Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Au cours de ce projet, nous avons émis l'hypothèse que les cellules cancéreuses en circulation ursupent les mécanismes utilisés par les cellules du système immunitaire pour lier l'endothélium, le traverser et former des métastases. En ce sens, nous avons observé en conditions dynamiques que la E-sélectine est nécessaire à l'adhérence puis au roulement des cellules cancéreuses de côlon HT-29 à la surface des cellules endothéliales. L'utilisation de divers variants de la Esélectine nous a permis de confirmer l'importance de sa portion cytoplasmique pour l'adhérence et le roulement des cellules cancéreuses. En utilisant une chambre à flux laminaire et un substitut vasculaire tridimensionnel construit par génie tissulaire, nous avons identifié trois mécanismes de diapédèse. Ainsi, 1) la majorité des cellules cancéreuses ne complètent pas le processus de diapédèse et restent au niveau des cellules endothéliales (diapédèse de type mosaïque), 2) certaines passent aux jonctions interendothéliales (diapédèse paracellulaire), 3) tandis que d'autres passent au travers de la cellule endothéliale (diapédèse transcellulaire). Nous avons aussi déterminé que l'activation de la E-sélectine conduit à celle des MAP kinases ERK et p38. Au moyen d'approches génétiques et d'inhibiteurs chimiques, nous avons par la suite démontré que l'activation de ces voies par la E-sélectine est requise pour la diapédèse des cellules cancéreuses, via le mécanisme paracellulaire. L'activation de p38 régule la diapédèse des cellules HT-29 en modulant la phosphorylation de la myosin light chain (MLC) et la formation de fibres de tension. D'autre part, l'activation de ERK par la E-sélectine régule l'ouverture des jonctions interendothéliales en initiant l'activation de c-Src et la dissociation du complexe VEcadhérine/p-caténine. Nous concluons que la E-sélectine est essentielle à l'adhérence des cellules cancéreuses de côlon HT-29 et que sa stimulation régule l'extravasation des cellules cancéreuses en initiant l'activation des voies MAP kinases ERK et p38 qui toutes deux contribuent à moduler l'intégrité de la barrière endothéliale et la diapédèse de type paracellulaire. / In the present work, we have investigated the mechanisms by which adhesion of colon cancer cells to E-selectin expressed by endothelial cells regulates the endothelial barrier function and modulates cancer cell transmigration. Several Ones of evidence indicate that cancer cells could use the inflammatory system to interact with the endothelium, to transmigrate and form metastases. Accordingly, we have observed in static and dynamic conditions that E-selectin was essential for the adhesion and rolling of HT-29 colon cancer cells on endothelial cells. By using various E-selectin constructs, we further found that both processes required the cytoplasmic portion of E-selectin. Moreover, the use of a laminar flux chamber and a vascular tridimensional substitute constructed by tissue engineering, permits to identify three diapedesis mechanisms. 1) The majority of cancer cells did not complete the diapedesis process and remained between endothelial cells (mosaic diapedesis), 2) some migrated at interendothelial junctions (paracellular diapedesis) and 2) some passed through an endothelial cell (transcellular diapedesis). We have also found that the activation of E-selectin by the adhesion of HT-29 cells, in a static or a dynamic conditions, resulted in an increased activity of ERK and p38 MAP kinases. In turn, activation of p38 and ERK enhanced transendothelial permeability and paracellular migration of HT-29 cells. We also obtained evidence suggesting that p38-mediated increase in transendothelial permeability and cancer cell migration depends on a myosin light chain (MLC) phosphorylation-mediated formation of stress fibers. On the other hand, the activation of ERK by E-selectin modulated the opening of interendothelial spaces by initiating the activation of c-Src kinase activities and the dissociation of the VE-cadherin/p-catenin complex. Thus, we conclude that E-selectin is essential for HT-29 cancer cells adhesion and that its activation regulates the extravasation of colon cancer cells by initiating p38- and ERK-dependent mechanisms that both contribute to the regulation of the integrity of the endothelial barrier and paracellular diapedesis.

La protéine Girdin humaine est surexprimée dans divers types de cancers où elle contribue à la progression tumorale. Elle favorise notamment la migration et l’invasion cellulaires. Récemment, il a été montré que Girdin interagit directement avec Par-3. Cette interaction est essentielle à la polarisation des cellules en migration. Par-3 et son orthologue chez la drosophile Bazooka sont également impliquées dans l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale et des jonctions d’adhérence (JA). La polarité épithéliale, caractérisée par la distribution asymétrique des composantes cellulaires, est nécessaire au maintien de l’intégrité des épithéliums. En effet, la perte de plusieurs régulateurs de la polarité épithéliale mène à la transition épithélio-mésenchymateuse. Nous avons donc émis l’hypothèse que Girdin est impliquée dans la polarité épithéliale et/ou l’adhésion cellule-cellule tout comme son partenaire d’interaction Par-3. Afin de vérifier notre hypothèse in vivo, nous avons généré des allèles mutants nuls de Girdin (orthologue de Girdin chez la drosophile) et établit un anticorps anti-Girdin spécifique. Tout d’abord, nous avons démontré que Girdin est essentiellement exprimée durant l’embryogenèse. Dans les épithéliums embryonnaires elle est enrichie aux JA. Ensuite, les embryons Girdin mutants présentent divers défauts morphogénétiques dont la formation de kystes ectopiques de cellules épithéliales et parfois l’ouverture de la ligne médiane ventrale, ce qui pourrait être attribuable à des défauts de cohésion cellulaire. De plus, l’association entre les composantes des JA, incluant Armadillo (β-Caténine) et DE-Cadhérine (DE-Cad), et le cytosquelette diminue dans les embryons Girdin mutants. Ces résultats suggèrent donc que Girdin est impliquée dans le maintien de la stabilité des JA. Nous nous sommes ensuite intéressés à l’implication de Girdin dans la polarité épithéliale. Bien que les mutants Girdin ne présentent aucun défaut de polarité épithéliale, nous avons pu mettre en évidence des interactions génétiques fortes entre Girdin et trois gènes codant pour des régulateurs de la polarité épithéliale : crb, yrt et lgl. Dans l’ensemble, nos résultats identifient Girdin comme un nouveau régulateur de la polarité épithéliale et de l’adhésion cellule-cellule. À l’avenir il sera essentiel de prendre en considération ces fonctions de Girdin pour évaluer s’il s’agit d’une cible thérapeutique appropriée contre le cancer. / The human Girdin protein is overexpressed in various cancers, and promotes cell migration and invasion. This suggests that Girdin contributes to tumor progression. Recently, it was shown that Girdin directly interacts with Par-3. This interaction is essential for cell polarization associated with directed cell migration. Par-3 and its Drosophila ortholog Bazooka are also known for their role in the establishment and maintenance of epithelial cell polarity and adherens junction (AJ) formation. Epithelial polarity, which is characterized by the asymmetric distribution of many cellular constituents, is necessary for epithelial tissue function and homeostasis. Indeed, loss of several epithelial polarity regulators leads to epithelial to mesenchymal transition. We thus hypothesized that Girdin plays a role in epithelial polarity and/or cell-cell adhesion, as reported for its binding partner Par-3. In order to test this premise in vivo, we generated null alleles of Girdin, which encodes the Drosophila ortholog of Girdin, and established specific anti-Girdin antibodies. First, we demonstrated that Girdin is mainly expressed during embryogenesis. In embryonic epithelial cells, it is predominantly associated with the plasma membrane and enriched at AJ. Girdin mutant embryos present several morphogenetic defects including the formation of ectopic epithelial cell cysts and opening of the ventral midline, suggesting that loss of Girdin weakens cell-cell adhesion. Consistent with this phenotype, the association between AJ components, including Armadillo (β-catenin) and DE-Cadherin (DE-Cad), and the cytoskeleton decreases in Girdin mutant animals. These results suggest that Girdin participates in AJ stability. We then investigated the implication of Girdin in epithelial polarity. Although we could not observe any epithlelial polarity defects in Girdin mutants, we found strong genetic interactions between Girdin and three genes encoding polarity regulators : crb, yrt and lgl. Together, our data identifies Girdin as a novel regulator of epithelial cell polarity and cell-cell adhesion. These results thus reveal unsuspected roles for Girdin related proteins. Comprehensive analysis of Girdin function is essential to evaluate whether it is an appropriate target to treat cancer.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

DSCAM est exprimé dans le cortex lors du développement et sa mutation altère l’arborisation dendritique des neurones pyramidaux du cortex moteur. Considérant que les souris DSCAM2J possèdent des problèmes posturaux et locomoteurs, nous émettons l’hypothèse que DSCAM est impliqué dans le fonctionnement normal du cortex moteur et de la voie corticospinale. Comparées aux souris contrôles, les souris DSCAM2J vont présenter des problèmes moteurs à basse vitesse et enjamber un obstacle presque normalement à vitesse intermédiaire. Le traçage antérograde de la voie corticospinale révèle un patron d’innervation normal dans le tronc cérébrale et la moelle épinière. Des microstimulations intracorticale du cortex moteur évoque des réponses électromyographiques dans les membres à un seuil et une latence plus élevé. Par contre, une stimulation de la voie corticospinale dans la médulla évoque des réponses électromyographies à un seuil et une latence similaire entre les deux groupes, suggérant une réduction de l’excitabilité du cortex moteur. / DSCAM is expressed in the developing motor cortex, and its mutation alters the dendritic tree arborization of cortical neurons in the motor cortex. Given that DSCAM mutant mice exhibit postural and locomotor dysfunctions, we hypothesized that DSCAM might impair the normal functioning of the motor cortex and its corticospinal tract. In comparison to wild-type mice, DSCAM mutants displayed motor impairments at slow walking speed while stepping over an obstacle almost normally at moderate walking speed. Anterograde tracing of the corticospinal tract revealed a normal pattern of innervations at the brainstem and spinal cord levels. Intracortical microstimulations of the motor cortex evoked electromyographic responses in forelimb and hindlimb muscles at higher thresholds and longer latencies in DSCAM mutants. In contrast, stimulations of the corticospinal tract at the level of the medulla evoked electromyographic responses at similar thresholds and latencies in both mouse, thus suggesting a reduced excitability of their motor cortex.

La protéine Spam-1, qui est présente à la surface des spermatozoïdes, faciliterait le passage des gamètes mâles à travers le cumulus, en coupant les liens d’acide hyaluronique présents entre les cellules, et serait impliquée dans le processus de liaison secondaire des spermatozoïdes à la zone pellucide de l’ovule. Le but de cette étude, par la construction de protéines recombinantes fluorescentes contenant la séquence des différents domaines fonctionnels de Spam-1, est de démontrer que la protéine spermatique bovine Spam-1 se lie directement à la zone pellucide de l’ovule et de clairement démontrer que c’est la partie C-terminale de la protéine qui est impliquée. Les résultats obtenus dans le présent mémoire permettront de déterminer l’importance de Spam-1 dans la liaison du spermatozoïde à l’ovule au moment de la fécondation et ainsi de mieux caractériser les mécanismes d’interaction sperme/ovule. / Spam-1 is a sperm surface protein that would help the spermatozoa going through the cumulus, disrupting the hyaluronan around the egg. It would also have a role to play in the secondary binding of the spermatozoa to the zona pellucida of the oocyte. The aim of the present study, by the construction of various fluorescent recombinant proteins containing the sequences of the different domains of Spam-1, is to clearly demonstrate that bovine spermatic Spam-1 protein is directly implicated in the secondary binding of the spermatozoa to the zona pellucida and to show that the C-terminal domain is implicated. The results of this study are going to determine the importance of Spam-1 in the spermatozoa binding to the zona pellucida and in getting a better understanding of the mechanisms surrounding the interactions between spermatozoa and oocyte.

Il est reconnu que le passage de la matrice extracellulaire du cumulus ainsi que de la zone pellucide par le spermatozoïde sont assurés, chez plusieurs espèces de mammifères, par la protéine spermatique PH-20. Cette protéine possède une activité hyaluronidase qui lui permet de cliver les liens d'acide hyaluronique contenus dans le cumulus et est responsable de la liaison du spermatozoïde ayant subi la réaction de l'acrosome à la zone pellucide. Une protéine spermatique bovine de 80 kDa (p80) possédant une homologie aVec PH-20 fut identifiée au sein de notre laboratoire. Puisque PH-20 n'est pas identifiée chez le bovin, les travaux présentés dans cette thèse étaient destinés à déterminer si la protéine p80 est la PH-20 bovine et si elle est impliquée dans l'interaction entre les gamètes au cours de la fécondation. Dans un premier temps, la caractérisation de la protéine fut effectuée à l'aide d'une approche PCR et immunologique. L'homologie entre la protéine spermatique bovine p80 et PH-20 fut établie à l'aide de ces résultats. L'analyse de la séquence déduite en acides aminés de p80 a permis de mettre en lumière la présence de caractéristiques uniques chez la protéine dont l'absence d'une ancre-GPI, la présence d'un domaine transmembranaire, de sites de phosphorylation et de N- et O-glycosylation. Deuxièmement, à l'aide du développement d'un anticorps dirigé contre l'extrémité C-terminale de p80 et d'un anticorps dirigé contre l'extrémité N -terminale, l'orientation de p80 dans les membranes spermatiques fut établie. Les résultats montrent que deux populations de p80 existent chez le spermatozoïde bovin. La première est internalisée dans la région antérieure de la tête des spermatozoïdes alors que la deuxième est localisée dans la région post -acrosomale de la tête et expose son domaine hyaluronidase à l'environnement extracellulaire. De plus, les analyses protéomiques et immunologiques démontrent que la population post-acrosomale est un isofo~e plus court de p80 et est d'origine épididymaire alors que la forme pleine longueur présente dans la région antérieure de la tête du spermatozoïde est d'origine testiculaire. La présence de sites d'O-glycosylation fut aussi confirmée expérimentalement. Afin de déterminer le rôle fonctionnel de p80, l'état de phosphorylation sur les résidus tyrosines de la protéine au cours de la capacitation et de la réaction de l'acrosome fut étudié. De même, l'implication de p80 dans la modulation de la concentration des niveaux de calcium intracellulaire spermatique en présence d'acide hyaluronique ainsi que son implication au cours de l'interaction entre le spermatozoïde et la zone pellucide furent déterminées. Les résultats démontrent que p80 n'est pas phosphorylée sur ses résidus tyrosines au cours de la capacitation et de la réaction acros·omique et n'est pas impliquée dans la modulation des concentrations de calcium intracellulaire. Toutefois, p80 est impliquée, via son extrémité C-terminale, dans la liaison du spermatozoïde à la zone pellucide puisque la présence de la protéine purifiée ainsi que l'anticorps C-terminal de p80 dans le milieu inhibe cette liaison. De plus, la glycosylation de la protéine n'est pas responsable de son interaction avec la zone pellucide puisque la présence de la forme déglycosylée de p80 dans le milieu d'incubation produit le même taux d'inhibition que sa forme native. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent clairement que la protéine p80 est la PH-20 bovine, que deux populations sont présentes sur le spermatozoïde et qu'elle est responsable de l'activité hyaluronidase requise par le spermatozoïde pour franchir le cumulus ainsi que pour l'interaction entre ceux -ci et la zone pellucide entourant l'ovule au cours de la fécondation.

La locomotion est contrôlée par des circuits spinaux qui génèrent le rythme locomoteur et coordonnent les activités musculaires entre la droite et la gauche du corps, et entre les muscles fléchisseurs et extenseurs. De plus, le rétrocontrôle sensoriel acheminé par les afférences proprioceptives et cutanées est crucial pour le fonctionnement normal du circuit locomoteur et pour l’adaptation du mouvement à l’environnement extérieur pendant la marche. La protéine DSCAM (Down Syndrom Cell Adhesion Molecule) est une molécule d’adhérence cellulaire impliquée dans un grand nombre de mécanismes nécessaires à la mise en place des réseaux neuronaux au cours du développement. Bien que DSCAM soit exprimée dans la moelle épinière de façon transitoire pendant le développement embryonnaire de la souris, et que sa mutation entraîne des défauts posturaux et moteurs très marqués, il y a très peu d’information sur son rôle dans le développement du circuit spinal lombaire contrôlant la locomotion. Dans ce contexte, les travaux présentés dans cet ouvrage visent à étudier l’implication de DSCAM dans la mise en place et le maintien du circuit locomoteur spinal. Pour cela, nous avons d’abord évalué les changements neurologiques du circuit spinal lombaire de souris néonatales et adultes mutantes pour DSCAM. Les souris portant la mutation systémique DSCAM2J présentent des problèmes de coordination locomotrice associés à des changements anatomiques et neurophysiologiques dans le circuit interneuronal spinal. Par ailleurs, nous avons étudié l’impact de la mutation DSCAM2J sur la coordination des membres pendant la locomotion de la souris adulte. Nous montrons que la mutation de DSCAM altère la capacité des souris à courir et induit des changements dans leur répertoire locomoteur. En particulier, les souris mutantes DSCAM2J présentent des patrons de marche auparavant jamais décrits pour la souris. De tels changements suggèrent une réorganisation des réseaux neuronaux spinaux et supraspinaux impliqués dans le contrôle locomoteur des souris mutantes DSCAM2J. À l’aide de la technologie Cre-Lox, nous avons alors identifié et caractérisé la contribution de différentes populations interneuronales du circuit locomoteur spinal affectées par la mutation de DSCAM. Nous montrons dans cette étude que la mutation conditionnelle de DSCAM dans les interneurones spinaux excitateurs ou inhibiteurs entraîne un déséquilibre entre excitation et inhibition, induisant des défauts de coordination gauche/droite ou fléchisseur/extenseur, respectivement. Par immunomarquage, nous avons alors génétiquement identifié les populations interneuronales spinales impliquées dans le contrôle de la coordination gauche/droite ou fléchisseur/extenseur nécessaires à la locomotion. L’ensemble des résultats de nos études fonctionnelles, électrophysiologiques et anatomiques suggère que la protéine DSCAM est nécessaire au développement du circuit locomoteur spinal des mammifères. En plus de caractériser les différents rôles de DSCAM dans la mise en place de ce réseau spinal, ce travail montre comment le développement de mutations conditionnelles de DSCAM dans différentes sous-populations neuronales permet d’étudier différentes composantes du circuit locomoteur spinal. / Locomotion is controlled by spinal circuits that generate rhythm and coordinate left-right and flexor-extensor motoneuronal activities. The outputs of motoneurons and spinal interneuronal circuits are shaped by sensory feedback, relaying peripheral signals that are critical to the locomotor and postural control. Several studies in invertebrates and vertebrates have argued that the Down Syndrome Cell Adhesion Molecule (DSCAM) would play an important role in the normal development of neural circuits. Although there is evidence that DSCAM is expressed in the developing mouse spinal cord, and that its mutation induces postural and motor defects in adult mice, little is known about its functional contribution to the spinal circuits underlying locomotion. In this context, the work presented in this thesis aims at studying the implication of DSCAM in the establishment of the spinal locomotor circuit. For this purpose, we first sought to evaluate the neurological changes in the spinal locomotor circuit of neonatal and adult DSCAM mutant mice. We show that a systemic mutation of DSCAM (DSCAM2J) induces locomotor coordination defects associated with anatomical and neurophysiological changes in spinal interneuronal and sensorimotor circuits. We then investigated the functional contribution of DSCAM to locomotor gaits over a wide range of locomotor speeds using freely walking mice. We show that the DSCAM2J mutation impairs the ability of mice to run and modifies their locomotor repertoire, inducing the emergence of aberrant gaits for mice. Such changes suggest a reorganization of spinal and supraspinal neuronal circuits underlying locomotor control in DSCAM2J mutant mice. Finally, we used the Cre-Lox technology to genetically identify and characterize the neuronal populations underlying these functional changes. We show in this study that conditional mutations of DSCAM in either excitatory or inhibitory spinal interneurons induce an imbalance in excitatory-inhibitory signaling across the spinal midline that can impair the spinal locomotor circuit controlling either the bilateral coordination or the flexor/extensor coordination, respectively. Combining these studies with immunostaining experiments, we identified spinal interneuronal subpopulations implicated in either the bilateral or the flexor/extensor coordination during locomotion. Collectively, our functional, electrophysiological, and anatomical studies suggest that the mammalian DSCAM protein is involved in the normal development of the spinal locomotor circuit. In addition to characterizing the different implications of DSCAM in the development of this spinal circuit, this work shows how the use of conditional mutations of DSCAM in different neuronal subpopulations allows the study of the spinal locomotor circuit components.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.