Sur onze familles actuellement connues, la phosphodiestérase 10 (PDE10) est une des plus récemment découverte. Si elle est surtout exprimée dans le cerveau (striatum), où elle a beaucoup été étudiée car impliquée dans plusieurs pathologies neurologiques, elle est aussi exprimée dans le testicule. Cette PDE est capable d'hydrolyser à la fois l'AMPc et le GMPc, mais est bien plus efficace sur le premier. Ce mémoire sera consacré à l'étude de la PDE10 dans le spermatozoïde, depuis sa découverte et sa caractérisation, jusqu'à des ébauches de pistes sur sa régulation et son rôle dans la physiologie spermatique. L'étude se concentrera principalement sur un modèle bovin, mais des aspects humains de la PDE10 spermatique y seront également abordés. On y apprendra que l'isoforme retrouvée chez le bovin est celle nommée PDE10X4 et que celle retrouvée chez l'humain lui est très similaire. La protéine est retrouvée dans la région acrosomale du spermatozoïde et semble plutôt cytosolique, même si une association aux membranes n'est pas exclue. La protéine semble faire partie de complexes protéiques de haut poids moléculaire dont les autres membres restent à déterminer. La régulation de PDE10 spermatique semble assez différente de ce que l'on retrouve dans le striatum, puisque dans le gamète mâle, on ne retrouve ni phosphorylation ni palmitoylation de PDE10. L'impact de PDE10 sur la phosphorylation des protéines et la motilité des spermatozoïdes est abordé. Pour terminer, PDE10 semble impliquée dans la réaction d'acrosome, mais son rôle précis reste encore à définir. / Eleven phosphodiesterases (PDE) families are actually known and PDE10 is one of the most recently discovered. It is expressed principally in the brain where it is involved in some mental disorders, and then well studied. But it is also expressed in the testis, where less is known. PDE10 can degrade both cAMP and cGMP but is way more potent with the first one. This memoir is about the situation of the PDE10 in the spermatozoa, from its characterization and localization to the first steps toward its regulation and its functions in the sperm physiology. Although we will focus on a bovine sperm model, we will also have a look on the situation in human spermatozoa. We show that the bovine PDE10 isoform found in the spermatozoa correspond to the predicted PDE10X4 sequence and that the one found in human spermatozoa is really similar. The protein localizes in the acrosomal region and is probably cytosolic, although we can't exclude an association to membranes. PDE10 seems to be part of high molecular weight protein complexes but we need to identify the other protein members. The regulation of PDE10 seems different in spermatozoa than in the striatum where the protein is spatially and functionally regulated by phosphorylation and palmitoylation. These two events don't occur in the male gamete. We will consider the impact of the PDE10 on the protein phosphorylation status and on the control of the motility. In the end, we PDE10 seems to have an impact on the acrosomal reaction, but further work is needed to understand its precise role.

Les nucleotides cycliques (AMPc (adenosine monophosphate cyclique) et GMPc (guanosine monophosphate cyclique)) sont des molécules de signalisation intracellulaire, reconnues comme seconds messagers. L'AMPc et le GMPc régulent plusieurs fonctions de la physiologie du spermatozoïde. L'AMPc, en particulier, joue un rôle déterminant dans le processus de maturation des spermatozoïdes, la motilité, la capacitation et la réaction de l'acrosome. Les nucleotides cycliques activent des kinases, des phosphodiesterases et certains types de canaux ioniques en plus d'affecter l'activité des protéines G via les «EPAC» et les «GEF». La concentration intracellulaire d'AMPc dépend autant de sa synthèse par les cyclases que de sa dégradation par les phosphodiesterases (PDEs). Encore peu d'études se sont attardées à mesurer l'activité phosphodiesterase chez les spermatozoïdes, tant chez le bovin que chez les autres espèces. Ce projet avait donc pour objectifs le développement d'une méthode capable de mesurer l'activité phosphodiesterase et l'étude de l'activité phosphodiesterase, à l'aide d'inhibiteurs spécifiques, chez les spermatozoïdes bovins en s'attardant plus particulièrement à étudier la PDE10 dont l'inhibiteur spécifique est la papaverine.

La vision est rendue possible grâce à la conversion du signal lumineux en un signal électrique par la cascade de phototransduction visuelle, qui implique plusieurs protéines incluant la phosphodiestérase (PDE). L’inactivation des différentes protéines de la phototransduction est primordiale pour que les photorécepteurs retrouvent leur sensibilité aux changements d’intensité lumineuse. Au cours de ce processus, un complexe de protéines incluant la R9AP (RGS9-1 Anchor Protein) inactive la PDE. La R9AP permet l’ancrage d’un complexe protéique à la membrane des disques des photorécepteurs via son segment C-terminal hydrophobe. Des mutations au niveau de la séquence de la R9AP mènent à une maladie appelée bradyopsie qui se caractérise notamment par une photophobie et une difficulté à suivre des objets en mouvement. Cette maladie peut être causée par la perte de la liaison membranaire de la R9AP en raison de mutations menant à une modification de la séquence en acides aminés de son segment C-terminal. La liaison membranaire de la R9AP joue donc un rôle majeur dans l’inactivation de la PDE. Par contre, aucune donnée de liaison membranaire et structurale n’est disponible pour cette protéine. Nous avons donc initié la caractérisation de la structure et de la liaison membranaire de différentes formes de la R9AP, soit la protéine avec et sans son segment C-terminal (∆TM, R9AP∆TM) ainsi que le segment C-terminal seul. Afin d’obtenir la R9AP pure, nous avons cloné, surexprimé et purifié la R9AP∆TM en fusion avec différentes étiquettes de solubilisation/purification. Les protéines recombinantes ont été produites à l’aide d’un système d’expression bactérien. En plus de permettre d’obtenir la R9AP pure pour caractériser sa structure et sa liaison membranaire, ces travaux ont significativement contribué à faire avancer les connaissances à propos de l’utilisation des étiquettes de purification/solubilisation en fusion avec une protéine d’intérêt. En effet, nous avons effectué une étude systématique pour étudier l’impact de la conception des protéines de fusion sur la solubilité, l’expression et la purification de protéine d’intérêt. Il s’agit de la première étude systématique évaluant l’effet du positionnement et de l’identité des différentes étiquettes de purification/solubilisation sur ces paramètres. Également, la production des protéines recombinantes a permis d’identifier un site alternatif d’initiation de la traduction dans la séquence de l’étiquette GST (glutathione S-transférase) qui cause l’expression d’une protéine de fusion tronquée. Cette observation aura certainement un fort impact compte tenu de l’utilisation répandue de l’étiquette GST. Concernant les résultats obtenus avec la R9AP, des données de centrifugation ont montré que la protéine complète est beaucoup moins soluble que la R9AP∆TM, ce qui suggère un rôle important du segment C-terminal hydrophobe dans la solubilité de cette protéine. Ainsi, seulement la structure et la liaison membranaire de la R9AP∆TM ont pu être investiguées dans le cadre de cette thèse. Des mesures par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge ont montré que la R9AP∆TM ainsi que le peptide C-terminal sont majoritairement constitués d’hélices alpha, ce qui appuie les prédictions structurales de cette protéine et un rôle d’ancrage membranaire de son segment C-terminal. Également, les mesures de liaison membranaire à l’aide des monocouches de Langmuir ont montré que ce segment C-terminal seul possède une forte affinité pour la majorité des phospholipides qui sont représentatifs de la composition lipidique des photorécepteurs. En revanche, la R9AP sans son segment transmembranaire a montré une faible affinité pour la majorité de ces phospholipides. Ainsi, nos travaux suggèrent fortement que la spécificité de liaison membranaire de la R9AP est en majorité dictée par son segment C-terminal, ce qui supporte son rôle important dans l’ancrage du complexe protéique aux membranes des disques des photorécepteurs et dans la bradyopsie. / Visual phototransduction involves many proteins including phosphodiesterase, which leads to photoreceptor hyperpolarization and then signal transmission to the brain. Inactivation of the different proteins involved in this process is essential such that photoreceptors remain sensitive to changes in light intensity. In the course of this inactivation, a protein complex including R9AP (RGS9-1 Anchor Protein) inactivates phosphodiesterase (PDE). R9AP anchors a protein complex to disk membranes of the photoreceptor outer segments most likely by use of its C-terminal hydrophobic domain. Mutations in the coding sequence of R9AP lead to a visual disease called bradyopsia, which results in problems with adjusting to light variations and difficulties to follow moving objects. This disease can be caused by the loss of the membrane binding of R9AP as a result of mutations that modify the amino acid sequence of its C-terminal domain. Membrane binding of R9AP thus plays a major role in the inactivation process of PDE. However, membrane binding and structural data are still lacking for this particular protein. We have thus initiated the characterization of the structure and membrane binding of R9AP, including the fulllength protein, R9AP without its C-terminal domain (R9AP∆TM), as well as its Cterminal domain alone. In order to get pure R9AP, we have cloned, overexpressed and purified R9AP∆TM in fusion with solubility-enhancing/purification tags. Recombinant proteins were expressed using a bacterial expression system. This study allowed us to develop a procedure to obtain pure R9AP∆TM as well as to significantly improve our understanding of the use of fusion proteins. Indeed, we have performed a systematic analysis of the impact of the design of fusion proteins on their solubility, expression and purification. This study was the first one to evaluate the effect of both the identity and the position of the tags on the solubility, expression and purification of proteins of interest. Also, the production of R9AP∆TM recombinant proteins allowed us to identify an alternative translation initiation site in the coding sequence of the GST (glutathione S-transferase) tag, which results in the expression of a truncated fusion protein. This finding will certainly have an important impact when considering the extensive use of the GST tag. Results have shown that the R9AP∆TM protein is much more soluble than the fulllength protein, which suggests a major role of the C-terminal domain of R9AP for its solubility. Thus, the structure and the membrane binding of R9AP∆TM have been investigated within the scope of this thesis. Infrared spectroscopy as well as circular dichroism measurements have allowed determining that R9AP∆TM as well as the C-terminal domain adopt an alpha-helical structure, which is in good agreement with both the predicted structure of R9AP and the transmembrane role of its C-terminal domain. Also, Langmuir monolayer measurements revealed that the C-terminal segment has a high affinity for most of the phospholipids found in photoreceptor membranes. In contrast, R9AP∆TM has a low affinity for these phospholipids. Thus, our results demonstrate that the membrane binding of R9AP is highly dependent on its C-terminal segment, which is consistent with its important role in anchoring the protein complex to disk membranes of the photoreceptor outer segments and in bradyopsia.

La rétinite pigmentaire (RP) résulte en une dégénération progressive de la rétine et représente une cause importante de cécité. La transmission de cette maladie se fait selon différents processus d'hérédité dont une forme liée au chromosome X pour la protéine retinitis pigmentosa 2 (RP2) et une forme autosomique récessive dans le cas de la phosphodiesterase 6 (PDE6). RP2 est une protéine qui stimule la réaction d'hydrolyse du GTP et est probablement impliquée dans le transport des protéines. C'est une protéine de 350 acides aminés qui possède deux sites d'acylation et est localisée principalement à la membrane plasmique. Il existe quelques mutations perturbant cette localisation dont la deletion de la serine 6 qui résulte en une RP. Dans la cascade signalétique visuelle, l'activation de la rhodopsine par un photon mène à l'activation de la (PDE6). La PDE6 activée hydrolyse ensuite le GMPc, ce qui mène à la fermeture des canaux GMPc dépendants et à l'hyperpolarisation de la membrane du photorécepteur. La PDE6 est un tétramère d'environ 220 kDa et est acylée, ce qui permet sa liaison à la membrane. On la retrouve, tout comme la RP2, en partie dans les microdomaines résistant aux détergents. Ces microdomaines, aussi appelés radeaux lipidiques, sont riches en phospholipides saturés et en cholestérol. Toutefois, la liaison préférentielle de la PDE6 et de la RP2 à des phospholipides saturés n'a jamais été démontrée. L'objectif de cette thèse est de caractériser les propriétés de liaison membranaire de ces protéines en utilisant des monocouches de Langmuir. Pour ce faire, une RP2 recombinante a été produite et la PDE6 fut extraite de photorécepteur bovin. L'analyse de l'interaction de RP2 avec le modèle membranaire met en évidence l'affinité particulière de RP2 pour les lipides saturés et une liaison préférentielle au domaine liquide condensé. La PDE6 montre aussi une discrimination face aux phospholipides. De plus, les résultats obtenus en spectroscopie infrarouge montrent différentes orientations de sa structure secondaire en fonction de l'environnement lipidique. En somme, les résultats présentés dans cette thèse permettent de postuler de nouvelles hypothèses concernant l'importance de l'interaction membranaire de la RP2 et la PDE6 en ce qui concerne leur implication dans les différents processus impliqués dans les mécanismes de la vision.

Des études ont démontré que l'utilisation d'inhibiteurs non-spécifiques de PDE comme la caféine augmentait la production laitière. La présente étude avait pour but d'investiguer pour la première fois la présence fonctionnelle de la famille d'enzymes appelée phosphodiesterases (PDE) dans la glande mammaire bovine. Il a donc été démontré que la PDE4D, une PDE connue comme étant impliquée dans la sécrétion de caséines, y est présente et fonctionnelle. De plus, cette étude s'est étendue au niveau de l'expression et de la régulation fonctionnelle des PDE durant une lactation complète. Il a alors été démontré que les gènes de la PDE4D et la PDE7A, toutes deux spécifiques à l'AMPc, ainsi que la PDE5A, spécifique au GMPc, sont exprimés dans la glande mammaire bovine. Ces résultats suggèrent aussi une régulation post-traductionnelle des PDE dans ce tissu. Finalement, les essais enzymatiques AMPc mesurant l'activité PDE totale ont décrit une courbe inverse à celle de la production laitière. De par leur présence la PDE4D, la PDE5A et la PDE7A doivent jouer un rôle au niveau de lactation chez la vache laitière.

La protéine kinase AMPc-dépendante (PKA) joue un rôle crucial dans la régulation neurohormonale de la fonction cardiaque. L’activation aiguë de la PKA est bénéfique car elle conduit à une augmentation de la contraction cardiaque en phosphorylant les acteurs clés du couplage excitation-contraction. En revanche, son activation chronique est délétère et ces effets semblent faire intervenir la régulation de protéines nucléaires pouvant conduire au remodelage hypertrophique et à l'insuffisance cardiaque. La localisation subcellulaire de la PKA, assurée par des protéines d’ancrage (AKAPs), est importante pour la rapidité et la spécificité d’action des hormones mettant en jeu la voie de l’AMPc. Les niveaux d’AMPc sont régulés par l’activité des adénylate cyclases et des phosphodiestérases (PDEs), et l’état de phosphorylation des protéines cibles de la PKA dépend de l’activité des Ser/Thr phosphatases (PPs). Dans le cœur, les PDEs les plus importantes dégradant l’AMPc sont les PDE3 et les PDE4. Les principales PPs cardiaques sont PP1, PP2A et PP2B. Dans une première partie de mon travail, j’ai mis au point, dans les cardiomyocytes de rats adultes, une mesure de l’activité de la PKA en temps réel dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires. J’ai utilisé pour cela des sondes de type AKAR (A-kinase activity reporters) basées sur le transfert d’énergie de fluorescence (FRET) et localisées spécifiquement dans le noyau ou dans le cytoplasme par des séquences d’adressage ou d’exclusion nucléaires. J’ai ainsi pu montrer qu’une stimulation maintenue des récepteurs β-adrénergiques active la PKA de façon plus importante dans le cytoplasme que dans le noyau, et que cette activation se développe lentement au niveau nucléaire que dans le cytoplasme. De ce fait, une stimulation brève des récepteurs β-adrénergiques active maximalement la PKA dans le cytoplasme, mais de façon marginale dans le noyau. Dans une seconde partie de l’étude, je me suis intéressée au rôle des PDE3 et PDE4 ainsi qu’à celui de PP1, PP2A et PP2B dans la régulation de l’activité PKA cytoplasmique et nucléaire, en réponse à une stimulation β-adrénergique. J’ai montré que la PDE4, mais pas la PDE3, régule l’activité de la PKA cytoplasmique et nucléaire. L’utilisation de souris invalidées pour les gènes Pde4b et Pde4d a révélé que l’isoforme PDE4B est prédominante pour la modulation de l’activité PKA cytoplasmique, alors que les deux isoformes PDE4B et PDE4D contribuent à la régulation de l’activité PKA nucléaire. Finalement, j’ai montré que la PP1 et la PP2A, mais pas la PP2B, participent à la terminaison des réponses β-adrénergiques dans le cytoplasme, alors qu’au niveau nucléaire, la PP1 semble jouer un rôle majeur. En conclusion, ce travail a mis en évidence le rôle des phosphodiestérases et des phosphatases dans l’intégration différentielle des réponses PKA à une stimulation β-adrénergique dans le cytoplasme et le noyau de cardiomyocytes adultes. / The cAMP-dependent protein kinase (PKA) exerts short term beneficial effects on cardiac function by phosphorylating several key excitation-contraction coupling (ECC) proteins. However, its chronic activation is deleterious on the long term, and this may involve regulation of nuclear effectors ultimately leading to hypertrophic remodelling and heart failure. The subcellular localization of PKA, mediated by anchoring proteins (AKAPs), is important for the speed and specificity of hormones that activate the cAMP pathway. The levels of cAMP are regulated by adenylyl cyclase and phosphodiesterases (PDEs), and PKA activity is counterbalanced by Ser/Thr phosphatases (PPs). In heart, the most important PDEs that degrade cAMP belong to the PDE3 and PDE4 famillies, whereas the major cardiac PPs are PP1, PP2A and PP2B. In a first part, I developed, in adult rat cardiomyocytes, a technique to measure PKA activity in real time specifically in the cytoplasm and the nucleus. For this I used genetically-encoded fluorescence resonance energy transfer (FRET) sensors called AKAR (A-kinase activity reporters) that can be targeted specifically to the nucleus or the cytoplasm by nuclear localization or exclusion sequences, respectively. Using this approach, I showed that maintained β-adrenergic stimulation activates PKA more efficiently and more potently in the cytoplasm than in the nucleus, and that the kinetics of PKA activation was much slower in the nucleus than in the cytoplasm. Accordingly, a short β-adrenergic stimulation maximally activated PKA in the cytoplasm but marginally activated PKA in the nucleus. In a second part, I characterized the respective contribution of PDE3, PDE4, and PP1, PP2A and PP2B families in the regulation of cytoplasmic and nuclear PKA activity in response to β-adrenergic stimulation. PDE4, but not PDE3, regulates PKA activity in the cytoplasm and in the nucleus. The use of knock out mice for Pde4b and Pde4d genes revealed that PDE4B plays a predominant role to modulate β-AR stimulation of cytoplasmic PKA, whereas in the nucleus both PDE4B and PDE4D isoforms contribute. Finally, I showed that both PP1 and PP2A, but not PP2B, participate to the termination of β-adrenergic PKA responses in the cytoplasm, whereas PP1 appears to play a major role in the nuclei. In conclusion, this work highlights the role of phosphodiesterases and phosphatases in the differential integration of PKA responses to β-adrenergic stimulation in the cytoplasm and the nucleus of adult cardiomyocytes.

L’objectif de mon travail de thèse était d’une part, de mieux comprendre le rôle des différentes familles de phosphodiestérases (PDEs) dans la régulation de la signalisation dépendante de l’AMPc (PDE-AMPc) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs), et d’autre part, d’évaluer leur implication fonctionnelle dans la réactivité vasculaire et leur altération potentielle dans un modèle physiopathologique, l’insuffisance cardiaque (IC). Mon travail s’est articulé autour de deux modèles de muscle lisse vasculaire : (1) des CMLVs isolées en culture ayant acquis un phénotype synthétique sur lesquelles une approche d’imagerie en temps réel (FRET : Transfert d’Energie de Fluorescence par Résonance) a été appliquée afin de visualiser in situ la dynamique spatiotemporelle des signaux dépendants de l’AMPc. Nos résultats indiquent que, dans ces cellules, l’augmentation des niveaux d’AMPc provoquée par la stimulation β-adrénergique (β-AR) implique différents récepteurs suivant le compartiment intracellulaire considéré (β1- et β2-ARs dans le cytosol et seulement β2-ARs dans le compartiment sous-membranaire). Nous avons par ailleurs observé que l’expression des ARNm des différentes isoformes de PDE-AMPc et la contribution fonctionnelle de ces enzymes dans la régulation des signaux AMPc intracellulaires étaient dépendantes de la densité des CMLVs en culture.(2) des anneaux d’artères intactes issues de deux lits vasculaires différents (aorte et artère mésentérique) isolées à partir de rats sains et IC, permettant d’étudier leur fonction contractile et donc la régulation de celle-ci par la voie de l’AMPc. Nous avons montré que les familles de PDE-AMPc contribuent de façon différente au contrôle du tonus vasculaire dans l’aorte thoracique (PDE3 = PDE4 sans participation de la PDE2) et dans l’artère mésentérique (PDE4 > PDE2 sans participation de la PDE3), l’endothélium exerçant un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de ces PDEs musculaires lisses, notamment par le biais de la production de NO. Nous avons également mis en évidence des altérations de la réactivité vasculaire, et notamment de son contrôle par la voie de l’AMPc/PDE, dans notre modèle de rat IC. Dans l’aorte, la dysfonction endothéliale liée à l’altération de la voie du NO est à l’origine d’une augmentation de l’activité PDE3 masquant l’activité PDE4 et la relaxation β-adrénergique. Dans l’artère mésentérique des rats IC, dont la fonction endothéliale apparaît préservée, les PDE2, 3 et 4 restent fonctionnelles.L’ensemble de nos travaux souligne le rôle essentiel des PDEs dans la régulation de la signalisation AMPc vasculaire, et montre que l’activité et la fonction des différentes familles de PDE-AMPc sont finement modulées par de nombreux paramètres (phénotype et densité cellulaire des CMLVs) ou situations physio-pathologiques (nature du lit vasculaire, présence de l’endothélium, situation d’IC). / The aim of my thesis was to investigate the role of cyclic nucleotide phosphodiesterases (cAMP-PDEs) in the regulation of cAMP-dependent signaling in vascular smooth muscle cells (VSMCs), and to assess their functional involvement in vascular reactivity and their potential alteration in a pathophysiological model of heart failure (HF). My work was based on two models of vascular smooth muscle:(1) Isolated VSMCs in culture having acquired a synthetic phenotype, in which an approach of real-time imaging (FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer) was applied in situ to visualize the spatiotemporal dynamics of cAMP-dependent signals. Our results indicate that, in these cells, increased levels of cAMP induced by β-adrenergic stimulation (β-AR) involve different β-ARs subtypes according to the intracellular compartment considered (β1-and β2-ARs in the cytosol and only β2-ARs in the submembrane compartment). We also observed that the mRNA expression of cAMP-PDEs isoforms and the functional contribution of these enzymes in the regulation of intracellular cAMP signals were dependent on the VSMCs seeding density in culture.(2) Arterial blood vessels from two different vascular beds (aorta and mesenteric artery) isolated from healthy and HF rats, to study their contractile function and thus the regulation by the cAMP pathway. We showed that cAMP-PDE families contribute differently to the control of vascular tone in the thoracic aorta (PDE3 = PDE4, no PDE2) and mesenteric artery (PDE4 > PDE2, no PDE3), endothelium exerting a crucial role in the regulation of their functional activities, especially through the production of nitric oxide (NO). We also demonstrated alterations in vascular reactivity during HF, including its control through the cAMP-PDEs. In the aorta, endothelial dysfunction associated with the alteration of the NO pathway leads to an increase in PDE3 activity which masks PDE4 activity and β-AR relaxation. In mesenteric artery from HF rats, endothelial function is preserved and PDE2, 3 and 4 are functional.This study underlines the importance of PDEs in regulating vascular cAMP signaling, and shows that the activity and function of different cAMP-PDE families are tightly modulated by many parameters (VSMCs phenotype and seeding density) and/or physiopathological situations (vascular bed, endothelium and HF).

La voie β-adrénergique (β-AR)/AMPc est cruciale pour l’adaptation de la fonction cardiaque. Dans l’insuffisance cardiaque (IC), cette signalisation est perturbée et une part importante des patients meurt de troubles du rythme. Classiquement, les effets inotrope et lusitrope positifs de l’AMPc sont attribués à la phosphorylation par la protéine kinase AMPc dépendante (PKA) des protéines clés du couplage excitation–contraction (CEC). L’AMPc active aussi le facteur d’échange Epac, impliqué dans l’hypertrophie cardiaque et le contrôle de l’homéostasie calcique. Une cible d’Epac est la CaMKII, une kinase modulée par le Ca2+ et la calmoduline qui phosphoryle aussi les protéines clés du CEC, et dont l’activation est pro-arythmique.Les phosphodiestérases (PDEs) de type 3 et 4 sont majeures pour dégrader l’AMPc et contrôler l’homéostasie calcique et le CEC. Les inhibiteurs de PDE3 sont de puissants cardiotoniques mais leur utilisation est limitée par leurs effets pro-arythmiques. De plus, l’invalidation de gènes codant pour PDE4 conduit à des arythmies ventriculaires. Mon travail a permis d’identifier les perturbations de l’homéostasie calcique responsables de la survenue d’arythmies lorsque l’activité des PDE3 et des PDE4 est diminuée. Mes résultats montrent que les inhibiteurs de PDEs exercent des effets inotropes via PKA, mais suscitent des vagues de Ca2+ pro-arythmiques impliquant la PKA et la CaMKII activée en partie via Epac. Ceci suggère l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de CaMKII comme compléments aux inhibiteurs de PDEs pour limiter leurs effets délétères, une hypothèse que j’ai pu vérifier dans un modèle porcin plus proche du patient. / The β-adrenergic pathway (β-AR)/cAMP is crucial for the adaptation of the cardiac function upon stress. In heart failure (HF), this signaling pathway is disrupted and a significant proportion of patients dies of cardiac arrhythmias. Classically, the inotropic and lusitropic effects of cAMP are attributed to the phosphorylation by the cAMP-dependent protein kinase (PKA) of the key proteins of the excitation-contraction coupling (ECC). cAMP also activates the exchange factor Epac, which is involved in cardiac hypertrophy and controls intracellular Ca2+ homeostasis. Epac activates CaMKII, another kinase modulated by Ca2+ and calmodulin which phosphorylates the same key proteins of the ECC, and is involved in arrhythmogenesis.Phosphodiesterases (PDEs) type 3 and 4 are crucial enzyme to degrade cAMP and to control Ca2+ homeostasis, thus ECC. PDE3 inhibitors are potent cardiotonic drugs but their use is limited by their pro-arrhythmic effects. Furthermore, the invalidation of genes encoding PDE4 results in ventricular arrhythmias. My work allowed characterizing the perturbations of Ca2+ homeostasis which lead to arrhythmias when PDE3 and PDE4 activities are decreased. My results show that PDE inhibitors exert inotropic effects via PKA, but evoke pro-arrhythmic Ca2+ waves via both PKA and CaMKII, the latter being activated in part via Epac. Altogether, these results suggest the potential use of CaMKII inhibitors as adjuncts to PDEs inhibitors to limit their deleterious effects, a hypothesis I also tested in a porcine model closer to the patient.

La calcification de la valve aortique (CVA) est une maladie cardiovasculaire de plus en plus répandue, particulièrement en Amérique du Nord. Elle cause le rétrécissement de la valve aortique et le seul traitement actuellement disponible est le remplacement chirurgical. Des études menées par le Dr Patrick Mathieu (Institut de Cardiologie et de Pneumologie de Québec) ont montré qu’une surexpression d’une ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase de type 1 (ENPP1) est à l’origine de cette sténose. Une solution à cette maladie serait donc de trouver un inhibiteur d’ENPP1. Inspirées des travaux du groupe de Pfizer visant ENPP1 pour le traitement de la chondrocalcinose articulaire et l’ostéoarthrite, quelques familles d’inhibiteurs de type quinazoline-4-pipéridine sulfamides (QPS) ont été synthétisés et testées in vitro. Une étude en modélisation moléculaire sur le site potentiel de liaison des inhibiteurs sur ENPP1 est en cours, en collaboration avec le Pr Patrick Lagüe (Université Laval, Département de biochimie, microbiologie et bio-informatique) et son équipe pour optimiser le design de la structure des composés. Les composés d’une des familles, les QPS-pyrimidine, ont été testés in vitro sur quelques lignées cellulaires cancéreuses (HT-1080, HT-29, M21 et MCF-7) pour mesurer leur activité antiproliférative. Ces composés ont une inhibition de croissance médiane (IC50) de l’ordre du micromolaire et représentent donc un point de départ intéressant pour la mise au point de nouveaux traitements anticancéreux. / The calcification of the aortic valve (CAV) is a cardiovascular disease increasingly widespread, particularly in North America. It causes narrowing of the aortic valve and currently available only treatment is surgical replacement. Studies by Dr. Patrick Mathieu (Institute of Cardiology and Pneumology of Quebec) showed that overexpression of an ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase type 1 (ENPP1) is the origin of the stenosis. A solution to this disease would be to find an inhibitor of ENPP1. Inspired by Pfizer’s group works on ENPP1 for the treatment of osteoarthritis and chondrocalcinosis, some members of the quinazoline-4-piperidine sulfonamides (QPS) inhibitor family were synthesized and tested in vitro. A study in molecular modelling on the potential binding site inhibitor on ENPP1 is underway in collaboration with Prof. Patrick Lagüe (Université Laval, Department of biochemistry, microbiology and bioinformatics) and his team to optimize the design of compounds structure. The compounds of one family, the QPS-pyrimidine, were tested in vitro on some cancer cell lines (HT-1080, HT-29, M21 and MCF-7) to measure their antiproliferative activity. These compounds have a median growth inhibition (GI50) in the micromolar range and thus represent an interesting starting point for the development of new cancer treatments.

La calcification de la valve aortique (CVA) est l’un des plus importants types de maladies cardiovasculaires dans les pays industrialisés. Il s’agit notamment de la condition la plus fréquente de valvulopathie cardiaque aux États-Unis et en Europe de l’Ouest. À ce jour, il n’existe aucun agent thérapeutique pour guérir ou prévenir la progression de la maladie et le remplacement chirurgical de la valve aortique est réalisé uniquement pour les patients ayant atteint un stade sévère de la maladie. Un facteur clé dans le processus de calcification est le pyrophosphate inorganique extracellulaire (PPi) qui agit en tant qu’inhibiteur de calcification. Il est donc nécessaire de maintenir les niveaux de PPi à une certaine concentration pour contrôler les dépôts de calcium dans les tissus afin d’éviter la minéralisation pathologique. Des études récentes, réalisées dans le laboratoire du Dr Patrick Mathieu (Faculté de médecine, U. Laval), ont montré qu’une enzyme régulant les niveaux de PPi était impliquée dans la maladie. En effet, une augmentation de l'expression et de l'activité d'une ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase de type 1 (NPP1) favorise le processus de minéralisation dans la valve aortique. L’inhibition de cette enzyme représente donc un enjeu majeur dans le développement de médicaments, d’où la naissance de mon projet dans le design et la synthèse d’inhibiteurs de NPP1. Dans la présente thèse, une librairie de molécules a été développée. Dans un premier temps, la littérature nous a guidés quant au choix d’une structure phare d’inhibiteur. Par la suite, des modifications structurales de cette dernière appuyées par la modélisation moléculaire et les résultats biologiques ont permis d’établir des relations structure-activité pour l’inhibition de NPP1. Enfin, parmi les nombreux inhibiteurs synthétisés, il sera possible de réaliser une étude in vivo pour l’un des composés afin de mieux évaluer le potentiel thérapeutique de ce dernier. / Calcific aortic valve disease (CAVD) is one of the most important types of cardiovascular diseases in industrialized countries. In particular, CAVD is the most common heart valve disorder in the United States and Western Europe. So far, there are no therapeutic agents available to cure or prevent progression of aortic valve mineralization and valve replacements are performed only when the disease stage is advanced. Extracellular inorganic pyrophosphate (PPi) acting as an inhibitor of calcification is a key factor in the calcification process. Therefore, PPi levels must be maintained at certain concentration which control calcium deposits in tissues in order to avoid pathological mineralization. Recent studies from Mathieu group (Faculty of medicine, U. Laval) have shown that an enzyme which regulates PPi levels was involved in CAVD. Indeed, an increase of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (NPP1) enzymatic activity promotes mineralization process in the aortic valve. Therefore, NPP1 inhibition represents a major challenge in drug development, hence the origin of my research project for the design and the synthesis of NPP1 inhibitors. In this thesis, a library of compounds has been developed. First, literature was very helpful for choosing a lead compound. Then, structure diversification of this compound supported by molecular modelling and biological results allowed us to establish a structure-activity relationship for NPP1 inhibition. Among the synthesized inhibitors, it will be possible to realize an in vivo study for one of them in order to evaluate its therapeutic potential.