Au cours de ce projet, nous avons émis l'hypothèse que les cellules cancéreuses en circulation ursupent les mécanismes utilisés par les cellules du système immunitaire pour lier l'endothélium, le traverser et former des métastases. En ce sens, nous avons observé en conditions dynamiques que la E-sélectine est nécessaire à l'adhérence puis au roulement des cellules cancéreuses de côlon HT-29 à la surface des cellules endothéliales. L'utilisation de divers variants de la Esélectine nous a permis de confirmer l'importance de sa portion cytoplasmique pour l'adhérence et le roulement des cellules cancéreuses. En utilisant une chambre à flux laminaire et un substitut vasculaire tridimensionnel construit par génie tissulaire, nous avons identifié trois mécanismes de diapédèse. Ainsi, 1) la majorité des cellules cancéreuses ne complètent pas le processus de diapédèse et restent au niveau des cellules endothéliales (diapédèse de type mosaïque), 2) certaines passent aux jonctions interendothéliales (diapédèse paracellulaire), 3) tandis que d'autres passent au travers de la cellule endothéliale (diapédèse transcellulaire). Nous avons aussi déterminé que l'activation de la E-sélectine conduit à celle des MAP kinases ERK et p38. Au moyen d'approches génétiques et d'inhibiteurs chimiques, nous avons par la suite démontré que l'activation de ces voies par la E-sélectine est requise pour la diapédèse des cellules cancéreuses, via le mécanisme paracellulaire. L'activation de p38 régule la diapédèse des cellules HT-29 en modulant la phosphorylation de la myosin light chain (MLC) et la formation de fibres de tension. D'autre part, l'activation de ERK par la E-sélectine régule l'ouverture des jonctions interendothéliales en initiant l'activation de c-Src et la dissociation du complexe VEcadhérine/p-caténine. Nous concluons que la E-sélectine est essentielle à l'adhérence des cellules cancéreuses de côlon HT-29 et que sa stimulation régule l'extravasation des cellules cancéreuses en initiant l'activation des voies MAP kinases ERK et p38 qui toutes deux contribuent à moduler l'intégrité de la barrière endothéliale et la diapédèse de type paracellulaire. / In the present work, we have investigated the mechanisms by which adhesion of colon cancer cells to E-selectin expressed by endothelial cells regulates the endothelial barrier function and modulates cancer cell transmigration. Several Ones of evidence indicate that cancer cells could use the inflammatory system to interact with the endothelium, to transmigrate and form metastases. Accordingly, we have observed in static and dynamic conditions that E-selectin was essential for the adhesion and rolling of HT-29 colon cancer cells on endothelial cells. By using various E-selectin constructs, we further found that both processes required the cytoplasmic portion of E-selectin. Moreover, the use of a laminar flux chamber and a vascular tridimensional substitute constructed by tissue engineering, permits to identify three diapedesis mechanisms. 1) The majority of cancer cells did not complete the diapedesis process and remained between endothelial cells (mosaic diapedesis), 2) some migrated at interendothelial junctions (paracellular diapedesis) and 2) some passed through an endothelial cell (transcellular diapedesis). We have also found that the activation of E-selectin by the adhesion of HT-29 cells, in a static or a dynamic conditions, resulted in an increased activity of ERK and p38 MAP kinases. In turn, activation of p38 and ERK enhanced transendothelial permeability and paracellular migration of HT-29 cells. We also obtained evidence suggesting that p38-mediated increase in transendothelial permeability and cancer cell migration depends on a myosin light chain (MLC) phosphorylation-mediated formation of stress fibers. On the other hand, the activation of ERK by E-selectin modulated the opening of interendothelial spaces by initiating the activation of c-Src kinase activities and the dissociation of the VE-cadherin/p-catenin complex. Thus, we conclude that E-selectin is essential for HT-29 cancer cells adhesion and that its activation regulates the extravasation of colon cancer cells by initiating p38- and ERK-dependent mechanisms that both contribute to the regulation of the integrity of the endothelial barrier and paracellular diapedesis.

La perte de l’intégrité et de la perméabilité sélective de la barrière endothéliale est un évènement précoce dans la séquence des lésions oxydatives responsables de l’athérosclérose, de l’hypertension et de l’épanchement de cellules cancéreuses durant la dissémination métastatique. Nous avons déjà démontré que la phosphorylation de la Ser283 de la tropomyosine-1 (Tm1) par la DAPK1, en aval de la voie ERK1/2, est nécessaire à la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales exposées aux stress oxydant. La perméabilité endothéliale et la migration transendothéliale de carcinomes du côlon ont été mesurées par des essais de perméabilité et de migration en chambre de Boyden. L’usage d’ARNi et des formes sauvages et mutantes de la Tm1 ont permis de démontrer que la phosphorylation de la Tm1 est un évènement clé nécessaire dans les mécanismes de protection contre la dysfonction endothéliale lorsque l’endothélium est soumis à un stress oxydant. / Loss of endothelial cell integrity and selective permeability barrier is an early event in the sequence of oxidant-mediated injury and may result in atherosclerosis, hypertension, and facilitation of transendothelial migration of cancer cells during metastasis. We already showed that phosphorylation of tropomyosin-1 (Tm1) at Ser283 by DAPK1, downstream of the ERK1/2 pathway, is necessary to stress fibers formation in endothelial cells in response to oxidative stress. Endothelial permeability and transendothelial migration of colon cancer cells were evaluated by Boyden chamber assays. Use of siRNA and wild-type and mutated forms of Tm1 provide evidence indicating that phosphorylation of Tm1 is a key event required inside protection mechanism against endothelial barrier dysfunction associated with oxidative stress injury.

L’extravasation des cellules cancéreuses circulantes est importante pour la dissémination métastatique qui est initiée par l’adhérence de cellules cancéreuses aux cellules endothéliales vasculaires. Elle nécessite l’interaction entre les récepteurs d’adhérence comme E-sélectine sur les cellules endothéliales et leurs ligands sur les cellules cancéreuse. Notamment, E-sélectine influence le potentiel métastatique des cancers du sein, de la vessie, de l’estomac, du pancréas et du côlon, des leucémies et lymphomes. Ici on montre que l’expression de E-sélectine est ciblée par deux groupes distinctifs de microRNAs (miRNAs); i.e. miR-31, qui cible directement le mRNA de E-sélectine, et miR-146a et -181a/b, qui répriment l’expression de E-sélectine, indirectement en ciblant la voie de NF-κB en amont. La voie des MAP kinases joue un rôle pivot dans la transcription de deux de ces miRNAs en réponse à l’IL-1β, étant donné que p38 et JNK contrôlent la transcription de miR-31, et que p38, ERK et JNK médient la transcription de miR- 146a. Les facteurs de transcription en aval des MAP kinases, GATA2, c-Fos et c-Jun, modulent la transcription de ces deux miRNAs. L’inhibition de p38 augmente l’activité de NF-κB au moins partiellement par miR-146a. L’inhibition de p38 augmente aussi l’expression de Esélectine au niveau post-transcriptionnel en diminuant miR-31. En réponse à l’IL-1β, p38 MAP kinase réprime donc l’expression de E-sélectine aux niveaux transcriptionnel et posttranscriptionnel via miR-146a et miR-31, respectivement. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel p38 inhibe l’expression de E-sélectine par les miRNAs suivant une stimulation pro-inflammatoire. L’inhibition de E-sélectine médiée par miR-31/-146a diminue le potentiel métastatique de cellules de cancer du côlon en réduisant leur adhérence à l’endothélium, et leur migration transendothéliale. Ces résultats soulignent pour la première fois que les miRNAs médient l’extravasation des cellules du cancer du côlon dépendante de E-sélectine. / Extravasation of circulating cancer cells is a key event of metastatic dissemination that is initiated by the adhesion of cancer cells to vascular endothelial cells. It requires the interaction between adhesion receptors such as E-selectin present on endothelial cells and their ligands on cancer cells. Notably, E-selectin influences the metastatic potential of breast, bladder, gastric, pancreatic, and colorectal carcinoma as well as of leukemia and lymphoma. Here, we show that E-selectin expression is targeted by two distinct sets of microRNAs (miRNAs); i.e. miR-31, which targets E-selectin mRNA directly, and miR-146a and -181a/b, which repress E-selectin expression indirectly by targeting the upstream pro-inflammatory NF-κB pathway. MAP kinases play pivotal roles in the transcription of some of these miRNAs in response to IL-1β, in that p38 and JNK control the transcription of miR-31, and that p38, ERK and JNK mediate the transcription of miR-146a. The downstream transcription factors of MAK kinases, namely GATA2, c-Fos and c-Jun modulate the transcription of both miRNAs. Inhibiting p38 MAP kinase increases NF-κB activity, at least partially via miR-146a. Inhibiting p38 also increases the expression of E-selectin at the post-transcriptional level via decreasing miR-31. In response to IL-1β, p38 MAP kinase hence represses the expression of E-selectin at the transcriptional and the post-transcriptional levels, via miR-146a and miR-31, respectively. These results highlight a novel mechanism by which p38 downregulates the expression of E-selectin through microRNAs following inflammatory stimuli. The miR-31/-146a-mediated repression of E-selectin impairs the metastatic potential of colon cancer cells by decreasing their adhesion to, and migration through, the endothelium. These results highlight for the first time that miRNAs mediate E-selectindependent extravasation of colon cancer cells.

La E-sélectine, un récepteur d'adhérence spécifique des cellules endothéliales interagit avec le Death Receptor 3 (DR3), exprimé par les cellules du cancer du côlon. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux mécanismes par lesquels les voies activées en aval de DR3 confèrent des avantages de survie aux cellules cancéreuses du côlon. Dans un premier temps, nous avons montré que DR3 est exprimé par les cellules HT29 sous une version potentiellement sécrétée et sous une forme membranaire toutes deux tronquées. Ces versions dépourvues de Death Domain n’induisent pas l'apoptose. Secondairement, nous avons constaté que la E-sélectine déclenche la phosphorylation sur tyrosine du récepteur via un membre de la famille des Src kinases. Nous avons finalement obtenu des preuves indiquant que la E-sélectine comme le TL1A activent l’axe de survie PI3K/Akt/ NFB. / E-selectin, a specific endothelial adhesion receptor, interacts with Death Receptor 3 (DR3) expressed by colon cancer cells. In this study, we investigated further the mechanisms by which the E-selectin-activated pathways downstream of DR3 confer a survival advantage to colon cancer cells. We found that DR3 exists under both transmembrane and secreted versions in HT29 cells. These Death Domain deleted isoforms hamper apoptosis. Additionally, we found that E-selectin could trigger the tyrosine phosphorylation Tyr285 of DR3 in a Src family member-dependent manner. We also obtained evidence indicating that E-selectin and TL1A induce the PI3K/Akt/NFκB p65 survival axis.