Les homologues Bcl-2 constituent une famille de protéines structurellement apparentées qui jouent un rôle central dans la régulation de l'apoptose. Les mécanismes de régulation de l'apoptose entérocytaire sont peu connus. Afin de mieux comprendre cette régulation, le but de ce travail était d'analyser l'établissement des mécanismes de contrôles de l'apoptose entérocytaire au cours du développement de l'intestin humain. Pour ce faire nous avons étudié l'expression épithéliale des homologues Bcl-2 proapototiques (Bax, Bak et Bad) et anti-apoptotiques (Bcl-2, Mcl-1 et BCI-X L ), ainsi que la molécule associée anti-apoptotique Bag-1, le long de l'axe cryptevillosité et pour les différents segments (jéjunum, iléon et côlon) de spécimens foetaux humains âgés de 9 à 20 semaines de gestation. Dans un premier temps, afin d'analyser l'expression épithéliale des homologues Bcl-2 le long de l'axe crypte-villosité, nous avons effectué des immunofluorescences indirectes en utilisant des anticorps spécifiques pour les homologues étudiés. Dans un deuxième temps, afin d'analyser l'expression épithéliale des homologues Bcl-2, nous avons effectué des Western blots."--Résumé abrégé par UMI.

Le cadmium (Cd) est un métal lourd auquel la population en générale est exposée par l'alimentation. L'épithélium intestinal accumule beaucoup de Cd ingéré et représente un organe cible. Étant donné le rôle de cet épithélium dans la biotransformation de xénobiotiques ingérés, l'objectif de notre étude était d'évaluer dans quelle mesure une exposition chronique au Cd peut perturber l'expression des enzymes de biotransformation lors de la différenciation des entérocytes. Comme modèle in vitro, nous avons utilisé la lignée cellulaire humaine Caco-2 qui développe spontanément un phénotype entérocytaire. Le Cd étant connu pour troubler certaines voies de signalisation cellulaires, nous avons testé les hypothèses suivantes : 1) ce métal pourrait modifier l'expression (niveaux et/ou profil) des enzymes de biotransformation; 2) il serait susceptible d'altérer le processus de différenciation. Le profil d'expression d'enzymes de biotransformation (CYP1A1, CYP3A4 et GSTP1) a été caractérisé par RT-PCR en fonction du temps de culture : les niveaux d'ARNm de la GSTP1, de la P-gp et du CYP1A1 augmentent durant la différenciation. Parallèlement, nous avons estimé par mesure d'activité MTT (viabilité cellulaire), la LC5, soit la concentration d'exposition menant à 5% de mortalité. Lorsque les cellules sont exposées durant la phase de prolifération, une période de récupération augmente considérablement la viabilité (LC5 = 87 ± 4 vs. 15.2 ± 0.7 µM). Une LC5 de 36 ± 2 µM est obtenue lorsque les cellules sont traitées pendant la phase de différenciation montrant que la période de sensibilité maximale est pendant la prolifération. Étant donné les profils d'expression obtenus selon le temps de culture des quatre enzymes d'intérêt dans les cellules Caco-2 témoins, nous avons choisi la LC5 de 36 ± 2 µM comme concentration d'exposition pendant la phase de différenciation pour tester l'effet du Cd. Une exposition chronique à cette concentration de Cd perturbe le profil d'expression d'enzymes. De plus hauts niveaux d'ARNm de GSTP1 et de la P-gp sont alors observés mais cette induction par le Cd est diminuée en présence de vitamine D3 ou de NAC, toutes deux antioxydantes. Ainsi, l'effet du Cd sur la GSTP1 et la P-gp serait médié par un déséquilibre rédox. Des mesures d'activités enzymatiques de CYP1A1 et de GSTP1 ont été effectuées afin de corréler l'effet du Cd sur les niveaux d'ARNm aux activités. Une activité extrêmement faible d'environ 0,290 pmol/min/mg de protéines microsomales a été mesurée dans les cellules contrôles et traitées au Cd de 21 jours, soit presque 100 fois moins que ce qui est rapporté dans la littérature, mais plusieurs études ont révélé l'effet inhibiteur du Cd sur l'activité EROD. Deux types de réponses sont observées quant à l'effet du Cd sur l'activité de la GST: (1) une légère stimulation, (2) une faible inhibition. Nous avons également mesuré une diminution de la résistance électrique transépithéliale confirmant ainsi que le Cd affecte l'intégrité de l'épithélium intestinal en augmentant la perméabilité paracellulaire. Par ailleurs, nos récents résultats suggèrent que le Cd diminue l'activité de la phosphatase alcaline, un marqueur de différenciation. Néanmoins, les enzymes de biotransformation n'étaient pas toutes affectées de la même façon, l'effet du Cd sur ces enzymes n'est pas le résultat (indirect) d'une action "non spécifique" sur le processus global de différenciation. Nos résultats montrent que l'exposition intestinale au Cd pourrait avoir des répercussions sur le métabolisme de premier passage des médicaments et autres xénobiotiques absorbés oralement. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules Caco-2, épithélium intestinal, cadmium, entérocyte, CYP1A1, CYP3A4, GSTP1

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin. / Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) posttranslationally promotes the degradation of the low-density lipoprotein receptor (LDLr) in hepatocytes and increases plasma LDL cholesterol. It is not clear, however, whether PCSK9 plays a role in the small intestine. Here, we characterized the patterns of variations of PCSK9 and LDLr in fully differentiated Caco-2/15 cells as a function of various potential effectors. Cholesterol (100 µM) solubilised in albumin or micelles significantly down-regulated PCSK9 gene (30%, p<0,05) and protein expression (50%, p<0,05), surprisingly in concert with a decrease in LDLr protein levels (45%, p<0,05). 25-hydroxycholesterol (50 µM) treated cells also displayed significant reduction in PCSK9 gene (37 %, p<0,01) and protein (75% p<0,001) expression, while LDLr showed a decrease at the gene (30%, p< 0,05) and protein (57%, p<0,01) levels, respectively. The amounts of PCSK9 mRNA and protein in Caco-2/15 cells were associated to the regulation of HMG-CoA reductase and sterol regulatory element binding protein-2 (SREBP-2) that can transcriptionally activate PCSK9 via sterol-regulatory elements located in its proximal promoter region. On the other hand, depletion of cholesterol content by hydroxypropyl-β-cyclodextrine up-regulated PCSK9 transcripts (20%, p<0,05) and protein mass (540%, p<0,001), in parallel with SREBP-2 protein levels. The addition of bile acids, taurocholate and deoxycholate, to the apical culture medium lowered PCSK9 gene expression (30%, p<0,01) and raised PCSK9 protein expression (43%, p<0,01) respectively, probably via the modulation of farnesoid X receptor. Combined, these data indicate that PCSK9 functions as a sensor of sterol in the small intestine.

L’intestin joue un rôle clé dans le contrôle de l’homéostasie énergétique. Les entérocytes sont des cellules polarisées qui permettent les échanges entre la lumière intestinale (membrane apicale) et le compartiment lymphatique et sanguin (membrane baso-latérale). Dans cette thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés au contrôle par les entérocytes de deux processus liés au métabolisme des lipides et du cholestérol : l’excrétion trans-intestinale de cholestérol (TICE) et l’absorption des lipides alimentaires.Très récemment, il a été montré que l’intestin contribue à 20-30% de l’excrétion fécale du cholestérol chez la souris. Ce mécanisme, appelé TICE, implique le passage direct du cholestérol provenant de la circulation sanguine à travers les entérocytes vers les fèces. De par son caractère modulable par des substances pharmacologiques comme l’ézétimibe et les statines, le TICE représente une cible thérapeutique potentielle pour corriger les dyslipidémies athérogènes du diabétique. Cependant, les mécanismes moléculaires gouvernant le transport rétrograde du cholestérol (du pôle baso-latéral au pôle apical) dans l’entérocyte lors du TICE, sont complètement inconnus. Dans une première étude, nous avons mis en évidence la lignée entérocytaire humaine Caco-2/TC7 comme un modèle d’étude des processus trans-entérocytaires liés au TICE. Nous avons d’abord montré que suite à l’incubation avec du plasma humain dans le compartiment baso-latéral et des micelles lipidiques dans le compartiment apical, les cellules Caco-2/TC7 miment des caractéristiques du TICE in vivo. De plus, grâce à ce modèle in vitro, nous avons pu identifier les microtubules comme acteurs nécessaires au transport rétrograde du cholestérol dans l’entérocyte. Dans une seconde étude, nous nous sommes intéressés au contrôle par le récepteur nucléaire Rev-erbα de la production des chylomicrons (CM) par les entérocytes. En effet, bien qu’essentiellement vue comme la conséquence d’une clairance retardée, des données émergentes présentent la surproduction de CM par l’intestin comme un contributeur majeur de la dyslipidémie chez l’insulino-résistant. Il existe une balance, au sein de l’entérocyte, entre l’utilisation des lipides absorbés pour un stockage transitoire sous forme de gouttelettes lipidiques (GL) cytosoliques ou pour l’assemblage de lipoprotéines riches en triglycérides (LRT). Le récepteur nucléaire Rev-erbα est un répresseur transcriptionnel impliqué dans le métabolisme énergétique et le rythme circadien. Rev-erbα contrôle particulièrement le métabolisme lipidique au niveau du foie et le catabolisme des LRT. Pour cette seconde étude, une lignée Caco-2/TC7 invalidée pour Rev-erbα (sh Rev-erbα) a donc été développée par infection lentivirale et différenciée sur insert. Les résultats indiquent que suite à l’incubation avec des micelles lipidiques dans le compartiment apical, les cellules Caco-2/TC7 sh Rev-erbα sécrètent plus de LRT dans le milieu baso-latéral et stockent moins de lipides sous la forme de GL cytosoliques. De plus, la lignée Caco-2/TC7 sh Rev-erbα présente une activité lipophagique plus importante et l’inhibition de l’autophagie par la bafilomycine dans cette lignée restaure la sécrétion baso-latérale de LRT et le stockage intracellulaire de GL aux mêmes niveaux que ceux de la lignée sh control. Cette seconde étude montre donc que l’invalidation de Rev-erbα dans l’entérocyte entraîne une augmentation de la mobilisation des lipides des GL via le processus de la lipophagie résultant en une augmentation de la sécrétion de LRT. Notre hypothèse est que Rev-erbα joue un rôle clé dans le contrôle de la balance GL/LRT et donc de la triglycéridémie post-prandiale.Les deux études présentées dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes liés au contrôle du métabolisme lipidique par l’intestin et mettent ainsi en avant l’intestin comme une cible thérapeutique potentielle pour corriger les dyslipidémies du diabétique. / The intestine plays a key role in the control of energy homeostasis. Enterocytes, which constitute the main cellular type of intestinal epithelium (> 90%), are polarized cells allowing exchanges between intestinal lumen (apical membrane) and lymph/blood compartment (basolateral membrane). In this thesis, cholesterol and lipid metabolism control by enterocytes was studied and particularly, trans intestinal cholesterol excretion (TICE) and dietary lipid absorption.Recently, it has been estimated that intestine contributes 20-30% of fecal neutral sterol excretion in chow-fed mice. This pathway called TICE involves the direct luminal secretion of plasma-derived cholesterol by enterocytes. Moreover, TICE can be pharmacologically modulated, for instance by ezetimibe and statins and so, represents a new therapeutic target in order to prevent atherosclerosis in type 2 diabetic patients. However, at present, the molecular mechanisms behind the trans-enterocytic process of TICE are still unknown, especially the steps sustaining cholesterol entry, trafficking and efflux in enterocytes. In the first study of this thesis, we highlighted the human enterocytic Caco-2/TC7 cell line as a suitable model to study the enterocyte-related processes of TICE. We have first shown that upon basolateral incubation with human plasma and apical incubation with lipid micelles, differentiated Caco-2/TC7 cells mimic some of the in vivo TICE features. Moreover, using this model, we have identified a key role of the microtubule network in the process.In the second study of this thesis, chylomicron secretion by enterocytes and its control by the nuclear receptor Rev-erbα were investigated. Indeed, although chylomicron remnant accumulation has been associated to a delayed clearance by the liver, some recent studies show that chylomicron overproduction by the intestine is a major contributor to dyslipidemia in insulin resistant patients. Dietary lipid absorption results from a balance between transient storage in enterocytes as cytosolic lipid droplets (LD) and secretion as triglyceride-rich lipoproteins (TRL). The nuclear receptor Rev-erbα is a transcriptional repressor involved in the energy metabolism and the circadian rhythm. Particularly, Rev-erbα controls lipid metabolism in the liver and thus the catabolism of TRL. The aim of this second study was to investigate the role of Rev-erbα in intestinal lipid metabolism and particularly in TRL secretion. To study that, Caco-2/TC7 cells infected with lentivirus encoding or not a shRNA targeting Rev-erbα (sh Rev-erbα) were grown on transwells. Compared to sh control, sh Rev-erbα Caco-2/TC7 cells secrete higher amounts of micelle-derived LRT in the basolateral medium and exhibit lower quantity of neutral lipids stored as cytosolic LD, whereas the apical uptake is not different. Activation of lipophagy in sh Rev-erbα compared to sh control cells was evidenced by a higher autophagic flux and an increased colocalization of the autophagy marker LC3 with LD. Finally, autophagy inhibition with bafilomycin in sh Rev-erbα cells restores lipid secretion to the same level as in sh control cells. This second study show that Rev-erbα knock-down in enterocytes leads to a higher lipophagy-mediated remobilization of intracellular lipids and an increased TRL secretion. Our hypothesis is that Rev-erbα may be a molecular gear in the control of chylomicron secretion and a major regulator of post-prandial triglyceridemia.In conclusion, these two studies allow to better understand lipid metabolism control by the intestine: the first one by identifying the contribution of the microtubule network in enterocytes for trans-enterocytic retrograde cholesterol transport; the second one by highlighting the nuclear receptor Rev-erbα as a regulator of TRL secretion by enterocytes. These two studies point out the intestine as a potential therapeutic target to treat dyslipidemia in type 2 diabetic patients.

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin. / Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) posttranslationally promotes the degradation of the low-density lipoprotein receptor (LDLr) in hepatocytes and increases plasma LDL cholesterol. It is not clear, however, whether PCSK9 plays a role in the small intestine. Here, we characterized the patterns of variations of PCSK9 and LDLr in fully differentiated Caco-2/15 cells as a function of various potential effectors. Cholesterol (100 µM) solubilised in albumin or micelles significantly down-regulated PCSK9 gene (30%, p<0,05) and protein expression (50%, p<0,05), surprisingly in concert with a decrease in LDLr protein levels (45%, p<0,05). 25-hydroxycholesterol (50 µM) treated cells also displayed significant reduction in PCSK9 gene (37 %, p<0,01) and protein (75% p<0,001) expression, while LDLr showed a decrease at the gene (30%, p< 0,05) and protein (57%, p<0,01) levels, respectively. The amounts of PCSK9 mRNA and protein in Caco-2/15 cells were associated to the regulation of HMG-CoA reductase and sterol regulatory element binding protein-2 (SREBP-2) that can transcriptionally activate PCSK9 via sterol-regulatory elements located in its proximal promoter region. On the other hand, depletion of cholesterol content by hydroxypropyl-β-cyclodextrine up-regulated PCSK9 transcripts (20%, p<0,05) and protein mass (540%, p<0,001), in parallel with SREBP-2 protein levels. The addition of bile acids, taurocholate and deoxycholate, to the apical culture medium lowered PCSK9 gene expression (30%, p<0,01) and raised PCSK9 protein expression (43%, p<0,01) respectively, probably via the modulation of farnesoid X receptor. Combined, these data indicate that PCSK9 functions as a sensor of sterol in the small intestine.

Parmi les cinq isotypes d’anticorps présents chez l’Homme, les immunoglobulines A (IgA) prédominent dans les muqueuses. Les IgA sont produites dans le chorion sous forme majoritairement polymérique (pIgA) et sécrétées dans la lumière des muqueuses. Leur transport trans-épithélial est assuré par le récepteur aux immunoglobulines polymériques (pIgR), exprimé au pôle basal des épithéliums. Les pIgA ainsi sécrétées conservent le domaine extracellulaire du pIgR et sont appelées IgA sécrétoires (SIgA). Une fonction essentielle des SIgA intestinales est de maintenir microorganismes et antigènes alimentaires dans la lumière des muqueuses afin d’empêcher leur pénétration dans l'organisme. Néanmoins, la transcytose inverse des SIgA couplées à des bactéries a été décrite dans les plaques de Peyer où elle participe à la génération de la réponse immune contre ces bactéries. En outre, les travaux passés du laboratoire ont suggéré que le récepteur de la transferrine (CD71), surexprimé au pôle apical des entérocytes chez les patients cœliaques, interagit avec les SIgA couplées à des peptides de gliadines et permet leur transcytose inverse à travers l’épithélium intestinal. Ce travail de thèse a eu pour objectif de mieux caractériser l’interaction SIgA-CD71 dans les entérocytes humains. Dans un premier temps, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9 pour générer une lignée cellulaire intestinale humaine (Caco-2 TC7) dépourvue du récepteur CD71 (CD71KO). De manière inattendue, nous n’avons observé aucune altération de la fixation des SIgA sur les cellules Caco-2 CD71KO. Ce résultat nous a amenés à réévaluer le rôle de CD71 comme récepteur aux SIgA. Dans un second temps, nous avons vérifié et confirmé que les SIgA interagissent avec CD71, mais nous avons montré que cette interaction est indirecte. Nous avons ensuite criblé les récepteurs aux IgA déjà décrits dans la littérature et montré qu'aucun n'est responsable de la fixation des SIgA à la surface des cellules Caco-2 TC7. Ces résultats nous ont amenés à chercher le(s) autre(s) partenaire(s) du complexe SIgA-CD71. Par immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons identifié les protéines Secretory Carrier Membrane Protein 3 (SCAMP3), B-Cell Receptor-Associated Protein 31 (BCAP31) et Histocompatibility minor 13 (HM13) comme membres du complexe SIgA-CD71. En nous appuyant à nouveau sur la technologie CRIPSR-Cas9, nous avons montré qu’aucun de ses partenaires n’interagit directement avec les SIgA. Néanmoins, nos résultats suggèrent que SCAMP3 est nécessaire à l’oligomérisation de surface des complexes de fixation des SIgA. Enfin, l’internalisation des SIgA n'est pas altérée par l’absence de chacun des partenaires du complexe, suggérant que leur rôle advient durant le transport trans-épithélial des SIgA. L’ensemble de nos travaux montre que les SIgA interagissent avec l'épithélium intestinal via un complexe protéique composé d'au moins cinq membres : CD71, SCAMP3, BCAP31, HM13 et le(s) récepteur(s) inconnu(s) aux SIgA. Ces résultats complètent les travaux antérieurs sur le rôle physiopathologique des SIgA dans la maladie cœliaque et contribuent à souligner la complexité des interactions entre IgA et entérocytes. Une question importante sera d’identifier le(s) récepteur(s) aux SIgA et de déterminer le rôle des partenaires identifiés dans la transcytose inverse des SIgA par l’entérocyte. / Among the five isotypes of antibodies found in Humans, immunoglobulins A (IgA) are the most abundant in the mucosae. In the lamina propria, IgA are produced mainly as polymeric IgA (pIgA) and then secreted in the lumen. In fact, pIgA are translocated across the epithelium via the polymeric immunoglobulin receptor (pIgR), which is expressed at the basolateral side of the epithelium. Once secreted in the lumen, pIgA retain the extracellular domain of the pIgR and are called secretory IgA (SIgA). One of the main functions of intestinal SIgA is to restrain microorganisms and dietary antigens in the lumen, therefore, preventing their uptake through the epithelial barrier. However, retrotranscytosis of SIgA conjugated to bacteria has been described in Peyer’s patches where it participates to immune response. Moreover, previous works from the laboratory have suggested that transferrin receptor (CD71), which is overexpressed at the apical side of enterocytes from coeliac patients, interacts with SIgA bound to gliadin peptides and allows their retrotranscytosis across the intestinal epithelium. This thesis work aimed to further characterize the interaction between SIgA and CD71 in human enterocytes. We, first, generated a human epithelial intestinal cell line (Caco-2 TC7) devoid of CD71 expression (CD71KO) using the CRISPR/Cas9 genome editing method. Unexpectedly, flow cytometry experiments did not reveal a significant reduction of SIgA binding at the cell surface of CD71KO cells. Overall, our results indicated that CD71-SIgA interaction is indirect and may occur via additional protein partners through the assembly of a multifactorial protein complex. Therefore, we screened IgA receptors already known in the literature and showed that all are dispensable for SIgA binding at the surface of Caco-2 TC7 cells. In the effort to identify partner(s) within SIgA-CD71 complex, we set out mass spectrometry-based immunoprecipitation proteomics experiments and identified secretory carrier membrane protein 3 (SCAMP3), B-cell receptor-associated protein 31 (BCAP31) and histocompatibility minor 13 (HM13) as members of SIgA-CD71 complex. By generating knockout cell lines with the CRISPR/Cas9 system, we showed that none of these partners directly interacts with SIgA. However, our results suggest that SCAMP3 is required for the oligomerization of SIgA complexes at cell surface. Finally, we did not find any role in SIgA internalization for the different members of the complex, suggesting that they may play a role later on during SIgA retrotranscytosis. In conclusion, our work shows that SIgA interact with the intestinal epithelium via a proteic complex composed of at least five members: CD71, SCAMP3, BCAP31, HM13 and one or more unknown SIgA receptor(s). These results complement the previous works on the pathophysiologic role of SIgA in coeliac disease and underline the highly complex interaction between IgA and enterocytes. An important point to address will be to identify SIgA receptor(s) and to determine the role of the four other identified partners in SIgA retrotranscytosis across the intestinal epithelium.

La résistance à l’insuline et le diabète de type 2 (DT2) sont caractérisés par une hyperlipidémie. Le but de cette étude est de déterminer si le DT2 contribue au dérèglement du métabolisme du cholestérol au niveau du petit intestin et du foie du Psammomys obesus, un modèle animal nutritionnel d’induction de la résistance à l’insuline et du DT2. L’absorption intestinale du cholestérol est diminuée chez les animaux diabétiques. Cette diminution est associée à une baisse (i) de l’expression génique et protéique de NPC1-L1 qui joue un rôle primordial dans l’absorption du cholestérol au niveau des entérocytes; et (ii) de l’ARNm de l’ABCA1 responsable de l’efflux de cholestérol des cellules intestinales à l’apolipoprotéine A-I et aux HDLs. En ce qui a trait aux transporteurs SR-B1 et Annexin II, aucune différence n’a été observée au niveau intestinal. Toutefois, une diminution significative de l’expression génique de l’ABCG5, un intervenant majeur dans la sécrétion du cholestérol des entérocytes vers la lumière intestinale, est mesurée chez les animaux diabétiques. De plus, l’expression protéique est diminuée pour le PCSK9 et augmentée pour le LDLr au niveau du jéjunum, tandis que la quantité de protéine de l’enzyme HMG-CoA réductase est régulée à la baisse chez les Psammomys obesus diabétiques. Finalement, de tous les facteurs de transcription testés seule une augmentation de LXR et une diminution de PPAR/δ sont détectées au niveau de l’intestin. Au niveau hépatique, il y a (i) une augmentation de la masse protéique de NPC1-L1, SR-BI et Annexin II; (ii) une élévation l’ARNm de SR-BI; (iii) une diminution du contenu protéique de ABCG8 et de l’expression génique de l’ABCG5 et de l’ABCA1; et (iv) une élévation de l’ARNm de LXR et de PPAR/δ, tout comme une baisse de l’expression protéique de SREBP-2. Somme toute, nos résultats montrent que le développement du diabète de type 2 chez le Psammomys obesus entraîne un changement dans la machinerie intra-entérocytaire et hépatocytaire, qui mène à un dérèglement de l’homéostasie du cholestérol. / Insulin resistance and type 2 diabetes (T2D) are characterized by hyperlipidemia. The aim of the present study was to elucidate whether T2D contributes to abnormal cholesterol homeostasis in the small intestine and liver of Psammomys obesus, a model of nutritionally induced insulin resistance and type 2 diabetes. Diabetic animals exhibited a lower intestinal cholesterol uptake, which was associated with a decrease in (i) the gene and protein expression of NPC1L1, which plays a pivotal role in cholesterol incorporation in the enterocytes; and (ii) mRNA of ABCA1 that mediates cholesterol efflux from intestinal cells to apolipoprotein A-I and HDL. No changes were observed in the other intestinal transporters SR-BI and Annexin II. On the other hand, in diabetic animals, a significant mRNA decrease was noticed in ABCG5 responsible for the secretion of absorbed cholesterol back into the lumen. Furthermore, jejunal PCSk9 protein was diminished and LDLr was raised, along with a significant downregulation in jejunal HMG-CoA reductase in diabetic Psammomys obesus. Finally, among the transcription factors tested, only an increase in LXR and a decrease in PPAR/δ were detected in the intestine. In the liver, there was (i) an augmentation in the protein mass of NPC1L1, SR-BI and Annexin II; (ii) an upregulation of SR-BI mRNA; (iii) a fall in ABCG8 protein content, ABCG5 mRNA and ABCA1 mRNA; and (iv) an augmentation in LXR and PPAR/δ mRNA, as well as a drop in SREBP-2 protein. Overall, our findings show that the development of type 2 diabetes in Psammomys obesus modifies the whole intra-enterocyte and hepatocyte machinery, causing alterations in cholesterol homeostasis.

La résistance à l’insuline et le diabète de type 2 (DT2) sont caractérisés par une hyperlipidémie. Le but de cette étude est de déterminer si le DT2 contribue au dérèglement du métabolisme du cholestérol au niveau du petit intestin et du foie du Psammomys obesus, un modèle animal nutritionnel d’induction de la résistance à l’insuline et du DT2. L’absorption intestinale du cholestérol est diminuée chez les animaux diabétiques. Cette diminution est associée à une baisse (i) de l’expression génique et protéique de NPC1-L1 qui joue un rôle primordial dans l’absorption du cholestérol au niveau des entérocytes; et (ii) de l’ARNm de l’ABCA1 responsable de l’efflux de cholestérol des cellules intestinales à l’apolipoprotéine A-I et aux HDLs. En ce qui a trait aux transporteurs SR-B1 et Annexin II, aucune différence n’a été observée au niveau intestinal. Toutefois, une diminution significative de l’expression génique de l’ABCG5, un intervenant majeur dans la sécrétion du cholestérol des entérocytes vers la lumière intestinale, est mesurée chez les animaux diabétiques. De plus, l’expression protéique est diminuée pour le PCSK9 et augmentée pour le LDLr au niveau du jéjunum, tandis que la quantité de protéine de l’enzyme HMG-CoA réductase est régulée à la baisse chez les Psammomys obesus diabétiques. Finalement, de tous les facteurs de transcription testés seule une augmentation de LXR et une diminution de PPAR/δ sont détectées au niveau de l’intestin. Au niveau hépatique, il y a (i) une augmentation de la masse protéique de NPC1-L1, SR-BI et Annexin II; (ii) une élévation l’ARNm de SR-BI; (iii) une diminution du contenu protéique de ABCG8 et de l’expression génique de l’ABCG5 et de l’ABCA1; et (iv) une élévation de l’ARNm de LXR et de PPAR/δ, tout comme une baisse de l’expression protéique de SREBP-2. Somme toute, nos résultats montrent que le développement du diabète de type 2 chez le Psammomys obesus entraîne un changement dans la machinerie intra-entérocytaire et hépatocytaire, qui mène à un dérèglement de l’homéostasie du cholestérol. / Insulin resistance and type 2 diabetes (T2D) are characterized by hyperlipidemia. The aim of the present study was to elucidate whether T2D contributes to abnormal cholesterol homeostasis in the small intestine and liver of Psammomys obesus, a model of nutritionally induced insulin resistance and type 2 diabetes. Diabetic animals exhibited a lower intestinal cholesterol uptake, which was associated with a decrease in (i) the gene and protein expression of NPC1L1, which plays a pivotal role in cholesterol incorporation in the enterocytes; and (ii) mRNA of ABCA1 that mediates cholesterol efflux from intestinal cells to apolipoprotein A-I and HDL. No changes were observed in the other intestinal transporters SR-BI and Annexin II. On the other hand, in diabetic animals, a significant mRNA decrease was noticed in ABCG5 responsible for the secretion of absorbed cholesterol back into the lumen. Furthermore, jejunal PCSk9 protein was diminished and LDLr was raised, along with a significant downregulation in jejunal HMG-CoA reductase in diabetic Psammomys obesus. Finally, among the transcription factors tested, only an increase in LXR and a decrease in PPAR/δ were detected in the intestine. In the liver, there was (i) an augmentation in the protein mass of NPC1L1, SR-BI and Annexin II; (ii) an upregulation of SR-BI mRNA; (iii) a fall in ABCG8 protein content, ABCG5 mRNA and ABCA1 mRNA; and (iv) an augmentation in LXR and PPAR/δ mRNA, as well as a drop in SREBP-2 protein. Overall, our findings show that the development of type 2 diabetes in Psammomys obesus modifies the whole intra-enterocyte and hepatocyte machinery, causing alterations in cholesterol homeostasis.