L'objectif général de ce travail de doctorat a été centré sur l'utilisation des cellules pluripotentes induites humaines dans la modélisation et l'évaluation thérapeutique des pathologies cardiaques. Depuis leur découverte en 2006, les iPSC offrent une opportunité pour le développement de modèles cellulaires humains et spécifiques de patients pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, l'évaluation de réponses pharmacologiques et le génération de cellules redifférenciées (ici en cardiomyocytes) pour des applications thérapeutiques cellulaires. Dans ce travail nous avons démontré que la quantité mais aussi la qualité finale des cardiomyocytes dérivés d'iPSC dépend des conditions spatiales et pharmacologiques utilisées durant les différentes étapes de différenciation. L'utilisation d'un protocole de différentiation en monocouche avec blocage simultané et transitoire de l'ensemble des voies Wnt (canoniques et non canoniques) permet d'obtenir une maturation plus importante du sarcomère, étape essentielle pour la modélisation des sarcomèropathies La différenciation des iPSC en cardiomyocytes peut aussi être obtenue par une approche moléculaire ciblée visant à activer spécifiquement un programme cardiogénique. Celle-ci est obtenue via l'utilisation d'une protéine Cas9 mutée et couplée à un système transactivateur et permettant le ciblage simultané de 3 facteurs de transcription clés de la cardiogénèse (Gata4, Mef2c et Tbx5). Cette approche moléculaire est renforcée par la combinaison avec une stimulation pharmacologique ciblant la voie Wnt. / The general objective of this work was centered on the use of human induced pluripotent cells in modeling and therapeutic evaluation of cardiac pathologies. Since their discovery in 2006, the iPSC provide an opportunity for the development of human cellular models and specific patients for the study of pathophysiological mechanisms, evaluation of pharmacological responses and the generation redifférenciées cells (cardiomyocytes here) for applications cellular therapeutic. In this work we demonstrated that the quantity but also the final quality of cardiomyocytes derived from iPSC depends on the spatial and pharmacological conditions used during the various stages of differentiation. The use of a monolayer differentiation protocol with simultaneous and transient blocking of all Wnt pathways (canonical and noncanonical) allows to obtain a higher maturation of the sarcomere, an essential step for modeling sarcomeropathies IPSC differentiation into cardiomyocytes can also be obtained by targeted molecular approach to specifically activate cardiogenic program. This is achieved through the use of a mutated Cas9 protein and coupled with transactivator system. This allows simultaneous targeting of 3 key cardiogenesis transcription factors (Gata4, MEF2C and Tbx5). This molecular approach is enhanced by the combination with a pharmacological stimulation targeting the Wnt pathway. Beyond modeling of monogenic cardiac disease, cardiomyocytes derived from iPSC can reproduce more complex and multigenic diseases

La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurologique caractérisée par une perte d’oligodendrocytes qui sont les cellules myélinisantes du système nerveux central (SNC). Malgré le développement de thérapies visant à arrêter l’attaque des oligodendrocytes par le système immunitaire, il n’existe pas encore de moyens permettant d’activer efficacement la remyélinisation. Dans la SEP, une remyélinisation spontanée peut se faire à partir de cellules précurseurs d’oligodendrocyte (POs) qui sont présentes dans l’ensemble du cerveau, mais ce processus devient inefficace avec l’âge. Le fait que, d’une part, on puisse observer des POs au sein des lésions mais que, d’autre part, on ne retrouve pas d’oligodendrocytes matures en nombre suffisant, suggère que l’entrée en différenciation des POs soit une étape critique pour une remyélinisation complète. Ce travail avait pour but de caractériser un nouveau régulateur de la différenciation des oligodendrocytes, Tensin 3 (Tns3). Ici, nous démontrons que Tns3, protéine de liaison à l’actine, est un régulateur de la différenciation des oligodendrocytes et que son expression est contrôlée par Ascl1 et Olig2, qui sont deux facteurs de transcription clés de l’oligodendrogenese. Dans un premier temps, nous avons montré que l’expression de Tns3 est fortement induite au moment de l’entrée en différenciation des oligodendrocytes, puis réprimée dans les oligodendrocytes matures. Tns3 est, par conséquence, un nouveau marqueur spécifique des oligodendrocytes en cours de différenciation. L’utilisation de modèles animaux de démyélinisation nous a permis de mettre en évidence que les nouveaux oligodendrocytes en différenciation dans la zone de remyélinisation expriment Tns3. Il pourrait donc être utilisé comme marqueur de remyélinisation dans les lésions actives. Ensuite, nous avons trouvé que la protéine Tns3 est surtout localisée dans le noyau des cellules neurales, contrairement à sa localisation cytoplasmique observée en dehors du SNC. Cela suggère une fonction spécifique aux cellules neurales et différente de son rôle dans l’adhésion cellulaire montré jusqu’à lors. D’autre part, le développement des techniques d’édition du génome CRISPR/Cas9 nous ont permis de démontrer, au stade néonatale, que la perte de Tns3 dans les cellules souches neurales diminue fortement la différenciation des oligodendrocytes in vivo. Finalement, Tns3 est un nouveau facteur impliqué dans le contrôle de la différenciation des oligodendrocytes et est un marqueur des oligodendrocytes en différenciation pendant le développement et dans les lésions remyélinisantes du cerveau adulte. Nous espérons que cette caractérisation du mécanisme d’action de Tns3 aidera à développer des stratégies thérapeutiques activant la différenciation des oligodendrocytes et la remyélinisation, permettant une amélioration de la santé des patients atteints de Sclérose en Plaques. / Multiple sclerosis (MS) is a neurological disease characterized by the loss oligodendrocytes, the myelinating cells of the Central Nervous System (CNS). Despite recent advances leading to stop the immune system from attacking oligodendrocytes, efficient remyelinating therapies are still lacking. In MS, there is a spontaneous remyelination attempt from oligodendrocyte precursor cells (OPCs) present all over the brain, but this phenomenon is inefficient and diminishes with age. The observation that OPCs are present within demyelinating MS lesions, but fail to differentiate into myelinating cells, suggests that induction of OPC differentiation is a critical event for successful remyelination. This work has aimed to characterize a novel regulator of oligodendrocyte differentiation, Tensin 3 (Tns3). Here we demonstrate that Tns3 actin binding protein is a regulator of oligodendrocyte differentiation, acting downstream of Ascl1 and Olig2, two key oligodendrogenic transcription factors. We show that Tns3 expression is strongly induced at the onset of oligodendrocyte differentiation, while downregulated in mature oligodendrocytes. Tns3 is therefore a novel specific marker of differentiating oligodendrocytes. Using demyelinating mouse models, we provide evidence that Tns3 expression characterizes newly differentiating oligodendrocytes within remyelinating areas and may thus be used as a hallmark for remyelination in MS lesions. We also found that Tns3 protein is mainly localized in the nucleus of neural cells, contrary to its cytoplasmic expression outside the CNS, suggesting a neural specific function beyond its role in cell adhesion junctions. Finally, developing CRISPR/Cas9 genome editing techniques in our lab, we demonstrate that Tns3 loss-of-function in neonatal neural stem cells (NSCs) strongly impairs oligodendrocyte differentiation in vivo. Therefore, Tns3 is a novel factor involved in the control of oligodendrocyte differentiation and a hallmark for differentiating oligodendrocytes during development and in remyelinating lesions of the adult brain. We expect that our in deep characterization of Tns3 mechanism of action will help to develop therapeutic strategies fostering oligodendrocyte differentiation, and therefore remyelination and functional repair in MS patients.

La technologie d’édition CRISPR peut être définie comme un outil biologique qui par son efficacité, son extrême précision et la facilité de sa modélisation, permet aujourd’hui de modifier le génome des organismes vivants en général et celui de l’homme en particulier. Sa découverte en 2012 par les chercheuses française et américaine, E. Charpentier et J. Doudna, récompensées par le Prix Nobel de chimie 2020, permet des applications thérapeutiques, au niveau germinal, pour des maladies à transmission autosomique dominante. Jusqu’ici, aucune technologie antérieure d’édition génomique, ni aucun diagnostic anténatal (DPI, DPN), n’avait été capable de prévenir ces maladies. En novembre 2018, le chercheur chinois Hé Jiankui annonce avoir utilisé la technologie CRISPR pour éditer des embryons humains viables. Selon Jiankui cette tentative consiste à modifier génétiquement des embryons humains en FIV afin de prévenir « définitivement » l’infection au VIH des futurs bébés. Cette modification génétique est ainsi transmissible à leur descendance. A partir de là, il s’est ouvert un tournant décisif de l’édition du génome humain héritable. Celui-ci s’apparente, dans notre contexte marqué par la convergence des NBIC, à une perspective transhumaniste. Car à la vérité, CRISPR n’aurait pas fait que prévenir l’infection au VIH chez ces bébés, il aurait surtout amélioré un caractère génétique conférant à ces derniers une immunité à vie contre le VIH-SIDA, avec pour principal corollaire, que de telles modifications sont héritables. Cette application non thérapeutique controversée, nous a conduit à nous demander successivement s’il est souhaitable de se servir de la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9, pour corriger au niveau germinal ou embryonnaire, une anomalie génétique afin de préserver le futur enfant de certains handicaps qui pourraient mettre en péril sa santé ou alourdir sa vie ?Jusqu’où de telles modifications pourraient être jugées comme bénéfiques ou à risque pour l’enfant et qui en aurait l’ultime légitimité d’en juger ?Peut-on alors affirmer, qu’en regard de l’extrême étroitesse qui existe entre la finalité thérapeutique d’une modification génomique germinale ou embryonnaire et l’amélioration/l’augmentation génétique, le risque d’altération de la nature humaine et de fait, la sortie hors de l’espèce humaine devient inéluctable ? / Doctorat en Philosophie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Candida glabrata est une levure pathogène opportuniste, apparaissant aujourd’hui comme la deuxième cause de candidémie en Europe et en Amérique du Nord. Cette levure présente de nombreuses particularités génomiques telles que la présence de nouveaux domaines structuraux au sein d’ARN non-codants ubiquitaires. Le premier aspect de cette thèse a consisté en l’étude de la sous-unité ARN atypique de la Ribonucléase P nucléaire de C. glabrata. Cet ARN contient trois grand domaines additionnels octroyant au transcrit une taille trois fois plus élevée que la moyenne des sous-unités ARN des RNase P eucaryotiques. Les expériences réalisées ont permis une meilleure compréhension du rôle de ces domaines additionnels et ont démontré la présence inédite de la protéine Rcl1 au sein du complexe de la RNase P. Dans un second temps ce travail de thèse a aussi contribué à l’amélioration des outils d’édition du génome de C. glabrata existants. De nouvelles cassettes intégratives de faible taille et positivement sélectionnables ont été mises au point. Ces éléments présentent toutes les caractéristiques permettant leur utilisation dans la modification du génome de souches sauvages et d’isolats cliniques de C. glabrata. / Candida glabrata is an opportunistic pathogenic yeast, and is today the second causative agent of candidemia in Europe and North America. This yeast has many genomic peculiarities such as the presence of new structural domains within ubiquitous non-coding RNAs. The first aspect of this thesis was the study of the atypical RNA subunit of the nuclear Ribonuclease P of C. glabrata. This RNA contains three large additional domains giving the transcript an overall size more than three times larger than the average eukaryotic RNase P RNA subunits. The experiments performed led to a better understanding of the role of these additional domains and demonstrated for the first time the presence of the Rcl1 protein within the RNase P complex. Secondly, this thesis work also contributed to the improvement of existing genome editing tools in C. glabrata. New small and positively selectable integrative cassettes have been developed. These elements exhibited all the required characteristics for their use in wild-type strains and clinical isolates of C. glabrata.

L’hypothyroïdie congénitale est un des troubles endocriniens les plus fréquents chez l’enfant, touchant un nouveau-né sur 2500.[1] Toutefois, même si quatre facteurs de transcription principaux, NKX2.1, PAX8, FOXE1 et HHEX, sont connus pour être impliqués et nécessaires au développement de la glande thyroïde, seuls 2% des patients atteints de dysgénésies thyroïdiennes sont reliés à une mutation au niveau d’un de ces quatre facteurs de transcription. Ceci suggère que d’autres facteurs, encore inconnus, pourraient jouer un rôle important durant l’organogenèse de la glande thyroïde.[1]Les mécanismes moléculaires contrôlant les différentes étapes du développement thyroïdien étant encore très peu connus, l’objectif de ce projet vise à décrypter le réseau génique contrôlant le développement thyroïdien. Pour se faire, la mise au point d’un protocole d’invalidation de gènes candidats impliqués dans le développement thyroïdien au sein de cellules souches embryonnaires murines à l’aide de la technologie des Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) a été mis au point. Ce nouveau protocole d’édition ciblée du génome de cellules souches embryonnaires permet la modélisation des différentes mutations identifiées au sein de patients atteints d’hypothyroïdisme congénital mais aussi la compréhension des différents mécanismes impliqués dans le développement de la glande thyroïde lorsque ce protocole est couplé avec notre modèle in vitro de différenciation de cellules souches embryonnaires murines en cellules folliculaires thyroïdiennes. Grâce à l’utilisation combinée de ces deux protocoles, nous avons pu mettre en évidence la nécessité du gène Foxe1 pour la différenciation in vitro correcte des progéniteurs NKX2.1+ en cellules folliculaires thyroïdiennes. Toutefois, il a été démontré qu’une faible proportion de cellules sont toujours capables de générer des follicules thyroïdiens en l’absence du gène Foxe1. Enfin, la génération inattendue de structures pulmonaires tridimensionnelles parmi les cellules Foxe1 KO différenciées avec du 8-br-cAMP a été observée. Cette génération de structures pulmonaires ne semble pas être une conséquence directe de la diminution d’expression du gène Pax8 observée au sein de ces lignées Foxe1 KO mais pourrait refléter un potentiel rôle épigénétique du gène Foxe1 permettant ou non le recrutement de certaines protéines au sein de la chromatine. Le gène Foxe1 semble à la fois jouer un rôle de facteur « pioneer » et de « Gatekeeper » en orientant le destin cellulaire des progéniteurs NKX2.1+ vers une différenciation thyroïdienne à défaut d’une différenciation pulmonaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La diversité morphologique des muscles squelettiques permet la précision et la coordination des mouvements propres à chaque espèce animale. L'établissement du patron musculaire a lieu au cours du développement embryonnaire durant le processus de myogenèse. Il a été décomposé en quatre étapes chez la drosophile : la spécification de groupes de myoblastes équivalents (groupes promusculaires) à des positions précises du mésoderme, la sélection d'une ou plusieurs cellules progéniteurs à partir de chaque groupe, la division asymétrique des progéniteurs en cellules fondatrices des muscles, et enfin, la fusion d'une cellule fondatrice avec un nombre défini de myoblastes compétents pour la fusion qui forme une myofibre syncytiale. Ce processus aboutit à la mise en place d'un patron stéréotypé de muscles morphologiquement distincts par leur taille, orientation, forme, et sites d'attachement au squelette ; ces caractères définissant l'identité du muscle. Chez la drosophile, chacun des 30 muscles par hémisegment de la larve est constitué d'une seule myofibre. Il a été proposé que l'identité morphologique de cette fibre soit contrôlée par une combinatoire de facteurs de transcription identitaires (FTi) exprimés par la cellule fondatrice. Mon projet de thèse a porté sur le contrôle transcriptionnel de l'identité musculaire, avec comme modèle d'étude, un muscle dorso-latéral de la larve de drosophile, le muscle DA3 dont un FTi est Collier/EBF (Col). La transcription de col est activée dans un groupe promusculaire, puis transitoirement dans les quatre progéniteurs issus de ce groupe, avant d'être maintenue spécifiquement dans la myofibre DA3. Dans des embryons mutants pour col, le DA3 est transformé en muscle plus dorsal, DA2. Les travaux précédents de l'équipe ont montré que la transcription de col dans le lignage DA3 est contrôlée par deux modules cis-régulateurs, EarlyCRM et LateCRM, séparés physiquement sur le chromosome et agissant séquentiellement. Leur chevauchement temporel d'activité restreint au progéniteur DA3 et l'autorégulation directe du LateCRM ont mené à l'hypothèse d'un mécanisme de " passage de témoin " entre ces deux CRM, spécifique au progéniteur DA3. L'objectif de ma thèse était de tester cette hypothèse et de comprendre comment une information temporelle et spatiale intégrée par un CRM est transmise à un autre CRM, pour définir une identité cellulaire, une question fondamentale au-delà du cas d'espèce que constitue le muscle DA3.[...] / The morphological diversity of skeletal muscles allows the precision and coordination of movements specific to each animal species. Establishment of a stereotypic pattern of muscles takes places during the process of myogenesis. Studies in Drosophila, an insect model, have identified four steps in this process: the specification of equivalence groups of myoblasts (promuscular clusters) at defined positions within the somatic mesoderm, the selection of progenitor(s) from each group, asymmetric division of each progenitor into post-mitotic muscle founder cells, and finally the fusion of each founder cell with a given number of fusion competent cells to form a syncytial myofiber. This dynamic, integrated process leads to establishing a stereotyped pattern of morphologically distinct muscles which can each be distinguished, based on size, orientation, shape, sites of attachment to the skeleton, all properties defining muscle identity. In the Drosophila larva, each of the about 30 different muscles per hemisegment is made of a single myofiber. It has been proposed that final morphology of a myofiber reflects the combinatorial code of identity Transcription Factors (iTF) expressed by its founder cell, although many questions remain unanswered. My thesis project aimed at better understanding the mechanism of specification of muscle identity, using as model a dorso-lateral muscle of the Drosophila larva, the DA3 muscle whose identity is controlled by the Collier/EBF (Col) iTF. col transcription is activated in one promuscular cluster, transient in the 4 progenitors issued from this cluster and stably maintained in the DA3 myofiber. In col mutant embryos, the DA3 muscle is transformed into a more dorsal, DA2-like muscle. Previous work has shown that col transcription in the DA3 lineage is controlled by two cis-regulatory modules (EarlyCRM and LateCRM), physically distant on the chromosome and acting sequentially. The temporal overlap of EarlyCRM and LateCRM in the DA3 progenitor and direct col autoregulation via the LateCRM led to hypothesize a handover between the two CRM in the DA3 progenitor. One goal of my thesis project was to challenge this hypothesis and understand how positional and temporal information integrated by EarlyCRM could be memorized via LateCRM, in order to specify cell identity, a fundamental question of developmental biology beyond the specific case of the Drosophila DA3 muscle. [...]

La modélisation de maladies métaboliques hépatiques et les approches de thérapie cellulaire nécessitent de disposer d’une source fiable et illimitée d’hépatocytes. Grâce à leurs propriétés spécifiques, les cellules souches pluripotentes peuvent représenter une telle source. Nous avons tout d’abord mis au point une approche originale pour différencier une lignée de cellules souches embryonnaires humaines européenne, générée en conditions GMP-compatibles, en hépatocytes fonctionnels in vitro et in vivo après transplantation dans un modèle murin d'insuffisance hépatique aiguë. Nous avons ensuite utilisé les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques d’un patient homozygote pour une mutation entrainant une absence de récepteur des lipoprotéines de basse densité (RLDL) afin de modéliser l'hypercholestérolémie familiale (HF) in vitro. Nous avons amélioré notre approche pour différencier ces iPSC en hépatocytes plus matures et polarisés car les hépatocytes sont les seules cellules capables de dégrader le cholestérol via la bile. Nous avons montré que ce modèle reproduit la physiopathologie de l'HF et établit la preuve de concept de la correction génétique ciblée par la technologie CRISPR/Cas au locus AAVS1 par la restauration de l’expression, inductible par les statines, et de la fonctionnalité du récepteur. Nous avons également mis en évidence que le RLDL ne semble pas impliqué dans l'entrée du virus de l'hépatite C (VHC) mais plutôt dans les étapes tardives de la morphogénèse virale. Ce modèle pourra désormais servir à l’étude physiopathologique de différents patients HF, au criblage de nouvelles drogues hypocholestérolémiantes et antivirales ainsi qu'à de nouvelles approches thérapeutiques. / Liver metabolic diseases modeling and cell therapy approaches require a a reliable and well-characterized cell source. Due to their specific properties, pluripotent stem cells represent a credible alternative to primary human hepatocytes. Thus, we have defined a new approach to differentiate a European human embryonic stem cell line, generated in GMP-compatible conditions, into hepatocytes that are functional in vitro and in vivo after transplantation into a murine model of acute liver failure. We have then used induced pluripotent stem cells from a homozygous patient with a mutation leading to an absence of the low-density lipoproteins receptor (LDLR) to model familial hypercholesterolemia type IIA (FH) in vitro. As hepatocytes are the only cells able to metabolize cholesterol into bile acids, we have improved our approach to differentiate these iPSC into hepatocytes displaying cell functional organization and polarization. We have shown that our model reproduced FH physiopathology and have also restored, by the genetic targeted correction at the AAVS1 locus using CRISPR/Cas technology and subsequent hepatocyte differentiation, the LDLR expression – inducible by statins - and functionality. Moreover, we have demonstrated that the LDLR does not seem to be involved in hepatitis C virus entry or replication but rather in viral morphogenesis steps. This model will be useful to develop new cholesterol-lowering and antiviral drugs as well as new cell therapy options. Furthermore, it can be applied to similar studies for other liver metabolic disorders.

La découverte de nouveaux procédés biotechnologiques remet en question la capacité de la loi de fournir une protection suffisante de l'être humain dès le commencement de sa vie. Ces nouvelles méthodes, comme la méthode CRISPR/Cas9, également connue sous le nom de « genome editing », le don de mitochondries et, finalement, la création de cellules souches pluripotentes induites humaines (cellules hiPS) permettent de manipuler et d'influencer de manière fondamentale la constitution génétique de la progéniture et des générations futures. En vue de ces développements, cette thèse vise à élaborer un projet de loi adressé au législateur allemand en prenant compte de deux aspects : d'un côté, sur la base d'une analyse comparative du droit allemand et français, il s'agit d'optimiser la législation allemande actuelle en identifiant des avantages éventuels de l'approche réglementaire en France. De l'autre côté, en admettant que les techniques en question pourront être appliquées un jour avec des risques gérables, il est examiné sur la base d'une étude de droit constitutionnel allemand si une telle application future pourrait en principe être justifiée, le résultat de cette étude étant également concrétisé sous forme d'une proposition de loi. / The discovery of new biotechnological processes calls into question the ability of the law to provide sufficient protection for human beings from the beginning of their lite. These new methods, such as the CRISPR/Cas9 method -also known as "genome editing" -mitochondrial donation, and the creation of human induced pluripotent stem cells (hiPS cells), make it possible to manipulate and influence in a fundamental way the genetic make-up of one's offspring and future generations. This thesis aims to prepare a draft law addressed to the German legislature. ln so doing, it takes into account two aspects : on the one hand, it aims to optimise, on the basis of a comparative analysis of German and French law, current German legislation by identifying possible advantages of the regulatory approach in France. On the other hand – assuming that the techniques in question can one day be applied with controllable risks – it examines, on the basis of an analysis of German constitutional law, whether such a future application could, in principle, be justified and implements these considerations by drafting a legislative proposal.