth manuscript relates to the quantification of the left intra-ventricular synchronism (Harel et. al. J Nucl Cardiol, 2008). A new three-dimensional parameter (CHI: contraction homogeneity index) (median 73.8%; IQ 58.7% - 84.9%) was defined to allow the integration of amplitude and synchrony components of ventricular contraction. Validation of this parameter was undertaken out by comparing the standard deviation of the histogram of phase (SDΦ) (median 28.2º; IQ 17.5º- 46.8º) obtained by planar ventriculography in a study of 235 patients. These four manuscripts, already published in the specialized scientific literature, summarize a fraction of the research tasks that we have carried out during the three last years, representing two major axes of nuclear cardiology advancement in the 21st century.

L'endothélium est la monocouche de cellules qui tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins. Ce tissu a besoin de la polyvalence de la signalisation calcique puisque plusieurs de ses fonctions dépendent de la mobilisation de Ca2+. La mobilisation du Ca2+ intracellulaire dans les cellules non-excitables est majoritairement sous le contrôle du récepteur à l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 R). Les Stromal Interaction Molecules (STIM1 et STIM2) sont des protéines membranaires exprimées sur le réticulum endoplasmique (RE) qui ont la capacité de détecter le niveau de Ca2+ dans le RE. Elles activent le canal plasmique Orai suite à la diminution du niveau de Ca2+ dans le RE. Puisque STIM1 et STIM2 sont des senseurs de Ca2+ du RE, notre hypothèse est qu'elles peuvent aussi réguler la relâche calcique quantale de l'IP3 R, puisque les niveaux de Ca2+ du RE sont importants dans la régulation de la relâche calcique quantale de l'IP3 R. Nous avons montré que les IP3 Rs et les STIMs sont présents dans les cellules endothéliales d'aorte bovine (BAEC) et avec une approche de co-immunoprécipitation, nous avons observé que STIM1 et STIM2 interagissent avec les IP3 Rs. A l'aide d'une approche de vidéomicroscopie par fluorescence, il a été possible de déterminer l'impact de STIM sur la relâche de Ca2+ par l'IP3 R. Dans les BAEC, l'ATP et la bradykinine (BK), via leurs récepteurs respectifs P2 Y et B2, activent la production d'IP3 et ainsi la relâche de Ca2+ par l'IP3 R. Lors de stimulations avec différentes concentrations d'ATP et de BK, la relâche de Ca2+ a été significativement réduite dans les cellules où l'expression de STIM1 a été atténuée. Par contre chez les cellules où l'expression de STIM2 a été atténuée, il n'y a pas eu de changement notable dans la relâche de Ca 2+. Les courbes concentration-réponse ont montré qu'il n'y a pas de changement significatif dans les valeurs d'EC50 obtenues dans les conditions où l'expression de STIM1 ou STIM2 est atténuée. Ces résultats montrent que STIM n'est pas le senseur calcique impliqué dans la relâche calcique quantale de l'IP 3 R. Nos résultats suggèrent plutôt que STIM1, et non STIM2, est un potentiateur de l'activité canal de l'IP3 R. [symboles non conformes]

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