Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans le système immunitaire, l’activation des cellules B nécessite la reconnaissance spécifique par les récepteurs membranaires des cellules B des antigènes portés par cellules présentatrices d’antigènes (macrophages, cellules dendritiques, …). Cette reconnaissance se traduit par une accumulation de protéines adhésives constituant une structure moléculaire appelée synapse immunologique, à partir de laquelle sont extraits les antigènes. Les mécanismes biologiques impliqués dans l’extraction d’antigènes par les cellules B sont encore mal connus. Dans notre étude, nous proposons d’utiliser des gouttes d’huile dont la surface est fonctionnalisée par des anticorps, comme substrat pour l’activation des cellules B. Ces gouttes présentent l’intérêt de posséder une interface liquide et d'être déformables (mesure de forces possible). Afin de mettre en contact les gouttes fonctionnalisées avec les cellules B, nous avons fabriqué un réseau de pièges ayant la forme d’un U répartis dans une chambre microfluidique. La forme de cette chambre a été optimisée de manière à garantir un remplissage efficace des pièges. Le dispositif expérimental mis au point permet de mettre en contact une goutte fonctionnalisée par des anticorps et une cellule B dans plusieurs pièges en parallèle, et d’observer l’évolution du contact dans le temps par microscopie. Nous avons observé que le contact goutte/cellule induisait une accumulation d’anticorps greffés à la goutte au niveau de la zone de contact. La cinétique d’accumulation est mesurée. Des observations en fluorescence des lysosomes des cellules B montrent une polarisation vers la zone de contact, suggérant une réponse de la part de la cellule. / In the immune system, B cell activation is triggered by the specific binding of the B cell receptors with the antigens present on antigen-presenting cells like macrophage, dendritic cells, ... This recognition leads to an accumulation of adhesive proteins at the contact. This molecular structure is called immune synapse, from which the antigens are extracted by the B cell. The precise biological mechanisms implied in the extraction of antigens are still unknown. In our work, we propose to use antibody-coated oil droplets as substrates for the activation of B cells. These droplets have the advantage to have a liquid surface, allowing the antibodies-coated diffusion at their surface. Moreover, these droplets are potentially deformable, so they behave as cellular force probes. Lastly, the droplets have the same size of the B cells, so they mimic the antigen-presenting cells. In order to put in contact the B cells with the droplets, we fabricated a regular network of microfluic traps with U-shape in a microfluic chamber. The shape of the chamber has been optimized to guaranty a good trapping efficiency. Using the traps, we have been able to put into contact one antibody-coated droplet with one B cell in several traps in parallel, and to observe the contact in function of time by fluorescence microscopy. We observed an accumulation of the antibodies coated on the droplet at the surface of contact. The kinetics of accumulation has been measured and the time scale of accumulation has been deduced. Also, observations with fluorescence showed a polarization of the lysosomes near the contact, suggesting a B cell response.

La synapse immunologique est une structure qui se forme à l’interface entre un lymphocyte T et une cellule présentatrice d’antigène lors de la reconnaissant d’un antigène étranger spécifique. Cette plate‑forme est actuellement considérée comme le lieu d’où est déclenchée la cascade de signalisation moléculaire conduisant à l’activation lymphocytaire. Les travaux présentés dans ce manuscrit décrivent un autre pôle de signalisation localisé sur le lymphocyte T, à l’opposé de la zone de contact. Ce pôle a été nommé antisynapse. On peut détecter cette structure dans la première minute avant le contact, avant l’apparition de la synapse immunologique. Elle contient les composants classiquement décrit à la synapse immunologique. Sa formation est indépendante de la reconnaissance d’antigène et déclenchée par l’adhésion entre les cellules. Plusieurs fonctions potentielles sont étudiés, l’antisynapse agit notamment comme un réservoir de molécules qui sont transférées à la synapse immune de manière dépendante des microtubules. L’antisynapse peut également être considérée comment une pre-synapse déclenchée avant la reconnaissance d’antigène. / The immunological synapse forms at the interface between a T cell and an antigen-presenting cell after foreign antigen recognition. The immunological synapse is considered to be the site where the signaling cascade leading to T lymphocyte activation is triggered. In this manuscript, we show that another signaling region can be detected before formation of the synapse at the opposite pole of the T cell. This pole has been named antisynapse. This structure appears during the first minute after the contact forms, is transient and contains all the classic components that have been previously described at the immunological synapse. Its formation is independent of antigen recognition but is driven by adhesion itself. Some potentials functions à discussed here, it constitutes a reservoir of signaling molecules that are potentially ready to be sent to the immunological synapse through a microtubule-dependent pathway. The antisynapse can thus be considered as a pre-synapse that is triggered independently of antigen recognition.

Lors d’une réponse immune, les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) interagissent entre elles. La synapse immunologique (SI), interface de contact entre les deux cellules, est le site où une cascade de signalisation se met en place. Les lymphocytes T subissent alors un profond réarrangement au niveau de la membrane plasmique et du cytoplasme : les protéines impliquées dans cette signalisation sont alors recrutées à la synapse immunologique. Nous nous intéressons à une nouvelle structure appelée “l’antisynapse” qui se localise au pôle opposé à celui de la synapse immunologique. L’objectif de notre étude est de déterminer la composition de cette nouvelle structure et sa cinétique d’apparition et de disparition. Afin d’étudier cette structure, nous faisons des conjugués in vitro entre des CPA et des lymphocytes T et nous observons la formation de ces contacts sur cellules vivantes ou cellules fixés. L’antisynapse est composée de molécules de signalisations que l’on retrouve classiquement à la synapse immunologique, tels que LAT, CD3, lck ou la PI3K. Grâce à la sonde fluorescente ROZA récemment développée au laboratoire1, nous avons montré que la kinase ZAP-70 est activée à l’antisynapse. Ces observations sont cohérentes avec le fait que nous avons déjà observé la présence de protéines avec des tyrosines phosphorylées à ce pôle. Cette structure précoce et transitoire s’observe fréquemment et apparaît très souvent avant que la synapse ne puisse être détectée. Son apparition est indépendante de la signalisation en aval du TCR et peut être déclenchée par un signal d’adhésion. D’autre part, le cytosquelette de microtubules semble jouer un rôle majeur dans sa disparition. Le rôle de l’antisynapse est toujours en cours d’étude mais nous avons déjà pu montrer qu’elle constituait un point de stockage pour les protéines destinées à former la synapse immunologique au moment de sa formation. Grâce à cette structure nous essayons de mieux comprendre comment le signalosome s’assemble dans la cellule T. Nous voulons également comprendre comment une telle structure peut apparaître aussi rapidement et quelles sont les voies de signalisation mises en jeu dans sa formation. / During the immune response, T lymphocytes and antigen presenting cells (APC) are known to develop strong interactions. The immunological synapse (IS), structure established at the interface between the two cells, is the site where a cascade of signaling events is initiated and may lead to a physiological response. T lymphocyte undergoes a profound rearrangement in the plasma membrane and in the cytoplasm: proteins which are involved in the signaling are recruited to the immunological synapse. We have recently described a new structure that we have called antisynapse (ASI), located at the cell pole opposite to the synapse1. The purpose of this work is to characterize the components of this new structure and their kinetic of appearance and disappearance. To study this structure, we made in vitro contact between APC and T lymphocytes and we observed these conjugates either in live or fixed conditions. Surprisingly, the antisynapse contains most of the signaling molecules classically reported as components of the immunological synapse such as LAT, CD3, Lck or PI3K. By using the fluorescent probe ROZA that we recently developed1, we have shown that ZAP-70 is activated at the antisynapse. This observation is consistent with the fact that we have also observed the presence of tyrosine-phosphorylated proteins at the ASI. Interestingly, we have observed that LFA-1, a protein involved in the adherence, is also found at the ASI. Our results indicate that this transient structure develops frequently and appears rapidly after the contact between the T cell (around one minute) and the APC. Surprisingly, antisynapse formation is independent on TCR signaling but is triggered by adhesion. Furthermore, it disappears using the microtubule network. The role of the antisynapse is currently under investigation but we have shown that it constitutes a stock of proteins ready to go to the forming immune synapse. We currently try to take advantage of this structure to better understand how the T cell signalosome may assemble and to find out if, functionally, the T cell takes advantage of this structure. We also try to understand how this paradoxical structure can appear so rapidly and what are the signaling pathways involved in its establishment.

L’activation d’un lymphocyte T (LT) CD4+ par une cellule présentatrice d’antigène (CPA) estune étape cruciale pour la mise en place d’une réponse immune adaptatrice efficace contre unpathogène ou une cellule tumorale. Elle nécessite un contact prolongé entre les deux types cellulaires,initié par la reconnaissance, par le récepteur des LT (TCR), d’un complexe CMH-peptide spécifiqueprésenté à la surface de la CPA. Cette interaction LT-CPA induit la formation d’une zone de contactorganisée dans le temps et l’espace, appelée la synapse immunologique. La mise en place de cettestructure entraîne le remodelage des cytosquelettes d’actine et de microtubules dans les LT. Quelquesminutes après la reconnaissance de l’antigène par le TCR, l’actine se polymérise à la zone synaptiqueet le centre organisateur des microtubules (MTOC) se polarise en face de la CPA.Le but du travail de thèse présenté ici a été d’étudier le rôle de la réorganisation ducytosquelette des LT lors de la mise en place de la synapse, dans la sécrétion des cytokines et lemaintien de l’interaction permettant l’activation des LT. Nous nous sommes particulièrementintéressés au rôle de deux protéines qui régulent le remodelage du cytosquelette : la petite RhoGTPaseCdc42 et un de ses partenaires IQGAP1. Cette étude a été réalisée essentiellement dans des LT CD4+primaires humains, grâce au développement d’une approche permettant d’inhiber l’expression de cesdeux protéines par introduction de shRNAs à l’aide de vecteurs lentiviraux.Nous avons ainsi mis en évidence que le remaniement du cytosquelette d’actine à la synapseétait dépendant de Cdc42, et contrôlait : 1/ la formation d’un anneau d’actine polymérisée enpériphérie de la synapse, 2/ le recrutement et la concentration des vésicules contenant l’IFN-g aucentre de la synapse, 3/ la sécrétion de l’IFN-g dans la zone synaptique. Nous avons également montréque la protéine IQGAP1 contrôlait le remaniement de l’actine des LT à la synapse, la signalisation enaval du TCR, et la dynamique de contact entre LT et CPA.Cette étude participe à une meilleure compréhension du rôle du remodelage du cytosqueletted’actine et de sa régulation dans la mise en place de l’interaction entre LT et CPA, l’activation des LTet une de leur fonction clé : la sécrétion de lymphokines. / CD4+ T lymphocyte activation by an antigen presenting cell (APC) is a crucial step in theestablishment of an adaptive immune response against pathogens or tumor cells. It requires contactbetween the two cell types, initiated by the recognition, by the T cell receptor (TCR), of a specificpeptide-MHC complex presented by the APC. This T cell-APC interaction induces the formation of aparticular zone organized in time and space, called the immunological synapse. The establishment ofthis structure induces the remodeling of the actin and microtubule cytoskeleton in T cells. Few minutesafter antigen recognition by the TCR, actin polymerizes at the synaptic zone, and the microtubuleorganizing center (MTOC) polarizes toward the APC.The goal of the work presented here was to study the role of T cell cytoskeleton remodelingduring the establishment of the synapse, in cytokine secretion and in the maintenance of the interactionallowing T cell activation. We mainly studied the role of two proteins regulating the cytoskeleton: thesmall RhoGTPase Cdc42 and one of its partners IQGAP1. This study was performed mostly in humanprimary CD4+ T cells, thanks to the development of an approach allowing the inhibition of theexpression of these two proteins by introducing shRNAs through lentiviral vectors.Altogether, our results show that remodeling of the actin cytoskeleton at the synapse isdependent on Cdc42 and controls : 1/ the formation of a polymerized actin ring at the periphery of thesynapse, 2/ the recruitment and concentration of vesicles containing IFN-g at the center of the synapse,3/ the secretion of IFN-g in the synaptic cleft. They also show that IQGAP1 controls T cell actinremodeling at the synapse, signaling downstream the TCR, and the dynamic of interactions between Tcells and APC.This study allows a better understanding of the role of cytoskeleton remodeling and of itsregulation in the establishment of Tcell-APC interaction, the activation of T cells and one of their keyfunctions: lymphokine secretion.

LFA-1 (Lymphocyte Function Associated antigen-1) est une intégrine centrale dans la fonction cytotoxique des lymphocytes T CD8+ car elle permet la formation de la synapse immunologique avec les cellules cibles. La régulation de cette interaction cellulaire est contrôlée par la qualité de l'engagement de LFA-1 avec son ligand ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule-1). Un support clef au contrôle spatio-temporel de l'activation de LFA-1 est le cytosquelette d'actine corticale dans lequel est ancré LFA-1 par son domaine intracellulaire. Comment LFA-1 est organisée à la synapse immunologique et comment la coordination entre LFA-1 et cytosquelette d'actine s'opère de manière précise au sein des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques sont des questions non résolues. Le but de ce projet de thèse a été d'étudier l'organisation précise de la distribution de LFA-1 à la synapse immunologique en relation avec l'actine corticale sous-jacente au contact entre lymphocytes T cytotoxiques et les cellules présentatrices d'antigènes. Pour ce faire, des approches de microscopies de super-résolution SIM (Structured Illumination Microscopy), dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) et TIRF (Total Internal Reflexion Fluorescence microscopy) ont été développées. Elles ont été appliquées à des lymphocytes T humains non transformés dérivés de contrôles sains et de patients atteints d'une immunodéficience congénitale, le Syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), caractérisé par un défaut de remodelage du cytosquelette d'actine à la synapse immunologique. L'emploi de l'approche de dSTORM en mode TIRF nous a permis de révéler que dans sa conformation activée, LFA-1 forme à la synapse une ceinture radiale composée de centaines de nano-clusters. L'intégrité du cytosquelette d'actine et notamment la protéine WASP s'avèrent importantes pour la formation de la ceinture de nano-clusters de LFA-1, comme le montre le défaut de formation de cette ceinture dans les lymphocytes de patients WAS. L'approche de SIM multi-couleur nous a permis de révéler le rôle de la ceinture de LFA-1 dans le confinement des granules lytiques. Par comparaison de marquages avec des anticorps spécifiques de différentes conformations de LFA-1, notre travail montre également que l'activation de LFA-1 s'opère de manière digitale, dans le sens où les nano-clusters fonctionnent comme des unités au sein desquelles l'activation de LFA-1 suit une loi du tout ou rien. En conclusion, ce travail de thèse démontre l'intérêt des approches de microscopie de super-résolution pour révéler des mécanismes clefs de l'activation des lymphocytes T et pour appréhender la nature des défauts à l'origine de dérèglements pathologiques de la fonction de ces cellules. / LFA-1 (Lymphocyte Function Associated antigen-1) is a central integrin in the function of cytotoxic CD8+ T lymphocytes since it allows the formation of the immunological synapse with target cells. The regulation of this cellular interaction is controlled by the quality of the engagement of LFA-1 with its ligand, ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule- 1). A key support for the spatio-temporal control of LFA-1 activation is the cortical actin cytoskeleton in which LFA-1 is anchored by its intracellular domain. How LFA-1 is organized at the immunological synapse and how the coordination between LFA-1 and actin cytoskeleton operates accurately within cytotoxic CD8+ T lymphocytes are unresolved issues. The aim of this thesis project was to study the precise organization of the LFA-1 distribution at the immunological synapse in relation to the cortical actin underlying the contact between cytotoxic T lymphocytes and target cells. For this purpose, super-resolution microscopy approaches, including SIM (Structured Illumination Microscopy), dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) and TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy) were developed. They were applied to untransformed human T lymphocytes derived from healthy donors and patients with a congenital immunodeficiency, the Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS), characterized by actin cytoskeleton remodeling defects at the synapse. The use of the dSTORM approach revealed that activated LFA-1 forms a radial belt composed of hundreds of nanoclusters. The assembly of this belt depends on the integrity of the actin cytoskeleton, as shown by the impairment of this structure in the T lymphocytes derived from the WAS patients. The multi-color SIM approach allowed us to investigate the role of the LFA-1 belt in the confinement of lytic granules. Furthermore, the combination of staining with antibodies specific of LFA-1 conformation states shows that LFA-1 activation is a digital process, whereby nanoclusters operate as units in which LFA-1 activation follows an on / off rule. In conclusion, this PhD work exemplifies the great asset of super-resolution microscopy approaches to reveal key activation mechanisms in T lymphocytes and explore the nature of the defects causing pathological dysregulation of the function of these cells.