Dans les troupeaux laitiers, le succès de l'insémination artificielle dépend, en grande partie, de la qualité de la semence. D est important de disposer de techniques analytiques fiables permettant d'évaluer la qualité de la semence. Actuellement, aucun paramètre pris isolément n'est corrélé de façon satisfaisante à la fertilité. L'évaluation multiparamétrique de la semence est une option intéressante pour améliorer l'efficacité des tests de fertilité. Ce mémoire porte sur la caractérisation, via la cytometric en flux, des spermatozoïdes bovins cryopréservés. Différents paramètres ont été étudiés tels que la viabilité, l'activité mitochondriale, l'intégrité de la membrane acrosomale, le pH intracellulaire, le Ca2+ intracellulaire et celui emmagasiné dans la cellule. Ces paramètres ont été évalués postdécongélation et suite à cinq heures d'incubation en présence ou non d'héparine comme inducteur de la capacitation. Pour chacune des conditions, on a étudié les effets et les interactions de chacun des paramètres et leur relation avec la fertilité in vivo.

La protéine Spam-1, qui est présente à la surface des spermatozoïdes, faciliterait le passage des gamètes mâles à travers le cumulus, en coupant les liens d’acide hyaluronique présents entre les cellules, et serait impliquée dans le processus de liaison secondaire des spermatozoïdes à la zone pellucide de l’ovule. Le but de cette étude, par la construction de protéines recombinantes fluorescentes contenant la séquence des différents domaines fonctionnels de Spam-1, est de démontrer que la protéine spermatique bovine Spam-1 se lie directement à la zone pellucide de l’ovule et de clairement démontrer que c’est la partie C-terminale de la protéine qui est impliquée. Les résultats obtenus dans le présent mémoire permettront de déterminer l’importance de Spam-1 dans la liaison du spermatozoïde à l’ovule au moment de la fécondation et ainsi de mieux caractériser les mécanismes d’interaction sperme/ovule. / Spam-1 is a sperm surface protein that would help the spermatozoa going through the cumulus, disrupting the hyaluronan around the egg. It would also have a role to play in the secondary binding of the spermatozoa to the zona pellucida of the oocyte. The aim of the present study, by the construction of various fluorescent recombinant proteins containing the sequences of the different domains of Spam-1, is to clearly demonstrate that bovine spermatic Spam-1 protein is directly implicated in the secondary binding of the spermatozoa to the zona pellucida and to show that the C-terminal domain is implicated. The results of this study are going to determine the importance of Spam-1 in the spermatozoa binding to the zona pellucida and in getting a better understanding of the mechanisms surrounding the interactions between spermatozoa and oocyte.

L'industrie bovine est un secteur de grande importance au Canada. En effet, à elle seule l'industrie laitière canadienne représentait un chiffre d'affaires de 15.7 milliards de dollars pour l'année 2013 (commission canadienne du lait). L'industrie laitière canadienne est reconnue pour la qualité génétique supérieure de son cheptel bovin, de même que pour ses programmes génétiques laitiers (c'est à dire les programmes de contrôle laitier et les programmes d'enregistrement du bétail laitier et de la classification pour le type). Le Canada détient 41 % du marché mondial d'exportation (2008) de bovins reproducteurs de race pure et d'embryons. La race holstein est la race laitière la plus importante (92 % du cheptel laitier). Les semences de bovins laitiers canadiens ont été exportées vers 84 pays différents principalement vers les États-Unis, les Pays-Bas, le Japon et l'Espagne. Le Canada est à l'avant-garde des nouvelles technologies en matière de génétique laitière. Grâce au génotypage, les généticiens peuvent déterminer le profil d'ADN d'un animal et produisent actuellement des évaluations génomiques pour plus de 60 caractères différents. Depuis août 2009, le Réseau laitier canadien (RLC) publie des évaluations génomiques qui combinent la valeur génomique directe (VGD) d'un animal avec son évaluation génétique traditionnelle. Pour rester compétitif, le Canada doit rester à l'affut des nouvelles technologies qui permettent de discerner les meilleurs animaux reproducteurs. La demande grandissante pour des animaux de qualité pousse l'industrie à utiliser les animaux de plus en plus jeunes. Il est reconnu que la qualité des gamètes des mâles âgés de moins de 16 mois est inférieure à celle des animaux matures. À ce jour il n'est pas clair si l'utilisation de gamètes immatures peut avoir un impact sur le phénotype des animaux issus de ces gamètes. La génétique permet de donner une information clé qu'an au potentiel reproducteur d'un animal et le génome d'un animal ne varie pas avec l'âge, toutefois il est possible que l'information épigénétique transmise par un gamète imparfait ait un impact négatif sur la descendance. L'étude des patrons épigénétique ainsi que le développement de méthode fiable pour récolter ces informations s'impose. Le réseau embryoGENE a développé une plateforme d'analyse épigénétique permettant d'établir un profil de méthylation de l'ADN à la grandeur du génome. Une lame de micro array comportant plus de 420 000 sondes combinées à une plateforme de bio-informatique permet une résolution sans précédent de l'épigénome bovin. Afin de déterminer si le méthylome des gamètes d'un animal évolue avec le temps. Quatre taureaux ont été récoltés alors qu'ils étaient âgés de 10, 12 et 16 mois. Les échantillons récoltés à 10 et 12 mois ont été comparés à l'échantillon mature (16 mois) afin de déterminer si les profils de méthylation ont varié dans le temps. Un total de 2604 sites différentiellement méthylés ont été détectés entre les échantillons de 10 mois à ceux de 16 mois. Cela démontre que les spermatozoïdes provenant de taureaux âgés de 10 mois n'ont pas un profil mature. Aucune différence significative au niveau des méthylations n'a pu être détectée lorsque l'on compare les échantillons de 12 mois à ceux de 16 mois. L'importance de ces différences pour l'embryon est méconnue. Il est toutefois connu que des altérations dans les marques épigénétiques portées par l'embryon soient à la source de plusieurs pathologies ou défauts embryonnaires. Il est raisonnable de soupçonner que l'utilisation de sperme immature puisse représenter un risque potentiel pour l'embryon.

Les nucleotides cycliques (AMPc (adenosine monophosphate cyclique) et GMPc (guanosine monophosphate cyclique)) sont des molécules de signalisation intracellulaire, reconnues comme seconds messagers. L'AMPc et le GMPc régulent plusieurs fonctions de la physiologie du spermatozoïde. L'AMPc, en particulier, joue un rôle déterminant dans le processus de maturation des spermatozoïdes, la motilité, la capacitation et la réaction de l'acrosome. Les nucleotides cycliques activent des kinases, des phosphodiesterases et certains types de canaux ioniques en plus d'affecter l'activité des protéines G via les «EPAC» et les «GEF». La concentration intracellulaire d'AMPc dépend autant de sa synthèse par les cyclases que de sa dégradation par les phosphodiesterases (PDEs). Encore peu d'études se sont attardées à mesurer l'activité phosphodiesterase chez les spermatozoïdes, tant chez le bovin que chez les autres espèces. Ce projet avait donc pour objectifs le développement d'une méthode capable de mesurer l'activité phosphodiesterase et l'étude de l'activité phosphodiesterase, à l'aide d'inhibiteurs spécifiques, chez les spermatozoïdes bovins en s'attardant plus particulièrement à étudier la PDE10 dont l'inhibiteur spécifique est la papaverine.

La maturation épididymaire est un processus essentiel à l'acquisition du pouvoir fécondant et de la motilité des spermatozoïdes. Ce processus implique, entre autres, l'acquisition de nouvelles protéines dans des structures fonctionnelles spécifiques des spermatozoïdes. Chez le bovin, les protéines P25b et MlF sont acquises au cours du transit épididymaire à partir des vésicules membranaires nommées épididymosomes, sécrétées dans la lumière de l'épididyme. La P25b, impliquée dans la liaison à la zone pellucide, est une protéine GPIancrée localisée dans la région acrosomale de la membrane plasmique du spermatozoïde. MIF est une protéine associée aux fibres denses du flagelle et impliquée dans la motilité du spermatozoïde. Bien que la compartimentation spécifique de ces protéines assure les différentes fonctions des spermatozoïdes, les mécanismes à la base de cette compartimentation sont encore inconnus. Dans différents modèles cellulaires, la compartimentation des protéines de la membrane plasmique est assurée par la formation de domaines rafts enrichis en cholestérol et en sphingolipides. À partir du fait que les rafts sont présents dans les membranes plasmiques des spermatozoïdes, nous avons établi que P25b s'associe et s'accumule dans ces domaines au cours du transit épididymaire. Par contre, les protéines MIF sont toutefois exclues des rafts. Dans les spermatozoïdes éjaculés, P25b se dissocie complètement des rafts mais reste liée à la membrane plasmique. Nous avons déterminé que la dissociation de P25b est causée par une déstabilisation des structures des rafts à la suite d'une perte de cholestérol induite par la protéine NiemannPick C2. Puisque les épididymosomes sont à la fois riches en cholestérol et en sphingolipides et transportent des protéines portant un groupement GPI, nos études ont permis d'établir que les épididymosomes comportent aussi des rafts. La P25b présente dans les rafts des épididymosomes est transférée dans les rafts des spermatozoïdes épididymaires, alors que MIF se retrouve dans le compartiment cytosoluble. L'identification systématique du protéome des épididymosomes révèle la présence de certains membres de la famille des rabs et des SNARE, impliqués dans le traffic et la fusion vésiculaires, et associés aux rafts des spermatozoïdes. L'ensemble de ces résultats suggère que les rafts sont impliqués dans le transfert et la compartimentation des protéines des épididymosomes vers les différentes structures fonctionnelles des spermatozoïdes.