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Conception et développement d’hydrogels pour l’ingénierie tissulaire appliquée au tissu osseux / Design and development of hydrogels for bone tissue engineering

Maisani, Mathieu 22 September 2017 (has links)
Le besoin clinique de nouvelles stratégies pour pallier les limites des techniques actuelles dans le cas de régénération osseuse a permis l’émergence de l’ingénierie tissulaire osseuse. Les stratégies basées sur les techniques d’ingénierie tissulaire semblent être une alternative à l’utilisation de greffes et ainsi de s’affranchir des limites qu’elles présentent. L’approche adoptée dans le cadre de cette thèse consiste en le développement et l’utilisation d’hydrogels comme matériaux d’échafaudage pour le comblement et la régénération de tissus osseux. De nombreuses approches utilisant elles aussi des hydrogels existent, chacune possède ses avantages et limites. Dans ce contexte, nos travaux ont consisté en l’utilisation d’un hydrogel non-polymérique comme matériau de base dans le développement des stratégies. Brièvement, plusieurs types cellulaires sont présents au sein du tissu osseux et vont participer aux processus de formation et de régénération osseuse. L’objectif de nos stratégies a été l’apport de cellules souches exogènes puis leur différenciation en cellules ostéoformatrices, ou le recrutement et la différenciation des cellules de l’hôte en cellules ostéoformatrices. Le gel de GNF a été utilisé comme matrice tridimensionnelle pour ses propriétés d’injectabilité, de gélification en l’absence d’agent de réticulation toxique et son potentiel ostéoinducteur. Ce travail a consisté au développement de stratégies pour l’ingénierie tissulaire osseuse en associant le gel de GNF à une matrice naturelle de collagène cellularisée ou à des molécules bioactives pour promouvoir la régénération de lésions osseuses. Ces travaux ont permis de développer et caractériser des stratégies pertinentes pour la régénération de lésions osseuses basées sur l’utilisation d’hydrogels. / New strategies to overcome the clinical limitations of current techniques for bone defect filling and regeneration has led to the involvement of bone tissue engineering. Indeed, strategies based on tissue engineering techniques seem to be an alternative to the use of grafts and thus to defeat their limits. The approach employed in this thesis consists in development and use of hydrogels as scaffold materials for bone defect filling and regeneration. There are many approaches that also use hydrogels, each one with its advantages and limitations. In this context, our work consisted in the use of a non-polymeric hydrogel as basic material in the development of strategies for bone tissue engineering. Briefly, several cell types are present within bone tissue and will participate in the processes of bone formation and regeneration. The objective of our strategies was the contribution of exogenous stem cells and then their differentiation into osteogenic cells or the recruitment and differentiation of the host cells into osteogenic cells within the material. The GNF gel was used as a three-dimensional matrix considering its properties of injectability, gelation in the absence of toxic crosslinking agent and its osteoinductive potential. The goal was to develop strategies for bone tissue engineering by combining the GNF gel with a natural matrix of cellular collagen or bioactive molecules to promote the regeneration of bone lesions. This work allowed to develop and characterize strategies relevant to the regeneration of bone lesions based on the use of hydrogels.
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MATRICES FIBRILLAIRES DENSES DE COLLAGÈNE : MATÉRIAUX POUR LA RÉPARATION OSSEUSE ET L'ÉTUDE D'OSTÉOBLASTES EN TROIS DIMENSIONS

Vigier, Sylvain 23 October 2008 (has links) (PDF)
L'os, tissu conjonctif minéralisé, assure les fonctions de protection, de support et de motilité. De nombreuses pathologies osseuses requièrent l'utilisation d'implants naturels ou synthétiques et le vieillissement de la population accroît cette demande. La thèse a eu pour objet d'évaluer les potentiels de reconstruction osseuse de matériaux préparés à partir de solutions de collagène de concentration moyenne (5mg/mL) et haute (40mg/mL). Ces matériaux fibrillaires, simple à façonner, ont été caractérisés par microscopie photonique et électronique et comparés aux éponges de collagène déjà utilisées en thérapeutique. En culture in vitro à long terme, des ostéoblastes humains, primaires ou transformés, se multiplient et s'organisent en une monocouche épithélioïde sur les matrices à 5mg/mL, ou en cellules plates et allongées sur les matrices à 40mg/mL. La minéralisation des matrices, en conditions standard, n'a lieu qu'en présence d'ostéoblastes tandis que les éponges minéralisent de façon spontanée. Dans un défaut crânien engendré chez le rat, les matrices ont permit son comblement à plus de 80%. Elles sont colonisées par les ostéoprogéniteurs qui se différencient et synthétisent de l'os minéralisé ; leur concentration module leur dégradation. En contact en 3D avec le réseau fibrillaire les otéoblastes primaires apparaissent dendritiques et s'organisent en syncytium, reliés par des jonctions communicantes. Cette transition morphologique est décrite in vitro par une approche combinée de microscopies. Ces travaux valident l'utilité des matrices fibrillaires de collagène pour l'ingénierie de l'os. Ils confirment également l'intérêt que peut tirer la recherche fondamentale de disposer de matrices extracellulaires modèles.
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Associations cellules souches mésenchymateuses et céramiques pour l'ingénierie tissulaire osseuse : intérêt du milieu cellulaire et de l'environnement tridimensionnel sur la différenciation ostéoblastique / Associations of mesenchymal stem cells and ceramics for bone tissue engineering

Cordonnier, Thomas 29 October 2010 (has links)
Les affections ostéo-articulaires concernent des millions de personnes. L’ingénierietissulaire osseuse, associant cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) etmatériaux synthétiques, pourrait répondre aux besoins cliniques. Pour cela, les différentescomposantes de cette approche et leur association doivent être mieux étudiées pour la rendreutile cliniquement. Durant cette thèse, une première étude animale proche du cas cliniquenous a permis de définir les points à améliorer pour le traitement des pertes osseuses. Nousavons ainsi pu développer un milieu spécifique induisant une différenciation rapide etterminale des CSM en ostéoblastes. Par la suite, l’utilisation de particules de céramiquescomme support cellulaire nous a permis d’obtenir des hybrides riches en matriceextracellulaire. Cet environnement 3D biomimétique permet l’engagement spontané des CSMvers un phénotype ostéoblastique et l’obtention d’une quantité osseuse importante in vivo.L’ensemble de ces résultats met en évidence l’importance de l’environnement et du stade dedifférenciation cellulaire pour la formation osseuse par ingénierie tissulaire osseuse. / Osteo-articular disorders affect millions of people over the world. Bone tissueengineering, an approach combining human mesenchymal stem cells (MSC) and syntheticmaterials, could potentially fulfill clinical needs. However, the different components of thisapproach and their association should be investigated further to make it clinically useful. Inthis thesis, an initial animal study close to clinical situation allowed us to identify areas thatneed improvement for regenerating bone defect. We were then able to develop a specificmedium which induces a rapid and terminal osteoblastic differentiation of MSC.Subsequently, the use of ceramic particles as cell support has allowed us to obtain hybridmainly composed of extracellular matrix. This biomimetic 3D environment allowsspontaneous osteoblastic commitment of MSC and induces a large bone quantity in vivo.Overall, these results highlight the importance of the environment and the cell differentiationstate for bone formation using bone tissue engineering.
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Biochemical and microscale modification of polymer for endothelial cell angiogenesis / Fonctionnalisation de polymère par des ligands bioactifs et contrôle de leurs distributions à l'échelle micrométrique pour l'induction de l'angiogenèse

Lei, Yifeng 10 October 2012 (has links)
La création d'un réseau vasculaire fonctionnel est une préoccupation importante afin d'assurer la parfaite vitalité des produits d’ingénierie tissulaire (IT). La compréhension des mécanismes de l'angiogenèse est essentielle dans un objectif de synthèse de produits d’ingénierie tissulaire vascularisés. Dans ce travail, nous avons visé à caractériser le microenvironnement responsable de l'angiogenèse des cellules endothéliales (CEs). Pour cela, nous avons élaboré des biomatériaux bioactifs (polymères fonctionnalisés par des peptides, et contrôlé leur distribution à l'échelle micrométrique) afin de mimer une situation physiologique des CEs.Dans en premier temps, nous avons mis au point une stratégie de fonctionnalisation biochimique d’un matériau polymère (le polyéthylène téréphtalate, PET) en utilisant des peptides spécifiques des CEs. L'immobilisation de ces peptides a permis d’assurer une bioactivité de ces surfaces, et l’amélioration des fonctions des CEs comme l'adhésion, l’étalement et la migration cellulaire.Ensuite, notre travail s’est inscrit dans l’évaluation de l’impact d’une distribution contrôlée de peptides en surface de matériaux (acquise par photolithographie) sur le comportement des CEs et sur l’angiogenèse. Nos résultats ont montré que les CEs adhèrent et sont alignés sur les « micropatterns » peptidiques quelle que soit la taille de ces « micropatterns » (lignes de largeurs comprises entre 10 et 100 µm). Nous avons mis en évidence que la taille des « micropatterns » bioactifs a un réel impact sur le comportement des CEs (l’étalement, l'orientation et la migration cellulaire). La morphogenèse des CEs (la formation d’un « tube-like ») a été mise en évidence sur des matériaux microstructurés par des lignes peptidiques de 10 et 50 µm de largeur, quels que soient les peptides RGD ou SVVYGLR immobilisés en surface. Nous avons montré que la lumière de structures tubulaires peut être constituée d’une à quatre cellules selon la contrainte géométrique appliquée sur les « micropatterns ». Nos travaux ont montré que le « sprouting » ainsi que la formation du réseau vasculaire peuvent être induits seulement sur des surfaces « micropatternés » par des peptides SVVYGLR. Nos résultats démontrent que l'induction de l'angiogenèse est multiparamétrique. Celle-ci est dépendante de constituants biochimiques ainsi que de leur micro-distribution.Troisièmement, nous avons utilisé la modélisation mathématique pour comprendre l'impact de « micropatterns » bioactifs sur la migration des CEs. Un modèle de type continu Patlak-Keller-Segel a été utilisé, et les résultats numériques sont bien conformes avec nos résultats expérimentaux. Pour finir, nos travaux se sont focalisés sur l'étude de la stabilisation de ces structures tubulaires. Les résultats ont montré que les cocultures de CEs avec les péricytes, ainsi que le recrutement de composant de membrane basale (Matrigel) peuvent stabiliser ces structures vasculaires.En conclusion générale, le travail réalisé dans cette thèse a prouvé que le « micropatterning » des principes bioactifs sur polymères est efficace pour stimuler l'angiogenèse et pour construire une vascularisation fonctionnelle. Enfin, ce travail a permis de comprendre la biologie de l’angiogenèse et pourra aider indéniablement tous les travaux en cours s’inscrivant dans l’ingénierie tissulaire. / The creation of a functional vascular network is a major concern to ensure the vitality of perfect tissue engineered products. Understanding the mechanisms of angiogenesis is essential for the vascularization in tissue engineering. In this work, we aimed to characterize the microenvironment responsible for angiogenesis of endothelial cells. To achieve this request, we developed bioactive biomaterials (polymers functionalized mainly with peptides, and controlled their distribution at micrometer scale) to mimic a physiological microenvironment of endothelial cells. First, we developed the biochemical functionalized of polymer materials (polyethylene terephthalate, PET) using endothelial cell specific peptides. The peptide immobilization ensured the bioactivity onto material surfaces, and enhanced endothelial cell functions such as cell adhesion, spreading and migration. Second, we introduced photolithographical technique to control geometrical distribution of peptides on material surfaces, and studied the effects of peptide micropatterning onto endothelial cell (EC) angiogenesis. ECs were adhered and aligned onto peptides micropatterns whatever the size of peptide micropatterns. However, EC behaviors (cell spreading, orientation and migration) were significantly more regulated on smaller micropatterns (10 and 50 µm) than on larger stripes (100 µm). EC morphogenesis into tube formation can also switch onto the smaller micropatterns (10 and 50 µm) with either RGD or SVVYGLR peptides. The central lumen of tubular structures can be formed by single-to-four cells due to geometrical constraints applied on the micropatterns. Sprouting angiogenesis of ECs and vascular network formation can be induced on surfaces micropatterned with angiogenic SVVYGLR peptides. Our overall results revealed that the induction of angiogenesis is multi-parametric. This is dependent on biochemical constituents and their micro-distributions. Third, we employed mathematical modeling to understand the impact of bioactive micropatterns on endothelial cell migration. A continuous Patlak-Keller-Segel type model was used, and the numerical results were in well accordance with our experimental results.Furthermore, we also developed the study of stabilization of tubulogenenic structure in this thesis. The results showed that the co-cultures of endothelial cells with pericytes, as well as the recruitment of basement membrane components (Matrigel) can stabilize the vascular tube structures. In general conclusion, our work in this thesis proved that bioactive micropatterning of polymer is effective to stimulate angiogenesis and to construct functional vascularization. This work helps us to understand the fundamental biology of angiogenesis, and has great potential for application in tissue engineering.
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Recherche translationnelle appliquée au cartilage : approche multifactorielle combinant chondrocytes humains, facteurs de différenciation, biomatériaux et bioréacteurs pour la reconstruction du cartilage hyalin / Translational research for cartilage repair : multifactorial approach combining human chondrocytes, differentiation factors, biomaterials and bioreactors for the reconstruction of hyaline cartilage

Mayer, Nathalie 25 June 2014 (has links)
Les lésions de cartilage ne cicatrisent pas spontanément et la réparation de ce tissu est un challenge. Les techniques chirurgicales restant insatisfaisantes, la thérapie cellulaire et l'ingénierie tissulaire sont maintenant envisagées. La transplantation de chondrocytes autologues (TCA) existe déjà mais cette procédure nécessite l'amplification des chondrocytes qui s'accompagne d'une perte du phénotype différencié (dont l'indicateur est le collagène de type II), au profit d'un phénotype fibroblastique (dont l'indicateur est le collagène de type I, retrouvé dans les tissus fibreux). La TCA conduit donc à une greffe de chondrocytes dédifférenciés produisant un fibrocartilage, dont les propriétés mécaniques sont différentes du cartilage hyalin natif. L'objectif de mes travaux était de développer un nouveau kit d'ingénierie tissulaire du cartilage par association de chondrocytes humains, de biomatériaux et d'une sélection de facteurs solubles. Nous avons utilisé le cocktail FGF-2/insuline (FI) pour l'amplification cellulaire et le cocktail BMP-2/insuline/T3 (BIT) pour redifférencier les chondrocytes dans des éponges de collagène. Nos résultats ont montré que cette combinaison permet la synthèse d'une matrice cartilagineuse dans les supports collagène. Cependant, cette synthèse s'est trouvée favorisée en périphérie des éponges cultivées en conditions statiques. Nous avons ensuite utilisé un bioréacteur pour perfuser les éponges et nos résultats ont révélé alors un dépôt plus homogène de cartilage dans ces supports. De manière très intéressante, nous avons aussi observé l'arrêt de l'expression du collagène de type I. Ainsi, notre approche multifactorielle combinant des chondrocytes humains, des biomatériaux collagène, une combinaison FI-BIT et une culture en perfusion permet la reconstruction d'un cartilage non fibrotique / Cartilage lesions are irreversible and cartilage repair is challenging. Actual surgical techniques remain unsatisfactory and therefore, cell therapy and tissue engineering approaches are now considered. The Autologous Chondrocytes Transplantation (ACT) already exists but this procedure requires chondrocytes amplification. During this amplification, a dedifferentiation process occurs: chondrocytes lose their differentiated phenotype (characterized by type II collagen) towards a fibroblastic phenotype (characterized by type I collagen, a component of fibrous tissues). ACT leads to the graft of dedifferentiated chondrocytes, hence provoking the production of a fibrocartilage that presents different mechanical properties than native hyaline cartilage. The aim of my work was to develop a new kit of tissue engineering for cartilage repair using human chondrocytes, biomaterials and a selection of soluble factors. We used a cocktail of FGF-2 and insulin (FI) for cell amplification and a cocktail of BMP-2, insulin and T3 (BIT) for chondrocyte redifferentiation in collagen sponges. Our results showed that the combination allows the synthesis of a cartilaginous matrix in collagen scaffolds. However, matrix production is favored in periphery of the sponges cultivated in static conditions. A perfusion bioreactor was then used to perfuse the sponges and our results revealed a more homogeneous deposition of cartilage in the scaffolds. Very interestingly, we also noticed a stop of type I collagen expression. Thus, our multifactorial approach combining human chondrocytes, collagen scaffold, the combination FI-BIT and culture under perfusion allows the reconstruction of a non-fibrotic cartilage
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Etude de la Micro-Impression d'Eléments Biologiques par Laser pour l'Ingénierie du Tissu Osseux

Catros, Sylvain 22 November 2010 (has links)
L'ingénierie tissulaire osseuse est un domaine multidisciplinaire qui vise à produire des substituts tissulaires pour la médecine régénératrice. Ce travail visait à produire des substituts osseux structurés tridimensionnels grâce à un système d'impression d'éléments biologiques par laser développé au laboratoire Inserm U577 (Projet LASIT: LASer pour L'Ingénierie Tissulaire). Les étapes de la thèse ont consisté tout d'abord à préparer des matériaux adaptés à l'impression par laser et à les caractériser au niveau physico-chimique et biologique. Il s'agissait d'hydroxyapatite nano-cristalline, de cellules humaines et d'hydrogels (alginate, matrigel). Ensuite des impressions structurées combinant ces matériaux ont été réalisées en 3 dimensions avant d'être implantés in vivo chez la souris. Les résultats ont montré que l'impression par laser d'éléments biologiques est une méthode efficace pour organiser des matériaux tridimensionnels à plusieurs composants pour l'ingénierie tissulaire. / Bone Tissue Engineering is a multidisciplinary field which aims to produce artificial tissues for regenerative medicine. The purpose of this work was to produce three-dimensional bone substitute using a laser-assisted bioprinting (LAB) workstation developped in the laboratory INSERM U577 (TEAL Project: Tissue Engineering Assisted by Laser). The first step of the work consisted in the synthesis of specific materials for LAB and in the characterization of their biological and physico-chemical properties. We have prepared a nano-hydroxyapatite bioink, human cells bioinks and hydrogels bioinks. Then, three-dimensional materials have been prepared using LAB and have been implanted in vivo in mice. The results have shown that Laser Assisted Bioprinting is an efficient method fo patterning 3-D materials using biolgical elements.
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Développement de biomatériaux nanostructurés pour la régénération osseuse et ostéo-articulaire / Development of nanostructured biomaterials for bone and osteo-articular regeneration

Facca, Sybille 05 November 2012 (has links)
L'ingénierie tissulaire a vu émerger dans la dernière décennie, la nanomédecine régénérative en combinant non seulement les cellules souches mais aussi les facteurs de croissance. Le but de ce travail a été d'utiliser les techniques de l'ingénierie osseuse et cartilagineuse pour améliorer ou créer des biomatériaux en les rendant bioactifs et vivants à une échelle nanométrique. Durant ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés au développement de biomatériaux (naturels ou synthétiques), tridimensionnels (3D), implantables et utilisables pour le traitement de diverses pathologies de l'appareil loco-moteur, qui sont capables d'induire une meilleure différenciation cellulaire et une régénération tissulaire plus stable. Nous avons développé 3 types d'implants nanostructurés, à base de titane recouvert d'hydroxyapatite et de nanotubes de carbone, de capsules ou de membranes nanofibreuses nanofonctionnalisées par des facteurs de croissance, qui ont permis d'obtenir une régénération osseuse ou ostéo-articulaire, in vitro comme in vivo / During the last ten years, tissue engineering has merged with regenerative nanomedecine by combination, not only of stem cell technology but also of growth factors. The goal of this thesis was to use bone and cartilage engineering as a model, in order to improve and to develop active and living nanostructured implants. During this PhD studies, we were interested in the development of biomaterials (natural or synthetic), tridimentionnal (3D), transplantable for bone and cartilage diseases treatments, that are able to induce more cellular differentiation and improved tissue regeneration. In this thesis, we have developed 3 types of nanostructured implants, (i) titanium implants coated with hydroxyapatite and carbone nanotubes; (ii) active capsules functionalized by growth factors and stems cells for bone induction (in vitro/in vivo); (iii) electrospun nanofibrous membranes functionalized by growth factors and (Osteoblasts/Chondrocytes) for bone and cartilage regeneration, in vitro and in vivo
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Cell-based partial pulp regeneration in a porcine preclinical model / Régénération partielle de la pulpe à partir de cellules mésenchymateuses dans un model préclinique porcin

Mangione, Francesca 10 October 2017 (has links)
La pulpe dentaire est un tissu connectif innervé et vascularisé, contenu dans une structure minéralisée inextensible formée par l’émail, la dentine et le cément. Ce tissu assure l’homéostasie et la sensibilité de la dent. Il est sujet à des lésions sévères faisant suite à une carie ou à un traumatisme. La thérapeutique conventionnelle préconisée alors est le traitement endodontique, qui consiste en l’exérèse de la totalité du tissu pulpaire et le comblement de l’espace évidé par un matériau synthétique bioinerte. Malgré les résultats cliniques satisfaisants, cette thérapeutique induit une fragilisation de la dent et une plus grande susceptibilité aux infections, qui peuvent conduire à terme à la perte de la dent. En se basant sur la présence de cellules souches mésenchymateuses dans la pulpe dentaire, des stratégies de régénération alternatives au traitement endodontique traditionnel sont à l’étude, afin de permettre le maintien des fonctions de nutrition et de sensibilité de la pulpe, garantes de la pérennité de la dent sur l’arcade. Elles s’inscrivent dans deux approches: la régénération de novo, en cas de nécrose du tissu pulpaire et la régénération partielle, lorsque seul le tissu pulpaire endommagé est éliminé et régénéré. Nos travaux portent sur la faisabilité de cette dernière approche dans un modèle préclinique. En effet, dans la perspective d’un transfert vers la clinique humaine, des modèles chez le gros animal doivent être développés afin de tester la faisabilité et le succès de cette thérapie, dans des conditions proches de la clinique. Du fait de ses similitudes avec l’homme en termes d’anatomie et de physiologie, le miniporc représente un modèle de choix pour les études précliniques d’ingénierie pulpaire. L’objectif principal de cette étude est de tester la faisabilité de la régénération pulpaire partielle, en implantant des cellules pulpaires porcines (pDPCs) contenues des hydrogels injectables dans des défauts pulpaires artificiellement créés chez le miniporc. Au cours ce travail, différentes techniques d’imagerie d’évaluation du processus de régénération ont été développées. En particulier, un protocole d’angiographie tridimensionnelle in- pour la visualisation du réseau vasculaire pulpaire a été mise au point. Par ailleurs, en utilisant des paramètres morphométriques spécifiques, initialement développés pour caractériser l’os, une analyse tridimentionnelle par micro-CT des tissus minéralisés de réparation a été élaborée. En appliquant un “split mouth model”, les hydrogels injectables ensemencés ou non par des pDPCs ont été implantés dans des molaires et des prémolaires, après amputation de la pulpe camérale. À 21 jours après la chirurgie, les analyses d’imagerie, d’histologie et d’immunologie ont mis en évidence, qu’indépendamment de la présence des pDPCs, l’implantation des hydrogels a induit la formation d’un pont d’ostéodentine. La caractérisation morphométrique tridimensionnelle a montré que la microarchitecture de ce pont différait largement de la dentine native. De plus, en présence des pDPCs, le processus de réparation était modifié, avec une moins bonne étanchéité du pont. Au cours de ce travail, une technique de suivi non invasive de la régénération a tenté d’être mise au point. Une angiographie tridimensionnelle par soustraction a été réalisée avant et après la procédure de régénération pulpaire partielle. Si les angiographies ont révélé l’entière vascularisation des mâchoires et des dents à croissance continue, l’apport vasculaire des dents matures traitées, du fait de son faible flux, n’a pas pu être mis en évidence. L’absence de régénération partielle de la pulpe dans les conditions testées souligne l’importance des modèles précliniques pour identifier les facteurs promouvant un environnement favorable à la régénération, dans la perspective d’un transfert vers la clinique humaine. / The dental pulp is a connective tissue, which is highly innervated and vascularized, encapsulated in a mineralized inextensible structure formed by enamel, dentin and cementum, ensuring the homeostasis and sensibility of the tooth. The pulp is often damaged by caries and trauma, resulting in infection or necrosis. In such situations, the routine clinical treatment is a root canal therapy, which consists in the elimination of the affected tissue and filling of the endodontic canal system with bioinert synthetic materials. In spite of satisfactory clinical outcomes, none of the original functions is restored and the lack of sensitivity as well as natural defence may lead to tooth fracture and reinfection. Cell-based pulp regeneration could provide a valid alternative to traditional endodontic treatment of damaged teeth. This strategy focuses, in fact, on the preservation of the healthy pulp tissue and the regeneration of the damaged one, by combining stem cells, scaffolds and growth factors. In case of trauma or carious lesion, as the pulp inflammatory reaction is compartmentalized in first instance, such conservative approach could be indicated. Regarding non-rodent animal model, to our knowledge, only Iohara et al. (2009) reported the achievement of partial pulp regeneration in canine tooth by implantation of subfractions of autologous pulp cells; however, in the perspective of a transfer to the human clinic, larger animal models should be developed to test the feasibility and the success of the therapy mimicking the clinical conditions of pulpotomy. Due to dental anatomical and physiological similarities with human, the minipig constitutes a model of choice for preclinical pulp engineering studies. The aim of this study was to develop a preclinical model of partial dental pulp regeneration in minipig, by implanting a pulp construct, made by self-assembling nano-peptide injectable hydrogel and porcine minipig dental pulp cells (pDPCs), in artificially created pulp defects. Secondarily, in the context of this preclinical model, two different techniques of analysis of the regeneration process have been developed. In particular, an in vivo 3D subtraction angiography has been set for the visualization of dental pulp vascular network. Indeed, further developments of this modality open promising perspectives of its application for the morphometric characterization of angiogenesis process in newly formed dental tissues and bone defects. Moreover, using specific morphometric parameters, initially developed to characterize bone, a micro-CT morphometric analysis of the mineralized reparative tissues, obtained by the partial pulp regeneration protocol, has been elaborated. By split mouth model, pulp constructs made with self-assembling injectable nano-peptide hydrogel with and without porcine dental pulp cells (pDPCs) were implanted, after pulp chamber amputation in premolars and molars. At day 21 after surgery, three-dimensional morphometric characterization, Masson’s trichrome and immunolabeled for DSP and BSP were performed on treated teeth. 3D subtraction angiographies have been performed before and after partial pulp regeneration procedure. Regardless of the presence of pDPCs, the implantation of pulp construct induces the formation of an osteodentin bridge, whose microarchitecture sensibly differs from the native dentin. Furthermore, the presence of pDPCs in the construct slightly impairs this reparative process. The latter was led the remaining pulp cells, instead of the pDPCs in the scaffold. Angiographies could show entire vascularization of jaws and continuously growing teeth but blood supply of treated mature permanent teeth could not be displayed. The failure of partial pulp regeneration cell based strategy, in these near-real clinical conditions, highlights the importance of preclinical models, to identify the factors promoting a favourable regenerative environment, in the perspective of a transfer to the human clinics.
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Compatibilité et co-structuration dans des systèmes contenant des scléroprotéines et des polysaccharides / Compatibility and co-structuration of systems containing scleroproteins and polysaccharides

Ignat, Cristina Mihaela 26 September 2012 (has links)
L’obtention de substrats „cyto-favorables”, aptes à soutenir la régénération tissulaire, impose l’utilisation de biomatériaux qui portent des domaines de reconnaissance cellulaire, comme par exemple les scléroprotéines et certains polysaccharides. La membrane des cellules spécifiques aux tissus conjonctifs dispose de mécanismes qui facilitent l’ancrage aux substrats solides ou à l’état de gel où se retrouvent des macromolécules ou des fibrilles de (atelo) collagène, associées ou non à l’acide hyaluronique. On peut générer de tels substrats par des techniques de rassemblement moléculaire spontané ordonné (tout comme dans le cas de la restructuration du collagène quasi-natif pour former des fibrilles), ou induite physico-chimiquement ensuite stabilisé morphologiquement (tout comme dans le cas de la préparation des hydrogels mixtes, atelocollagène–hyaluronate de sodium, diversement réticulés ensuite transformés en cryo- ou vitri-gels). Dans le cadre de la thèse, nous étudions les moyens d’obtention et de purification des précurseurs bio-macromoléculaires nécessaires, par la suite, à l’obtention de substrats „cyto-favorables”, ainsi que leurs modalités de génération et de caractérisation. Les méthodes de restructuration auxquelles on en appelle sont de nature physico-chimique (la co-précipitation contrôlée dans des mélanges binaires et ternaires d’atelocollagène et d’hyaluronate de sodium), ou chimique (la réticulation par des ponts moléculaires à longueur minimale). On a étudié les possibilités de mélanger de l’atelocollagène (aK) avec deux types de polysaccharides, le hyaluronate de sodium (NaHyal) et le gellane. On a établi des formulations et les procédures optimales pour obtenir des hydrogels avec des caractéristiques rhéologiques contrôlables, et avec la réactivité et la morphologie capables de permettre la fixation et la prolifération des fibroblastes. On constate que les hydrogels et cryogels obtenus à partir des mélanges 5:1 aK:NaHyal réticulés avec du 1,4-butanediol diglycidyl éther ont des propriétés rhéologiques qui permettent leurs manipulation dans les conditions des techniques de culture cellulaire. Ils ne présentent pas de cytotoxicité et ils assurent la viabilité cellulaire dans les milieux de culture standards. La morphologie des cryogels obtenus montre une macro-porosité qui dépend de la formulation des mélanges et peu la technique d'obtention. La présence de gellane dans les mélanges conduit à une séparation de phases, même à faible concentration, soulignant la diversité des caractéristiques de substrats. / Obtaining "cyto-favourable" substrates able to support tissue regeneration leads to use biomaterials holding cellular recognition domains, as scleroproteins and some polysaccharides as examples. Cellules membranes specific to conjunctive tissues have mechanisms making easier the anchoring to solid or gel substrates where macromolecules or fibrils of (aceto)collagen, associated or not to hyaluronic acid, are found. Such substrates may be generated using spontaneous molecular gathering (as in native collagen restructuration to fibrils), or physico-chemically induced (as the preparation of mixed hydrogels then transformed in cryo- or vitri-gels). In this thesis, were studied the obtaining and purification of bio-macromolecular presursors necessary to obtaining "cyto-favourable" substrates, and the procedures to generate and characterize them. Used restructuration methods are of physico-chemical nature (controlled co-precipitation in binary and ternary mixtures of acetocollagen and sodium hyaluronate) or chemical one (crosslinking).The mixture of acetocolagen (aK) with two polysaccharides, sodium hyaluronate (NaHyal) and gellan were investigated. Formulations and optimal conditions were established to obtain hydrogels with controlled rheological characteristics, and reactivity and morphology able to allow fibroplast fixation and proliferation. Hydrogels and cryogels prepared from 5:1 aK:NaHyal crosslinked with 1,4-butanediol diglycidyl ether were defined as the best materials we have prepared. They do not show any cytotoxicity and they ensure the cellular viability within standard cellule culture media. The cryogel morphology shows macro-porosity depending on the formulation but a few on the obtaining process. The presence of gellan in the mixtures leads to a phase separation, even at low concentration.
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Ingénierie tissulaire de valves cardiaques : apport des techniques de thérapie cellulaire

Juthier, Francis 29 September 2009 (has links) (PDF)
Les prothèses valvulaires cardiaques actuellement commercialisées présentent des inconvénients importants. Les prothèses biologiques (xéno ou allo greffes) sont soumises à une dégénérescence progressive, et les prothèses mécaniques nécessitent un traitement anticoagulant à vie. Des perspectives nouvelles sont apparues avec l'ingénierie tissulaire, dont le but est de créer à partir d'un support non cellularisé (matrice biodégradable de polymère de glycogène, ou xénogreffe décellularisée) un substitut valvulaire « vivant » offrant une meilleur longévité et des performances hémodynamiques optimales, ainsi que des capacités de remodelage et de croissance. Nous avons élaboré un modèle de xénogreffe porcine décellularise implanté en position systémique puis pulmonaire chez un agneau et testé plusieurs modes de recolonisation de cette matrice, par différents types de cellules. La spécificité de notre projet était de tester in vivo la possibilité de recolonisation de matrices valvulaires par des cellules autologues de moelle osseuse, les valves obtenues étant soumises à des forces mécaniques supposées être responsables de la recolonisation cellulaire et de la régénération de la matrice extra-cellulaire. La première étape a été l'optimisation d'un processus de décellularisation. Nous avons retenu un protocole combinant les effets de solutions hypotoniques et d'un détergent anionique, le sodium dodecyl sulfate. L'étape suivante a été de tester les propriétés mécaniques d'une valve xénogénique décellularisée dans un modèle ovin (qui est le modèle de référence en pathologie valvulaire cardiaque), en flux artériel systémique. Une matrice valvulaire porcine a été implantée dans une aorte thoracique descendante chez 6 agneaux. Ses propriétés mécaniques en contrainte systémique étaient bonnes, sans rupture ni dilatation anévrismale, 2 à 16 semaines après l'implantation. Nous avons ensuite testé la possibilité de colonisation de cette valve xénogénique décellularisée porcine par des cellules souches endogènes stimulées par l'injection de granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF). Ce montage a été implanté chez 6 agneaux puis une évaluation hémodynamique, macroscopique et histologique a été réalisée à 3, 6, 8 et 16 semaines. Alors que le G-CSF recombinant humain induisait une croissance significative du nombre de globules blancs périphériques chez l'agneau, l'effet sur la valve était délétère, et induisait des réactions inflammatoires et de fibrose ressemblant à un rejet de greffe après 16 semaines. Nous avons ensuite testé les propriétés mécaniques de cette valve après son implantation dans l'artère pulmonaire sous circulation extra-corporelle, ainsi que l'effet de l'injection in situ de cellules autologues mononucléées médullaires (CMM) juste avant l'implantation chirurgicale. Ces valves pulmonaires porcines décellularisées ont été implantées chez 15 agneaux. Chez 9 animaux, des CMM autologues ont été injectées dans la valve immédiatement avant son implantation (groupe CMM), et chez 6 animaux, aucune injection cellulaire n'était réalisée (groupe contrôle). Un suivi de 16 semaines était réalisé comprenant l'étude fonctionnelle de la valve (échographique et angiographique) ainsi qu'une étude histologique. Les évaluations échographiques ne montraient aucune régurgitation dans chacun des 2 groupes et les index de perméabilité valvulaire étaient similaires. Les études histologiques montraient une prolifération myointimale plus importante et des dépôts calciques étaient mis en évidence dans le groupe contrôle par rapport au groupe CMM. Toutes les valves étaient recouvertes d'une monocouche de cellules endothéliales. Cependant chez 2 animaux une infiltration inflammatoire importante était retrouvée dans l'adventice. Ces résultats suggéraient que l'injection in situ de cellules autologues médullaires pouvait réduire la détérioration de valves xénogéniques décellularisées, mais également dans des circonstances inconnues favoriser des réactions inflammatoires locales Nous avons alors supposé que l'injection in situ d'une sous-population de CMM, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) pouvaient promouvoir in vivo la recolonisation de nos substituts valvulaire sans entraîner de risque d'augmentation des réactions inflammatoires locales. Nous avons prélevé des CCM autologues 7 jours avant l'implantation chirurgicale. De cet échantillon, des cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été isolées par une culture cellulaire spécifique. Les valves porcines décellularisées ont été implantées dans l'artère pulmonaire sous circulation extra-corporelle chez l'agneau, ayant été au préalable injectées soit de CMM (n=7), soit de CSM (n=7). L'évaluation fonctionnelle des valves a été réalisée après 16 semaines par échographie, les valves ont été explantées en vue de leur analyse macroscopique et histologique. Après 4 mois, les gradients moyens transvalvulaires et distaux étaient significativement plus bas dans le groupe avec CSM que dans le groupe CMM. L'index de perméabilité était également significativement plus élevé dans le groupe CSM que dans le groupe CMM.. L'examen histologique montrait également que la disposition de la matrice et la colonisation cellulaire était plus proche de celle de valve native dans le groupe CSM que dans le groupe CMM.

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