Le procédé par lequel des forces sont transformées en signaux chimiques joue un rôle fondamental dans de nombreux processus biologiques. Ce travail de thèse a permis de mettre au point de nouvelles surfaces fonctionnelles synthétiques permettant de mimer ce comportement. Il s’agit plus précisément de contrôler l’adsorption d’objets biologiques tels que des protéines ou des cellules sur un support élastique modifié par plasma et présentant des récepteurs spécifiques. Ces récepteurs sont masqués par de longues chaînes de poly(éthylèneglycol) (PEG) qui sont également greffées sur la surface. L'étirement de celles-ci permet d'exhiber les sites d’adsorption ou les sites d'adhésion et de rendre ainsi la surface adhérente. Notre méthode est basée sur la polymérisation plasma de l’anhydride maléique. Cette fonctionnalisation permet de greffer à la surface de films silicones des fonctions carboxylique qui servent de points d’ancrage aux chaînes de PEG. Sur le même principe, la biotine ou les peptides d’adhésion (RGD) sont greffés dans un deuxième temps sur ce substrat. Nous montrons, qu’à l’état non étiré, ces ligands ne sont pas accessibles pour leurs récepteurs. Par contre, à l’état étiré, la surface devient spécifiquement adsorbante pour la streptavidine, l’anti-biotine et adhérente pour les cellules. Ces phénomènes sont parfaitement réversibles. / The process by which forces are converted into chemical signals play a fundamental role in many biological processes. This thesis has to develop new functional synthetic surfaces to mimic this behavior. It is more precisely to control the adsorption of biological objects such as proteins or cells on an elastic support modified by plasma and presenting specific receptors. These receptors are masked by long chains of poly (ethylene glycol) (PEG) which are also grafted onto the surface. Stretching allows them to exhibit adsorption sites or adhesion sites and thus make the surface adhesive. Our method is based on the plasma polymerization of maleic anhydride. This functionalization can be grafted to the surface of silicone films carboxylic functions which serve as anchors points for the PEG chains. On the same principle, biotin or adhesion peptides (RGD) have been grafted in a second time on this substrate. We show that the non-stretched state, these ligands are not accessible to their receptors. On the other side, in the stretched state, the surface becomes specifically adsorbent to streptavidin, anti-biotin and also adherent for cells. These phenomena are perfectly reversible.

Les encéphalites limbiques à autoanticorps anti-CASPR2 sont des atteintes du système nerveux central caractérisées par des troubles de la mémoire et des crises d’épilepsie. La protéine CASPR2 (Contactin-associated protein-like 2), avec son partenaire TAG-1, est connue pour son rôle dans le rassemblement des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv1.1 et Kv1.2) dans la région juxtaparanodale des nœuds de Ranvier ; régions essentielles pour la conduction rapide des messages nerveux. Par ailleurs, de plus en plus d’études suggèrent un rôle de CASPR2 dans la plasticité synaptique et l’excitabilité neuronale, en lien avec les symptômes observés chez les patients présentant des anticorps anti-CASPR2. Cependant, le rôle pathogénique des anticorps anti-CASPR2 dans les encéphalites limbiques reste loin d’être compris. Au cours de ma thèse, j’ai souhaité améliorer la connaissance des mécanismes pathologiques des anticorps anti-CASPR2 de patient dans l’encéphalite limbique auto-immune. Pour cela, j’ai déterminé les caractéristiques biologiques des anticorps anti-CASPR2, suggérant un rôle direct des anticorps sur la fonction de CASPR2 en ciblant les domaines N-terminaux de la protéine. De plus, j’ai identifié deux mécanismes d’action potentiels des anticorps anti-CASPR2 sur l’interaction entre CASPR2 et TAG-1 et sur l’expression des canaux Kv1.2 en surface. Ces travaux impliquent d’avantage les anticorps anti-CASPR2 dans la pathogénicité des encéphalites limbiques auto-immunes / Anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis is a central nervous system disorder characterized by memory disorders and epilepsy. CASPR2 (Contactin-associated protein-like 2) with its partner TAG-1, is known for its role in the clusterisation of voltage-dependent potassium channels (Kv1.1 and Kv1.2) in the juxtaparanodal region of node of Ranvier; which are essential for the rapid conduction of nerve signals. In addition, an increasing number of studies suggest a role of CASPR2 in synaptic plasticity and neuronal excitability, in relation with the symptoms observed in patients with anti-CASPR2 antibodies. However, the pathogenic role of anti-CASPR2 antibodies in limbic encephalitis remains far from clear. During my thesis I wished to improve our understanding of the mechanisms mediated by anti-CASPR2 antibodies in limbic encephalitis. To this end, I determined the biological characteristics of anti-CASPR2 antibodies, suggesting a direct role of antibodies on CASPR2 function by targeting its N-terminal domains. Furthermore, I identified two potential mechanisms of anti-CASPR2 antibodies on CASPR2/TAG-1 interaction and on Kv1.2 cell surface expression. These works further implicate anti-CASPR2 antibodies in the pathogenicity of autoimmune limbic encephalitis

L'objectif de cette étude s'inscrit dans une démarche de développement de céramiques apatites phosphocalciques et de leur évaluation biologique. Les matériaux étudiés sont des hydroxyapatites silicatées ou carbonatés denses en monophasées. Il s'agit d'un travail interdisciplinaire, qui va de la synthèse et la mise en œuvre de matériaux céramiques à la biomécanique cellulaire et les essais de cultures cellulaires in vitro. La dimension originale du projet concerne le suivi de la réponse des cellules osseuses déposées sur ces céramiques par l'indentation à l'aide d'un AFM. Ces travaux montrent d'une part, que la bioactivité des matériaux étudiés était semblables et d'autre part, que la relaxation de cellules ensemencées sur TA6V et hydroxyapatite stochiométrique suivent une loi puissance (exposant ≈ 0.2) sur 2-200 secondes. La méthode originale utilisée montre par ailleurs que la relaxation d'une fibre d'actine est différentiable de la relaxation de la membrane cellulaire.

Ce manuscrit présente une étude des cinétiques de réactions ligand-récepteur sur des surfaces en regard, fondée sur l'utilisation de particules magnétiques colloïdales. Notre démarche repose sur la mesure de cinétiques de formation de doublets indépendants de particules, déclenchée par l'application d'un champ magnétique. Ces mesures sont directement reliées aux constantes cinétiques du couple ligand-récepteur à la surface des particules magnétiques. En considérant le couple streptavidine-biotine, nous avons validé notre approche et mis en évidence une source de variabilité des constantes d'association en surface : le degré de confinement des réactifs sur les surfaces. Pour les configurations les plus rapides, nous avons appréhendé la constante d'association comme limitée par des processus de diffusion, associés à la dynamique des particules colloïdales. Pour les configurations les plus lentes, où les réactifs sont les plus confinés en surface, le ralentissement observé est attribué à une diminution de l'efficacité des rencontres entre réactifs. Nous avons également étudié la cinétique d'association entre cadhérines, molécules directement impliquées dans l'adhésion cellulaire. Nous avons mis en évidence l'influence des conditions de contact sur l'état d'adhésion entre cadhérines. Pour les deux états d'adhésion « profonds » observés, nous avons mesuré une constante cinétique d'association plus lente que celle de l'interaction streptavidine-biotine.

Ces travaux de thèse portent sur l'étude expérimentale des propriétés physiques et de la biomécanique des agrégats cellulaires embryonnaires. Le but de cette thèse était d'une part de mieux comprendre l'origine biologique de la viscosité et de la tension de surface tissulaire, d'autre part d'étudier quantitativement en détail l'élasticité cellulaire par des nouvelles mesures de rhéologie en cisaillement. Un premier chapitre concerne les mesures de tension de surface tissulaire par la méthode de compression et de viscosité tissulaire par analyse de la cinétique de fusion de deux agrégats en faisant varier comme paramètre principal la contractilité cellulaire que certains suspectent comme étant la principale origine biologique de ces paramètres. Nous utilisons le formalisme du DITH (Haris, 1976: Differential Interfacial Tension Hypothesis) pour interpréter les données. Le deuxième chapitre concerne les mesures rhéologiques en cisaillement à l'aide d'un rhéomètre commercial plan-plan sur plusieurs centaines ou milliers d'agrégats cisaillés ensembles. Nous montrons que les cellules deviennent moins rigides pour une déformation minimale d'environ 4%, mais sur l'échelle de l'heure les cellules sont capables de se rigidifier à nouveau. Ces expériences sont analysées à l'aide d'un modèle de ressorts qui cassent sous contrainte puis se ressoudent à contrainte nulle.

Ce mémoire est consacré à la synthèse de récepteurs rédox-actifs du type calixphyrine-ferrocène, porphyrine-ferrocène et cyclopeptide-ferrocène, ainsi qu'à l'étude de leurs propriétés en reconnaissance électrochimique moléculaire.<br /> Des récepteurs moléculaires construits sur la base d'une métalloporphyrine de zinc directement connectée à des groupes ferrocène ont été appliqués à la détection de bases azotées neutres selon un processus original de coordination-décoordination du centre métallique de la porphyrine, ainsi qu'à une détection ampérométrique sélective sans précédent d'anions halogénure.<br /> De leur côté les calixphyrines-ferrocène, qui présentent des caractéristiques structurales et physico-chimiques remarquables en raison de l'interruption de la conjugaison du macrocycle tétrapyrrolique qui les caractérise, ont montré des propriétés originales de complexation et de reconnaissance d'anions et de cations en solution et à l'état solide. <br />Enfin, l'introduction de sondes rédox ferrocéniques sur un cyclodécapeptide de type RAFT a permis de réaliser la détection électrochimique d'anions dihydrogénophosphate. Cet assemblage RAFT-ferrocène, fonctionnalisés par des ligands endogènes de l'intégrine, a ensuite été appliqué à l'étude du processus d'adhésion cellulaire de cette protéine surexprimée sur de nombreuses lignées tumorales.

Les étapes d'adhésion et de fusion entre l'ovocyte et le spermatozoïde sont des étapes cruciales dans le processus de fécondation. Cependant, de nombreuses questions sont posées aujourd'hui à propos des processus moléculaires qui sous-tendent la réussite de ces étapes. Ces dernières années, un nombre important de molécules clés ont été identifiées comme ayant un rôle majeur dans l'interaction gamétique. A ce jour, la seule protéine membranaire connue dont l'absence cause un échec total de la fécondation est la protéine spermatique Izumo1.<br> Izumo1 est une protéine transmembranaire, membre de la famille des protéines Izumo et de la superfamille des Immunoglobulines. Malgré son rôle clé dans l'interaction gamétique, ses propriétés fonctionnelles en tant que protéine d'adhésion, de fusion ou ayant la capacité d'organiser des réseaux comprenant des protéines de fusion n'est pas encore élucidé.<br> Dans cette étude nous nous sommes intéressés au rôle d'Izumo1 dans l'interaction gamétique.<br> Pour cela, nous avons généré deux variantes exogènes de la protéine Izumo1et les avons surexprimées à la membrane de plusieurs lignées cellulaires. L'interaction entre ces cellules exprimant la protéine et l'ovocyte a été analysée au moyen d'une technique de micromanipulation de cellules couplée à l'imagerie confocale. Nous avons ainsi mis en évidence une forte adhésion entre les cellules exprimant Izumo1 et les ovocytes et nous avons quantifié sa cinétique. Nous avons également généré le domaine extracellulaire recombinant afin de déterminer si Izumo1 seule était capable de se lier directement à l'ovocyte et comment. Nous avons sondé au moyen d'une technique fine de mesure de forces, le biomembrane force probe, l'interaction entre un Izumo1 unique et l'ovocyte. Ces expériences permettent de confirmer que c'est bien Izumo1 et non un partenaire qui est responsable de la forte adhésion entre cellules et ovocytes. Par observation en microscopie confocale d'un ovocyte interagissant avec des cellules surexprimant Izumo1-GFP, nous avons observé l'accumulation d'Izumo1-GFP dans la zone d'adhésion. Le fait que ce processus se reproduise lorsque plusieurs cellules adhèrent à l'ovocyte suggère qu'Izumo1 possède une molécule partenaire largement exprimée à la membrane de l'ovocyte avec laquelle il interagit pour créer de l'adhésion.

Talin is a multifunctional cytoskeletal protein that plays a critical role in linking the actin cytoskeleton to the integrin family of transmembrane cell adhesion receptors. Two distinct integrin binding sites have been identified in talin, one present in the globular head domain (IBS1) and involved in integrin activation, and a second (IBS2), that has been delineated to a 130 residue fragment of the talin rod domain, but whose functional role is still elusive (Tremuth et al.2004). The objective of the present study was to define the minimal structure of talin IBS2 and to investigate its functional role in the integrin-cytoskeleton connection.<p>In the first part of this study, we used a combination of three different experimental approaches to define the minimal structure of talin IBS2: 1) an in silico bioinformatics approach to analyse sequence conservation of talin IBS2, 2) an in vivo cell biology approach to study the subcellular localization of recombinant talin fragments covering IBS2 in CHOáIIbâ3 cells, and 3) an in vitro biochemical approach consisting in protein overlay, pull down and Surface Plasmon Resonance (SPR) assays, to study the direct interaction between talin IBS2 and the integrin â3 subunit. We delineated IBS2 to a single amphipathic á-helical repeat of 23 residues within the talin rod domain. We further provided evidence that a two amino acid mutation(L2094I2095/AA) was sufficient to inactivate the IBS2 site, due to a disruption of the á helix structure, as demonstrated by infrared spectroscopy. In addition, we identified 2 lysine residues (K2085, K2089) exposed on the solvent face of á helix 50, which are directly involved in the talin IBS2-integrin interaction.<p>In the second part of this study, we investigated the functional role of talin IBS2 in spreading defective talin (-/-) cells and showed that in contrast to full-length wild type talin, an IBS2 LI/AA mutant talin was unable to fully rescue the spread phenotype of these cells. These results provide the first direct evidence that IBS2 in the talin rod is essential to link integrins to the actin cytoskeleton. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Au cours de la ventilation liquide totale (VLT), les cellules pulmonaires sont exposées à des perfluorocarbones (PFC) dont les propriétés physiques diffèrent fortement du milieu standard de culture cellulaire (DMEM) et encore plus des propriétés de l'air. Dans cette thèse nous étudions les effets d’une exposition au PFC sur la réponse des cellules épithéliales pulmonaires, en effectuant une étude approfondie des propriétés structurales, mécaniques et fonctionnelles. La réponse des cellules A549 (alvéolaire), HBE (bronchique) et AM (Macrophage alvéolaire) exposées au PFC est étudiée par comparaison au DMEM. Les variations de la structure de F-actine, de la densité d'adhésion focale et de la distribution du glycocalyx sont évaluées par fluorescence. Les changements de propriétés mécaniques et de paramètres d’adhésion sont mesurés par la Magnétocymétrie (MTC) étendue à l’analyse multiéchelle. La mécanique cellulaire est caractérisée par deux modèles microrhéologiques reflétant deux types de comportement possibles du cytosquelette (CSK). L'adhésion à la matrice cellulaire est analysée par un modèle stochastique de dé-adhésion, décrivant la composante non-réversible de la réponse cellulaire. Les rôles fondamentaux de la structure de F-actine et de la couche de glycocalyx sont respectivement évalués par dépolymérisation de F-actine et en dégradant le glycocalyx. Les résultats montrent que l'exposition au PFC induit un remodelage de la structure de F-actine, un affaiblissement du CSK et une diminution de l'adhésion. Ces résultats démontrent que le PFC déclenche une réponse particulière des cellules épithéliales caractérisée par une diminution de la tension intracellulaire, l'affaiblissement de l'adhésion et la redistribution du glycocalyx. L’origine de cette adaptation cellulaire est physique et très probablement reliée à l’augmentation de l'énergie interfaciale associée à la basse tension de surface d’un PFC chimiquement apolaire. La faible tension de surface du PFC est également responsable d'une augmentation de la compliance pulmonaire pendant VLT et a des impacts profonds dans les paramètres respiratoires, parallèlement à la modification de la réponse cellulaire. / During Total Liquid Ventilation (TLV), lung cells are exposed to perfluorocarbon (PFC) whose physical properties highly differ from aqueous medium (DMEM) standardly used for cell culture and farther air properties. In this thesis, we study the effects of PFC exposure on the response of pulmonary epithelial cell by performing a thorough assessment of their structural, mechanical and functional properties. The response of A549 cells (alveolar), HBE (bronchial), and AM (alveolar macrophages) exposed to PFC is studied by comparison to DMEM. Changes in F-actin structure, focal adhesion size and density and glycocalyx expression are evaluated by fluorescence. Changes in cell mechanics and adhesion parameters are measured by a multiscale Magnetic Twisting Cytometry (MTC) method. Cell mechanics is analyzed by two microrheological models reflecting two possible cytoskeleton features. Cell-matrix adhesion is analyzed by a stochastic multibond de-adhesion model describing the non-reversible component of the cell response by MTC. The key roles of F-actin structure and glycocalyx layer are established by respectively depolymerising F-actin and degrading glycocalyx. Results show that PFC exposure induces F-actin remodelling, cytoskeleton softening and adhesion weakening. They demonstrate that PFC triggers an epithelial cell response which is characterized by decay in intracellular tension, adhesion weakening and glycocalyx redistribution. The origin of this cellular adaptations is physical and most likely related to the increase in interfacial energy, associated to the low surface tension of the non polar perflurorocarbon, The low surface tension of PFC is also responsible for an increase in lung compliance during TLV and has deep impacts during ventilation parallel to the modification of cell response.

Le domaine général de cette thèse est l’étude des procédés physico-chimiques impliqués dans le développement du cancer et/ou leurs thérapies. La première partie est consacrée à la caractérisation des interactions mises en jeu lors de l’association de complexes du ruthénium avec la macromolécule d’ADN. La caractérisation expérimentale de cet équilibre est faite par des manipulations d’absorption UV-visible et de dichroïsme circulaire. Une méthode d’analyse originale est utilisée pour arriver à mettre en évidence la présence simultanée de deux modes d’associations. Un modèle à deux équilibres traduisant convenablement ces observations et permettant d’identifier les deux modes d’association est alors proposé. La deuxième partie constitue un travail préliminaire à l’étude des mouvements cellulaires sur un substrat mou. Des caractérisations du comportement des cellules en fonction de la rigidité de leur substrat a pu être mis en évidence et donnent des résultats similaires à la littérature. / The general area of this thesis is the study of physico-chemical processes involved in can- cer development and / or their therapies. The first part is devoted to the characterization of the interactions involved in the association of ruthenium complexes with the DNA macromolecule. Experimental characterization of this equilibrium is made by UV-visible absorption and circular dichroism experiments. An original method of analysis is used to highlight the simultaneous presence of two association modes. A two equilibria model fits correctly the experimental data and permits the identification of these two association modes. The second part is a preliminar work about cell movements on a soft substrate. Characterizations of cell behavior depending on the substrate rigidity has been highlighted and give similar results in the literature.