Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1997. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [92]-96).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [78]-86).

Thesis (M.Sc.). / Written for the Dept. of Experimental Medicine. Title from title page of PDF (viewed 2008/05/14). Includes bibliographical references.

Cette thèse est consacrée à la régulation de la guanylate cyclase soluble (sGC), le récepteur endogène du monoxyde d'azote (NO) chez les mammifères qui est impliqué dans la transduction du signal. L'enzyme sGC est activée par la fixation du NO sur son hème et catalyse alors la formation du cGMP à partir du GTP. Alors que la sGC est présente dans de nombreuses cellules de mammifères, le domaine hémique bactérien homologue (H-NOX) est impliqué dans la détection du NO et la régulation du métabolisme. Un objectif important est la découverte d'inhibiteurs de la sGC pour ralentir la progression tumorale.Le criblage de composés naturels d'une chimiothèque mesurant l'activité de la sGC purifiée a révélé six inhibiteurs actifs (Ki = 0.2 – 1 µM). Avec deux autres composés actifs en photothérapie (hypericin et hypocrellin) nous avons démontré que ces inhibiteurs sont des effecteurs allostériques qui ne se fixent ni sur l'hème, ni sur le site catalytique ou de fixation des activateurs, découvrant une nouvelle classe de composés pharmacologiques ciblant la voie de signalisation NO/cGMP.La transition structurale induite par l'activateur riociguat en synergie avec le CO a été étudiée par spectroscopie d'absorption résolue en temps pour démontrer des changements de coordination de l'hème. Deux états d'activation distincts de la sGC par le CO existent simultanément avec les coordiantions 6c-hème et 5c-hème en présence de l'activateur qui induit la rupture de la liaison Fe-His de l'hème, à l'instar de l'activateur naturel NO. De plus, nous montrons que l'isoliquiritigénine, commercialisée comme activateur de la sGC, et en réalité un inhibiteur de la sGC.La dynamique ds ligands CO, NO, and O2 a été mesurée sur 12 ordres de grandeur temporelle pour le type sauvage et un mutant du transporteur bactérien du NO (AXCP). La simple mutation Leu16Ala augmente l'afinité pour le CO 108 fois, celle du NO 106 fois et rend cette protéine réactive à O2. Dans le cas de CO et NO dont les affinités pour L16A-AXCP sont les plus grandes jamais mesurées, la recombinaison bimoléculaire n'est pas détectable. Des simulations de dynamique moléculaire ont démontré que le CO dissocié est contraint de rester à 4 Å du Fe2+ par Ala16, contrairement au type sauvage Leu16.La dynamique de O2 a été mesurée dans la protéine senseur Tt H-NOX par spectroscopie d'absorption transitoire et confirme l'hypothèse que Tt H-NOX n'est sans doute pas un senseur de NO stricto sensu mais un senseur redox. Les propriétés de Tt-H-NOX ne sont pas compatibles avec le rôle d'un simple transporteur de NO. / This thesis is devoted to the regulation of soluble guanylate cyclase (sGC), the endogenous nitric oxide (NO) receptor in mammals involved in signal transduction. The enzyme is activated by the binding of NO to its heme and catalyzes the formation of cGMP from GTP. While sGC is present in many mammalian cells, the homologous bacterial domain (H-NOX) is involved in NO detection and metabolism regulation. An important objective was to find sGC inhibitors to slow down tumor progression.The screening of natural compounds from a chemical library, tested on purified sGC activity, revealed six active inhibitors (Ki = 0.2 – 1 µM). Together with two agents for photodynamic therapy (hypericin and hypocrellin) we demonstrated that these inhibitors are allosteric modulators which bind neither to the heme nor to the catalytic and activator sites, revealing a new class of pharmacological compounds targetting the NO/cGMP signaling pathway.The structural transition induced in sGC by stimulator riociguat in synergy with CO was studied by transient absorption spectroscopy to demonstrate coordination changes of the heme. Two different activation states of sGC with CO 6c-heme and 5c-heme exist simultaneously in the presence of the stimulator which induces the breaking of the heme Fe-His bond, as does the sGC natural effector NO. In addition, the effect of isoliquiritigenin, which is sold as a sGC activator, was shown to be actually an inhibitor of sGC.The dynamics of the ligands CO, NO and O2 were measured over 12 orders of magnitude in time in wild type and mutant of a bacterial NO transporter (AXCP). The single mutation Leu16Ala increased 108-fold the CO affinity, ~106-fold the NO affinity and makes this protein reactive to O2. In the case of CO and NO, whose affinities for L16A-AXCP are the largest ever measured, the bimolecular rebinding was absolutely not detectable. Molecular dynamic simulations demonstrated that dissociated CO is constrained to stay within 4 Å from Fe2+ by Ala16, contrarily to wild-type Leu16.The dynamics of O2 in Tt-H-NOX proteins measured by transient absorption spectroscopy confirmed the hypothesis that Tt-H-NOX may not be a NO-sensor stricto sensu but a redox sensor. The properties of the Tt-H-NOX protein are not compatible with the role a mere NO-carrier.

Les protéines activatrices de la guanylate cyclase (GCAPs) font partie de la famille des neuroprotéines sensibles au Ca²⁺ (NCS) et celle des protéines à EF-Hand. Il a été proposé que le mécanisme de Ca²⁺-myristoyl switch avait lieu chez toutes les protéines de la famille des NCS. Les travaux présentés dans ce mémoire permettent de déterminer si ce mécanisme est observé chez la GCAP1. En effet, des travaux de liaison membranaire à des monocouches de Langmuir effectués avec la GCAP1 ont permis d’observer ce mécanisme. De plus, l’utilisation d’un analogue du myristoyle, le 13-oxa-myristoyle, a aussi permis d’observer un Ca²⁺-myristoyl switch chez la GCAP1. Effectivement, des mesures en résonance magnétique nucléaire (RMN) ont démontré que la présence de cet analogue favorise l’extrusion du myristoyle. Finalement, différentes analyses par RMN ont été effectuées afin de déterminer si cette méthode pourrait permettre de déterminer la structure de la forme active de la GCAP1.

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Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 86-89).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1998. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [84]-100).

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Nitric oxide (NO), a reactive diatomic gas and a potent signaling molecule, is required for proper cardiovascular functioning. Soluble guanylate cyclase (sGC), a heterodimeric heme protein, is the key intracellular NO receptor protein which, upon NO binding, undergoes conformational changes leading to catalysis and the cGMP signaling cascade. Several small molecules that allosterically stimulate sGC have been developed for treatment of pulmonary hypertension, but little is known about their binding site or how they stimulate activity. This dissertation describes experiments designed to uncover the molecular basis for signal transduction in sGC by NO and small molecule stimulators. The crystal structure of the α-subunit PAS domain from Manduca sexta (Ms) sGC was solved at 1.8 Å resolution revealing the expected PAS fold but with an additional β strand and a shorter Fα helix. CO binding measurements on different Ms sGC N-terminal constructs and the β₁ (1-380) construct revealed that the α-subunit keeps the β₁ H-NOX domain in an inhibited conformation and this inhibition is relieved by removal of the α-subunit or by addition of stimulatory compounds such as compound YC-1. Linked-equilibria measurements on the N-terminal constructs show that YC-1 binding affinity is increased in the presence of CO. Surface plasmon resonance (SPR) studies on the in-vitro biotinylated constructs showed that YC-1 binds near or directly to the β₁ H-NOX domain. Computational and mutational analysis of the β₁ H-NOX domain revealed a pocket important in allostery and drug action. Finally, we show that the coiled coil domain plays an important role in allosteric regulation of the β₁ H-NOX domain and possibly in signal transduction. Our data are consistent with a model of allosteric activation in which the α-subunit and the coiled coil domains function to keep heme in a low affinity conformation while YC-1 binding to the β₁ H-NOX domain switches heme to a high affinity conformation, and sGC to its high activity form.