Le compartiment microvasculaire est une cible importante du stress oxydant qui est un facteur majeur de la dysfonction endothéliale, notamment au cours d’exposition aux rayonnements ionisants. L’altération de l’endothélium induite par le stress oxydant est impliquée dans la toxicité radio-induite des tissus sains. Limiter les dysfonctions endothéliales est donc un enjeu important des traitements radiothérapeutiques actuels. Cet objectif nécessite une meilleure caractérisation de la signalisation du stress oxydant dans les cellules endothéliales. La voie p38 MAPK est incontournable dans la réponse au stress oxydant mais reste encore insuffisamment caractérisée. Par une approche protéomique, nous avons identifié la nucléophosmine (NPM) comme nouveau partenaire de p38 dans le cytoplasme des cellules endothéliales. La phosphatase PP2a est aussi associée à ce complexe NPM/p38. Nos travaux montrent que le stress oxydant (H2O2, 500μM) régule la déphosphorylation de NPM via PP2a, entraine sa dissociation rapide du complexe et favorise sa translocation vers le noyau. De plus, nous montrons que la présence de NPM déphosphorylée au noyau altère la réponse des cellules aux dommages à l’ADN induits par le stress oxydant. Le céramide sphingolipide membranaire est également un facteur important des voies de stress, particulièrement dans les cellules endothéliales. Notre étude aborde donc l’implication de ce sphingolipide dans la régulation de la voie NPM/p38. Une meilleure caractérisation de la voie p38 et de ses acteurs permettra d’identifier de potentielles cibles afin de limiter les dysfonctions endothéliales et leurs conséquences délétères sur les tissus environnants. / The microvascular compartment is a significant target of oxidative stress that is a major factor in endothelial dysfunction, especially during exposure to ionizing radiation. The alteration of endothelium induced by oxidative stress is involved in radiation-induced toxicity of normal tissues. Limiting endothelial dysfunction is therefore an important issue of current radiotherapeutic treatments. This objective requires a better characterization of oxidative stress signaling in endothelial cells. p38 MAPK pathway is essential in oxidative stress response but still insufficiently characterized. By using a proteomic approach, we identified nucleophosmin (NPM) as a new partner of p38 in the cytoplasm of endothelial cells. PP2a phosphatase is also associated with the NPM/p38 complex. Our work shows that oxidative stress (H2O2, 500μM) regulates the NPM dephosphorylation via PP2a, causes a rapid dissociation of the complex, and promotes its translocation to the nucleus. In addition, we show that the presence of NPM dephosphorylated at T199 in the nucleus alters the cellular response to DNA damage induced by oxidative stress. The membrane sphingolipid ceramide is also an important factor in stress pathways, particularly in endothelial cells. Our study describes the involvement of this sphingolipid in the regulation of NPM/p38 pathway. A better characterization of the p38 pathway and its actors provided by our study will identify potential targets in order to limit endothelial dysfunction and its deleterious effect on surrounding tissues.

Contexte : En culture, les cellules endothéliales cornéennes humaines (CECH) adoptent fréquemment une morphologie fibroblastique [transition endothélio-mésenchymateuse (TEM)], les rendant inutilisables en génie tissulaire en raison de l’incapacité fonctionnelle associée. Objectifs : En accord avec les précédents travaux provenant de notre laboratoire et la littérature scientifique, nous avons séparément étudié les effets de la culture sous pression hydrostatique physiologique (18 mmHg) et de l’antagonisme de la TEM sur la fonctionnalité des CECH. Méthodes : D’une part, l’ensemencement des CECH sur stromas décellularisés et la culture en chambre antérieure artificielle ont permis de soumettre les CECH à une pression hydrostatique. D’autre part, les agents présumés antagonistes de la TEM suivants ont été étudiés : le SB431542, la dexaméthasone et BMP-7. Résultats : La pression hydrostatique physiologique et l’antagonisme de la TEM par le SB431542 et la dexaméthasone sont des moyens efficaces pour maintenir et améliorer la fonctionnalité des CECH in vitro. / Background: Cultured human corneal endothelial cells (HCEC) often adopt a fibroblastic-like morphology [endothelial-mesenchymal transition (EMT)], making them unusable in tissue engineering due to the associated loss of function. Purpose: In agreement with previous work from our laboratory and scientific literature, we separately investigated the effects of culture under physiological hydrostatic pressure (18 mmHg) and the antagonism of EMT on HCEC functionality. Methods: First, seeding HCEC on decellularized corneal stromas and culture in an artificial anterior chamber allowed to submit HCEC to hydrostatic pressure. Second, the following putative EMT antagonists agents were studied: SB431542, dexamethasone and BMP-7. Results: Physiological hydrostatic pressure and EMT antagonism by SB431542 and dexamethasone are effective ways to maintain and improve HCEC functionality in vitro.

"Thèse en cotutelle. Université Laval, Québec, Canada et Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne, France" / L’hypertension artérielle (HTA) est un problème de santé publique majeur, au centre de nombreuses pathologies. En étudiant la prévalence de l’HTA, nous nous sommes intéressés à deux points en particulier que nous abordons dans ce manuscrit de thèse. Le premier est l’existence d’une relation bidirectionnelle entre l’HTA et le syndrome de l’apnée du sommeil (SAS), maladie encore sous-diagnostiquée de nos jours. Le second concerne le fait que les hommes sont plus touchés par ces deux pathologies que les femmes, mais que cette tendance s’inverse au moment de la ménopause, suggérant un rôle protecteur des hormones ovariennes. Les mécanismes sous-jacents de la mise en place de l’HTA sont connus dans différentes maladies associées comme l’athérosclérose, l’obésité, le diabète, mais doivent encore être étudiés dans le SAS chez la femme ménopausée. Le travail de cette thèse vise à comprendre les mécanismes à l’origine de l’HTA chez les femmes ménopausées atteintes du SAS. Pour cela, nous avons utilisé un modèle animal d’hypoxie intermittente (HIC; 21%-10% O2 ; 10cycles/h ; 8h/jour). Ce modèle simule le profil physiopathologique observé chez les patients apnéiques, en particulier avec le développement de l’HTA. La particularité de nos travaux de recherche est l’utilisation de rates ovariectomisées (OVX), permettant ainsi de mimer la ménopause, contrairement à de nombreux modèles d’HIC qui utilisent les rats mâles. Par ailleurs, nous nous sommes aussi intéressés au rôle de l’estradiol (E2) dans le développement de l’HTA et sur les mécanismes sous-jacents induits par l’HIC. Nos principales conclusions sont que l’HIC engendre une élévation de la pression artérielle et de la concentration en endothéline-1 (un vasoconstricteur), mais que ceci est réversible avec le traitement à l'E2. Au niveau de l'aorte, l'OVX engendre une augmentation du stress oxydatif, mais, de nouveau, la supplémentation en E2 renverse cet effet. Les mécanismes de réponse à l'E2 sont différents selon le protocole suivi par l’animal ; après l’HIC, l’E2 réduit l'activité des enzymes pro-oxydantes alors qu’en condition de normoxie (21% O2), l’E2 augmente l'activité des enzymes anti-oxydantes. Au niveau des poumons, l’HIC augmente le stress oxydatif mais l’OVX a un effet chez les animaux en normoxie uniquement. Les effets de l'E2 sur le stress oxydatif sont tissu-dépendants. Le traitement à l'E2 permet de pallier les dysfonctions vasculaires induites par l’HIC et pourrait avoir une pertinence clinique dans le traitement du SAS chez la femme ménopausée. / Arterial hypertension is a major public health problem, which is at the heart of many diseases. In studying the prevalence of hypertension, we focused in two specific points that we address in this thesis manuscript. The first one is the existence of bidirectional relationship between hypertension and sleep apnea syndrome (SAS), a disease that is still underdiagnosed today. The second is that men are more affected by these two conditions than women, but this trend reverses at the time of menopause, suggesting a protective role of ovarian hormones. The underlying mechanisms of the establishment of hypertension have been studied in various associated diseases (atherosclerosis, obesity, diabetes), but have yet to be studied in SAS in menopausal women. This work aims to understand the mechanisms underlying high blood pressure in postmenopausal women with SAS. For this, we used an animal model of intermittent hypoxia (IH, 21% -10% O2, 10cycles/h, 8h/day). This model presents the same pathophysiological profile observed in apneic patients, in particular with the development of arterial hypertension. The unusual feature of our study is the use of ovariectomized (OVX) female rats, thus allowing to mimic the menopause, contrary to many models of IH which use the male rats. In addition, we have also investigated the role of estradiol (E2) in the development of hypertension and on the underlying mechanisms induced by IH. Our main conclusions are that although IH causes elevation of blood pressure and endothelin- 1 concentration (a vasoconstrictor), it is reversible with E2 treatment. In aorta, OVX generates an increase of oxidative stress, but, again, the supplementation in E2 reverses this effect. The mechanisms of response to E2 are different according to the protocol followed by the animal; after IH, E2 reduces the activity of pro-oxidant enzymes whereas in normoxia condition (21% O2), E2 increases the activity of antioxidant enzymes. In the lungs, IH increases oxidative stress, but OVX has an effect only in female rats exposed to normoxia. The effects of E2 on oxidative stress are tissue-dependent. E2 treatment prevents IH-induced vascular dysfunction and may be clinically relevant in the treatment of SAS in postmenopausal women.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 janvier 2024) / La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est une pathologie qui touche la couche postérieure de la cornée, l'endothélium cornéen. Ce dernier fait office de barrière physique entre l'humeur aqueuse et le reste de la cornée. De ce fait, lorsqu'il est défectueux, une accumulation de l'humeur aqueuse dans le stroma entraîne l'apparition d'un œdème stromal et de bulles épithéliales. Il s'en suit une opacification cornéenne menant à une perte de vision irréversible. Cliniquement, la pathologie est associée à l'épaississement de la membrane de Descemet (DM) dû à un dépôt accru de matrice extracellulaire (MEC), entraînant la formation d'excroissances, appelées guttae. Puis, une perte de densité des cellules endothéliales cornéennes (CECs) se produit contribuant aux difficultés de maintenir la déturgescence du stroma. En Amérique du Nord, la FECD est la principale cause de transplantation de cornées qui représente son seul traitement. De nouveaux traitements sont à l'étude mais nécessitent une bonne compréhension de la maladie et des dérégulations de l'endothélium cornéen. La FECD étant une pathologie multifactorielle, son étiologie reste difficile à déterminer. La recherche a mené à la proposition de différentes hypothèses d'explications au développement de la maladie. Parmi elles, la transition endothélio-mésenchymateuse ou épithélio-mésenchymateuse (TEM). Ce processus cellulaire consiste au passage d'un phénotype endothélial ou épithélial vers un phénotype mésenchymateux. Malgré quelques mises en évidence de la TEM dans la FECD, des signes clés de cette transition manquent dans la maladie, tels que le passage à une morphologie fibroblastique et un changement de cadhérines. C'est pourquoi notre laboratoire a décidé de clarifier la présence de la TEM dans la FECD. L'objectif de ce projet est de comprendre comment la TEM est activée dans la FECD et son impact sur les CECs. De ce fait, notre laboratoire a étudié la TEM à un niveau intracellulaire et extracellulaire en utilisant aussi bien des CECs primaires que des modèles tissulaires. Notre attention s'est d'abord portée sur l'étude des protéines impliquées dans les voies TGF-β/Smad et Wnt/β-caténine (connues pour activer la TEM) dans les CECs *ex vivo* et *in vitro*. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressées au dépôt anormal de MEC, un des signes d'une TEM. En effet, nous avons proposé que les protéines matricielles anormalement déposées seraient impliquées dans la perte cellulaire endothéliale dans la FECD. Nous avons donc étudié l'expression de protéines matricielles dans les stades précoces et avancés de la FECD et leur influence sur l'adhésion et la migration des CECs en culture. Pour répondre au premier objectif, des données transcriptomiques et l'expression des protéines liées à la TEM ont été étudiées *ex vivo*. Les protéines d'intérêt ont également été étudiées *in vitro* avec ou sans irradiation chronique d'UVA. Nos travaux en *ex vivo* FECD ont révélé l'absence de l'activité des voies Wnt/β-caténine et TGF-β/Smad. *In vitro*, ces deux voies de signalisations étaient actives et une augmentation de TGF-β2 a également été observée. Néanmoins, l'exposition aux UVA n'a pas modifié le profil d'expression des protéines. Pour le deuxième objectif, les données transcriptomiques du matrisome de CECs *ex vivo* et *in vitro* ont été analysées. Nous avons ensuite étudié la morphométrie des guttae en *ex vivo* et l'expression de nos protéines d'intérêt en *ex vivo* et sur les endothélia cornéens reconstruits sains et pathologiques. Des tests d'adhésion et de migration ont ensuite été réalisés. Les gènes *SPP1* (Ostéopontine), *FN1* (Fibronectine) et *TNC* (Ténascine-C) étaient régulés à la hausse en *ex vivo* et SPP1 était régulé à la hausse aussi bien *ex vivo* qu'*in vitro*. La fibronectine (FN), ténascine-C (TN-C), ostéopontine (OPN) et le collagène de type XIV (COL XIV) étaient exprimés dans les DM FECD mais seules la TN-C et la FN se retrouvaient dans les endothélia reconstruits FECD. La FN et la TN-C n'ont pas modifié l'adhésion des CECs mais l'OPN l'a diminuée. La FN et la combinaison de FN et TN-C ont augmenté significativement la migration des CECs. Les travaux de cette thèse permettent d'apporter plus de connaissances sur l'activation de la TEM dans la FECD et mettent en évidence une chronologie du dépôt de MEC anormale dans la pathologie ainsi que la façon dont les CECs y réagissent. Une meilleure compréhension du développement de la FECD pourrait apporter des clés pour la conception de nouveaux traitements. / Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD) is a pathology that affects the posterior layer of the cornea, the corneal endothelium. The endothelium acts as a physical barrier between the aqueous humor and the rest of the cornea, so when it is defective, an accumulation of aqueous humor in the stroma leads to stromal edema and epithelial bullae. This leads to corneal opacification and irreversible vision loss. Clinically, the pathology is associated with thickening of Descemet's membrane (DM) due to an increase of extracellular matrix (ECM), leading to the formation of outgrowths known as guttae. This is followed by a loss of corneal endothelial cell (CEC) density, making it difficult to maintain stromal deturgescence. In North America, FECD is the leading cause of corneal transplantation, which is its only treatment. New treatments are under study but require a good understanding of the disease and corneal endothelium dysregulation. As FECD is a multifactorial pathology, its etiology remains difficult to determine. Research has led to the proposal of various hypothesis to explain the development of the disease. One of these is endothelial to mesenchymal or epithelial to mesenchymal transition (EMT). This cellular process is characterized by the transition from an endothelial or epithelial phenotype to a mesenchymal one. Despite some evidence of EMT in FECD, key signs of this transition are missing in the disease, such as the transition to a fibroblastic morphology or the cadherins switch. Therefore, our laboratory decided to clarify the presence of EMT in FECD. The aim of this project is to understand how EMT is activated in FECD and its impact on CECs. Accordingly, our laboratory has studied EMT at both intracellular and extracellular levels, using both primary CECs and tissue models. Our first focus was on the study of proteins involved in the TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin pathways (known to activate EMT) in *ex vivo* and *in vitro* CECs. In a second step, we focused on abnormal ECM deposition, one of the key signs of EMT. Indeed, we proposed that abnormally deposited matrix proteins would be involved in endothelial cell loss in FECD. We therefore studied the expression of matrix proteins in the early and late stages of FECD and their influence on the adhesion and migration of cultured CECs. To address the first objective, transcriptomic data and the expression of EMT-related proteins were studied *ex vivo*. Proteins of interest were also studied *in vitro* with or without chronic UVA irradiation. Our *ex vivo* FECD work revealed the absence of Wnt/β-catenin and TGF-β/Smad pathway activity. *In vitro*, both signaling pathways were active, and an increase in TGF-β2 was also observed. Nevertheless, UVA exposure did not alter the protein expression profile. For the second objective, transcriptomic data from the *ex vivo* and *in vitro* matrisome were analyzed. We then studied guttae morphometry in *ex vivo* specimens and the expression of our proteins of interest in *ex vivo* specimens and on healthy and pathological tissue engineered corneal endothelia. Adhesion and migration assays were then performed. *SPP1* (Osteopontin), *FN1* (Fibronectin) and *TNC* (Tenascin-C) genes were up-regulated *ex vivo*, and *SPP1* was up-regulated both *ex vivo* and *in vitro*. Fibronectin (FN), tenascin-C (TN-C), osteopontin (OPN) and collagen type XIV (COL XIV) were expressed in FECD DMs, but only TN-C and FN were found in reconstructed FECD endothelia. FN and TN-C had no impact on CEC adhesion, but OPN did. FN and the combination of FN and TN-C significantly increased CEC migration. The studies of this thesis provide further insight into the activation of EMT in FECD, highlight the chronological abnormal ECM deposition in the pathology and how CECs respond to it. A better understanding of the FECD development could bring keys to design new treatments.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La migration des cellules endothéliales est une étape nécessaire à l'angiogenèse. Le facteur pro-angiogénique VEGF {vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à identifier puis à caractériser les fonctions des cibles de p38 dans les cellules endothéliales activées par le VEGF. Suite à une électrophorèse bi-dimensionnelle et à une analyse par spectrométrie de masse, nous avons isolé l'annexine 1 (ANXA1) comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et est diminuée en inhibant p38. L'ANXAl a d'abord été caractérisée comme une protéine qui module l'action anti-inflammatoire des glucocorticoïdes en inhibant la phospholipase A2. En outre, plusieurs études indiquent que l'ANXAl joue un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaires et qu'elle interagit avec des protéines du cytosquelette comme la tubuline et l'actine. Après avoir identifié l'ANXAl en aval de p38 nous avons caractérisé ses fonctions ainsi que la kinase responsable de sa phosphorylation. En utilisant des essais de phosphorylation in vitro et in vivo, nous avons montré que la MAPKAP kinase-2 activée par le VEGF régule la phosphorylation de l'ANXAl en aval de p38. Dans les cellules non stimulées, l'annexine 1 est prédominante dans le noyau, tandis que lorsque les cellules endothéliales sont stimulées au VEGF, elle se déplace du noyau vers le cytoplasme où elle co-localise avec l'actine F dans les lamellipodes. L'inhibition de la translocation par le SB203580 et la leptomycine B suggère qu'elle nécessite une phosphorylation et le système cargo CRM1. De plus, la migration cellulaire est inhibée à la suite du knockdown de l'ANXAl par l'utilisation d'un ARNi ciblant l'ARNm de la protéine. En outre, la migration cellulaire et la tubulogenèse initiées par le VEGF sont inhibées à la suite du knockdown de l'ANXAl. En conclusion, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de l'ANXAl régule l'effet angiogénique associé à l'activation de la voie de signalisation p38/MAPKAP kinase-2 par le VEGF.

Ce mémoire de maîtrise s'insère dans un projet visant l'augmentation de la durabilité des prothèses artérielles implantées chez des sujets atteints de maladies cardiovasculaires. Au delà de 350 000 prothèses artérielles synthétiques sont implantées chaque année dans les pays occidentaux. Des études ont démontré que sur 398 prothèses de moyens diamètres explantées pour des complications diverses 65% d'entre elles avaient dues être retirées à cause de thromboses [1]. La formation des thromboses est directement reliée à l'activation des mécanismes de coagulation par le contact du sang avec le matériel synthétique. La thrombogénicité peut être éliminée par une endothélialisation de la surface interne de la prothèse. La présence de ligands organiques spécifiques aux récepteurs cellulaires a des effets sur les voies de communications tout en fournissant un point d'encrage aux cellules [2]. Des études récentes ont démontré que la disposition géométrique de ces ligands a un impact modulateur du comportement cellulaire [3]. La première phase du projet consistait à créer un appareil permettant d'obtenir des schémas microscopiques (micropatrons) de peptides sur des surfaces de polytétrafluoroéthylène (PTFE ou Téflon™). La technique de « micropatterning » développée utilise les propriétés intrinsèques des aérosols. Lorsque le liquide vaporisé entre en contact avec la surface, il créé des taches microscopiques circulaires. Les molécules en solution peuvent alors réagir avec la surface préparée à les recevoir. La caractérisation des patrons a été faite à l'aide de la microscopie optique et d'un logiciel de traitement de l'image. La deuxième phase consistait à observer l'effet des schémas microscopiques sur les cellules endothéliales. Les tests ont été faits avec des cellules endothéliales aortiques bovine (BAECs). Deux séquences peptidiques de la fibronectine (CGRGDS et CWQPPRARI) choisies pour leurs propriétés spécifiques ont été greffées sur le PTFE selon des schémas prédéterminés. La caractérisation des tapis cellulaires a été fait par immunofluorescence et analyse numérique d'images. Le traitement de la surface interne d'une prothèse artérielle en PTFE favorisera l'endothélialisation dans le but de ralentir la formation de thromboses. / This thesis is part of a project aiming to increase the durability of implanted arterial prostheses among subjects affected by cardiovascular illnesses. Beyond 350 000 synthetic arterial prostheses are implanted every year in the western countries. Previous works demonstrated that for 398 prostheses explanted for various complications 65% among them had been withdrawn because of thromboses [1]. The formation of the thromboses is joined directly to the activation of the coagulation mechanisms by the contact of blood with the synthetic material. The thrombogenicity could be eliminated by an endothelialization of the internal surface of the prosthesis. The presence of organic ligands specific to the cellular receptors has some effects on the pathways of communications while providing an anchorage for cells [2]. Some recent studies demonstrated that the geometric disposition of these ligands also has an important impact on the cellular behavior [3]. The first phase of this work consisted in creating a device permitting to obtain microscopic peptides patterns on PTFE surfaces. The technique of micropatterning uses the intrinsic properties of aerosols to reproduce patterns that have some features similar to those of a living organism. When the aerosol enters in contact with the surface, it creates circular microscopic spots of solution. The molecules in solution can thus react with the surface chemically prepared to receive them. The characterization of the patterns has been made by optic microscopy and software images analysis. The second phase consisted in observing the effect of microscopic patterns on the bovine aortic endothelial cells (BAECs). Two peptide sequences from fibronectin (CGRGDS and CWQPPRARI) were bounded on the PTFE. The peptides diagrams created on the surface encouraged the growth of the endothelial cells. The characterization of the cellular covering has been made by immunofluorescence and numeric analysis of pictures. The treatment of the internal surface of an arterial prosthesis made of PTFE will encourage the endothelialization in the goal to slow down the formation of thromboses.

Des études récentes ont montré que les produits de glycation avancée (AGE) pouvaient jouer un rôle dans la pathogénèse des troubles vasculaires en insuffisance rénale. Nous avons alors émis l’hypothèse que l’augmentation de la concentration des AGE observé dans le cas d’insuffisance rénale joue un rôle important dans la pathogenèse de l’hypertension artérielle, entre autres, en aggravant la dysfonction endothéliale et les dommages vasculaires. De plus, nous croyions que les effets des AGE sur la dysfonction endothéliale sont causés par l’activation des récepteurs RAGE sur les cellules vasculaires. Pour vérifier ces hypothèses nous avons étudié dans un premier temps l’effet du S100b, un agoniste des récepteurs des AGE (RAGE), sur la réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium au carbachol et la réponse vasoconstrictrice à la phényléphrine et l’ET-1 sur des segments d’aorte de rats in vitro montés dans des bains à organe, et, dans un deuxième temps, l’effet du S100b sur la fonction endothéliale, notamment l’expression de la NO synthase endothéliale (eNOS) et la production des radicaux libres de l’oxygène (ROS). Les résultats obtenus indiquent que le S100b induit une diminution de la réponse vasorelaxante dépendante du NO au carbachol. Par contre, le S100b entraine une augmentation de la réponse vasoconstrictrice à la phényléphrine. Ce dernier effet n’est pas modifié dans les vaisseaux dénudés de l’endothélium, ni l’inhibition de la production de NO dans les vaisseaux intacts. L’effet du S100b est néanmoins atténué en présence d’indométacine, un inhibiteur de la cyclo-oxygénase, suggérant que l’activation des RAGE module la production de certaines eicosanoides. Enfin, le S100b induit une diminution de la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1 qui est bloquée en présence de L-NAME, un inhibiteur de la production de NO. Ces derniers résultats indiquent que l’effet du S100b sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1 dépend de la relâche de NO. Par ailleurs les résultats obtenus sur des segments d’aorte de rats et des cellules endothéliales en culture indiquent que le S100b n’affecte pas la production de ROS dans les segments d’aorte, bien qu’il stimule leur production dans les cellules endothéliales isolées. Par contre, le S100b tend à augmenter l’expression de la eNOS dans l’endothélium des vaisseaux en culture. En conclusion, la stimulation des RAGE avec le S100b affecte la réponse aux agents vasoconstricteurs et vasodilatateurs sur des segments d’aorte de rats normaux de façon dépendante et, possiblement, indépendante de l’endothélium. Ces effets seraient causés, en partie, par la modulation de la relâche de NO et de l’expression de la eNOS, ainsi que par la production d’eicosanoides et de ROS et, possiblement, l’activation du système endothélinergique. Ainsi, les AGE peuvent affecter le tonus vasculaire en modifiant la fonction endothéliale. / Recent studies suggest that advanced glycation end products (AGEs) could play an important role in vascular pathogenesis in kidney disease. We hypothesized that increased AGEs concentrations in kidney disease play an important role in the pathogenesis of arterial hypertension, by increasing endothelial dysfunction and vascular damages. Furthermore, we believe that the effects of AGEs on endothelial dysfunction are caused by the activation of AGEs receptors (RAGE) on vascular cells. To test this hypothesis, we studied first the effect of S100b, an AGEs receptor agonist, on the endothelium dependent vasodilatation response to carbachol and the vasoconstriction response to phenylephrine and ET-1 on rats thoracic aorta segments in vitro placed in organ bath, and, secondly, the effect of S100b on the endothelial function, especially the expression of endothelial NO synthase (eNOS) and the production of reactive oxygen species (ROS). Our results indicate that S100b induces a decrease in the NO dependent vasodilatation response to carbachol, but an increase in the vasoconstriction response to phenylephrine. This effect of S100b on phenylephrine response is not modified in vessels without endothelium, nor following the inhibition of the NO production in intact vessels. The effect of S100b is however decreased with indometacine, a cyclooxygenase inhibitor, suggesting that RAGE activation modulates the production of eicosanoids. Finally, S100b induces a decrease in the vasoconstriction response to ET-1 that is blocked in presence of L-NAME, a NO production inhibitor. These results indicate that the effect of S100b on the vasoconstriction response to ET-1 is dependent on NO release. In addition, results obtained on cultured rat aorta segments and endothelial cells indicate that S100b does not affect the production of ROS althouch it stimulates their production in isolated endothelial cells. Otherwise, S100b tend to increase the expression of eNOS in the endothelium of cultured vessels. In conclusion, the stimulation of RAGE by S100b affects the response to vasoconstrictors and vasodilators agents on intact rat thoracic aorta segments in an endothelium dependant and, possibly, independent manner. These effects may be related, in part, to the modulation of NO release and eNOS expression, the production of eicosanoids and ROS, and, possibly, the activation of the endothelinergic system. Thus, AGEs could affect vascular tone through the modulation of the endothelial function.

Les cellules endothéliales cornéennes constituent un tissu à la fois extrêmement particulier et d'une importance singulière. En effet, celui-ci est pourvu d'une capacité régénératrice pratiquement nulle, mais son intégrité est essentielle à la transparence cornéenne et donc à la vision. Par contre, l'endothélium cornéen fait défaut dans diverses pathologies telles que la dystrophie de Fuch et la kératopathie bulleuse du pseudophaque. La méthode traditionnelle pour le remplacement d'un endothélium cornéen pathologique est la greffe de cornée pleine épaisseur. Par contre, la greffe lamellaire postérieure est une alternative chirurgicale en plein essor, très intéressante, puisqu'elle permet de remplacer seulement la portion malade de la cornée. Cette technique chirurgicale a ouvert la porte à une nouvelle possibilité au niveau du génie tissulaire. En effet, il est maintenant envisageable de greffer un endothélium produit en laboratoire. Un défi supplémentaire, que s'est imposé notre équipe, est de reconstruire non seulement un endothélium complet, mais d'en reconstruire un qui serait également autologue, l'immunogénicité jouant un rôle non négligeable lors d'échec de greffes. Mon rôle dans ce projet était donc d'évaluer la faisabilité de reconstruire par génie tissulaire un endothélium cornéen autologue pour notre modèle animal, et ce, à des fins de greffes. D'abord en optimisant les conditions de culture afin de permettre la croissance des cellules endothéliales cornéennes animales. Puis en reconstruisant in vitro un endothélium à partir d'une biopsie cornéenne de taille minimale. Un endothélium sain similaire au tissu natif a ainsi été reconstruit.

La fonction de barrière de l'endothélium vasculaire est affectée par des modifications de la cadhérine des cellules endothéliales (VE-cadhérine) telles que la phosphorylation sur tyrosine dans son domaine cytoplasmique et le clivage de son domaine extracellulaire (sVE). Ce travail s'est articulé en deux parties : 1- Etude de ces modifications dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde (PR), et les mécanismes sous-tendus. Ce travail a permis de montrer que la VE-cadhérine est une cible du TNFα, une cytokine essentielle dans la PR, qui induit de la libération de sVE de façon dépendante de l'activité kinase de Src, suggérant l'implication d'un mécanisme de phosphorylation sur tyrosine dans ce processus. De plus, la VE-cadhérine est aussi la cible des protéases de la matrice extracellulaire telles que MMP-2. L'application de ces données fondamentales à la clinique a permis de montrer que sVE était retrouvée dans le sang de patients PR (n=63) et que son taux était corrélé à l'activité de la maladie. Ainsi, le dosage de sVE est d'intérêt dans la prise en charge des patients. 2-Etude de la phosphorylation de la VE-cadhérine dans un contexte d'angiogenèse hormono-régulée au cours du cycle ovarien chez la souris. Les résultats ont montré que le site Y685 de la VE-cadhérine est phosphorylé dans l'ovaire et l'utérus de souris de façon régulée pendant le cycle, ce qui permet de proposer ce modèle physiologique pour étudier la phosphorylation de la VE-cadhérine in vivo. L'analyse de souris knock-in Y685F de la VE-cadhérine (VE-Y685F) a montré que l'absence du site confère une perméabilité accrue dans l'ovaire et l'utérus mais aussi dans les petits capillaires de la peau. De plus, dans deux modèles d'induction d'arthrite, les souris VE-Y685F ont présenté un taux de sVE plus élevé que les contrôles. Au total, sVE et la phosphorylation de la VE-cadhérine ont un vaste champ d'application dans le traitement de la PR ainsi que pour le développement de nouvelles thérapies pouvant s'étendre à d'autres pathologies vasculaires. / The vascular endothelium barrier function is influenced by vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) modifications such as its cytoplasmic tail tyrosine phosphorylation and its ecto-domain cleavage (sVE). The work reported herein was divided into two parts: 1- Study of VE-cadherin modifications and the mechanisms underlying these ones in the rheumatoid arthritis context. This work demonstrated that VE-cadherin is a target of TNFα, a highly important cytokine in rheumatoid arthritis (RA) pathogenesis. We found TNFα to induce sVE shedding in a Src kinase dependent manner, suggesting the involvement of phosphorylation mechanism in this process. In addition, this VE-cadherin cleavage requires matrix metalloproteinase activities such as that of MMP-2. Applying these fundamental data to clinical study showed that sVE was detected in sera of 63 RA patients and its titer was correlated with the disease activity. This finding suggests an obvious interest for assaying sVE in RA therapies. 2- Study of VE-cadherin tyrosine phosphorylation in a context of hormones-regulated angiogenesis during mouse estrous cycle. The results showed VE-cadherin phosphorylation at Y685 that was regulated along mouse estrous cycle allowing to proposing mouse estrous cycle as a physiological model for studying VE-cadherin phosphorylation in vivo. The analysis of VE-cadherin Y685F knock-in mice (VE-Y685F) showed that these mice exhibit a higher vascular permeability in uterus and ovaries and the skin small capillaries compared to wild-type animals. Moreover, VE-Y685F mice presented higher levels of soluble VE-cadherin compared to wild-type counterparts in two induced arthritis model. Altogether, sVE and VE-cadherin phosphorylation present an array of interests for RA therapies as well as developing new therapeutic tools in RA and other vascular diseases.

Les maladies glomérulaires sont une des principales causes d'insuffisance rénale terminale de nos jours et constituent un problème de santé publique. Le concept classique dans les glomérulopathies accorde à l'agression systémique immune, toxique ou hypertensive le rôle principal dans la formation des lésions glomérulaires. L'hypothèse développée dans ce manuscrit est que épithélium et endothélium, deux composants principaux du parenchyme rénal sont des acteurs majeurs dans la formation des lésions glomérulaires. Trois modèles expérimentaux de glomérulopathie (inflammatoire, toxique et hypertensive) chez la souris nous ont permis d'étudier une voie de signalisation épithéliale γC/JAK/STAT classiquement décrite dans les cellules immunitaires et le système de réponse à l'hypoxie endothéliale afin d'étayer cette hypothèse. Après avoir discuté le rôle principal classiquement attribué aux lymphocytes T dans le modèle anti-membrane basale glomérulaire, un modèle animal de glomérulonéphrite inflammatoire, nous avons démontré le rôle protecteur de la chaîne γ commune (γC) glomérulaire et de sa protéine d'aval STAT5 dans le podocyte au cours du modèle anti-MBG et de la néphropathie à l'adriamycine. Enfin, nous avons étudié le rôle protecteur de EPAS1 (HIF-2α), une sous-unité régulatrice du complexe HIF, dans l'endothélium au cours des lésions glomérulaires hypertensives. Au total, ce travail met en évidence le rôle majeur de l'épithélium et l'endothélium rénal, étroitement liés, dans la formation des lésions glomérulaires. Le parenchyme rénal représente un acteur à part entière dans la physiopathologie de ces lésions comme le montrent les travaux sur les systèmes γC/STAT5 et HIF. / Glomerular diseases are a leading cause of kidney failure and represent a public health problem. Classically, systemic effectors such as the immune system, drug toxicity or hypertension are thought to be the main drivers of glomerular diseases. The hypothesis developed in this manuscript is that epithelium and endothelium, the two main components of the renal parenchyma, are major players in the formation of glomerular lesions. Three experimental models of glomerular disease (inflammatory, toxic and hypertensive) in mice allowed us to study epithelial γC / JAK / STAT signaling classically described in immune cells and the endothelial hypoxia inducible system in order to support this hypothesis. After discussing the main role traditionally assigned to T cells in the anti- glomerular basement membrane model, an animal model of inflammatory glomerulonephritis, we demonstrated the protective role of the glomerular interleukin common γ chain (γC) receptor and its dependent podocyte-specific STAT5 during the anti-GBM model and adriamycin nephropathy. We then showed the protective role of endothelial EPAS1 (HIF-2α), a regulatory subunit of HIF complex in focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) induced by angiotensin II. In total, this work highlights the important role of the closely linked renal epithelium and endothelium in the formation of glomerular lesions using three experimental models of glomerular diseases. The renal parenchyma is a full player in the pathophysiology of these lesions as shown by the works studying γC / JAK / STAT and HIF systems.