Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Divers évènements d’épissage alternatif ont été identifiés pour certains gènes de la famille FANC, notamment pour FANCE. La voie de réparation de l’ADN FANC-BRCA nécessite l’intégrité de l’ensemble des protéines Fanconi afin d’assurer l’efficacité de la réparation des pontages inter-brins. Nous avons alors étudié l’impact de l’expression du variant d’épissage alternatif FANCE∆4 au niveau de la voie FANC-BRCA. Son expression exclusive dans des cellules déficientes en FANCE (EUFA130) n’est pas suffisante pour restaurer l’activation de la voie de réparation. À la suite d’un traitement avec un agent pontant (mitomycine C), les cellules EUFA130 complémentées avec FANCE∆4 demeurent bloquées en phase G2/M du cycle cellulaire, la viabilité n’est pas augmentée et la monoubiquitination de FANCD2 et FANCI est absente, contrairement aux cellules EUFA130 complémentées avec FANCE. Ce projet a particulièrement permis de déterminer que FANCE∆4 n’est pas en mesure de se substituer lors de la perte de FANCE. / Several alternative splicing events were identified for some genes of the FANC family, such as FANCE. The integrity of the proteins of the FANC-BRCA DNA repair pathway is necessary to maintain efficient ICL repair. We studied the impact of the expression of an alternative splicing isoform, FANCE∆4. Its exclusive expression in FANCE-deficient cells (EUFA130) is not sufficient to restore the activation of the pathway. Following treatment with crosslink agent (mitomycin C), EUFA130 cells complemented with FANCE∆4 are blocked in G2/M phase of the cell cycle, the viability is not increased and the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI is absent, in contrast to EUFA130 cells complemented with FANCE. This project highlights FANCE∆4 that cannot replace FANCE in regard to DNA repair.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une insuffisance médullaire, des malformations congénitales et une prédisposition accrue au développement de cancers. Aujourd’hui, 16 protéines sont identifiées pour coopérer ensemble dans la voie métabolique de Fanconi, impliquées principalement dans la réparation de l’ADN. Pour mieux comprendre le rôle des protéines Fanconi dans d’autres mécanismes cellulaires, un criblage en double hybride a été réalisé au laboratoire afin d’identifier plusieurs nouveaux partenaires protéiques d’intérêt. La protéine associée aux microtubules, la stathmine (STMN) a ainsi été identifiée comme un nouveau partenaire potentiel de la protéine Fanconi C (FANCC). L’étude de l’interaction a confirmé un lien direct entre FANCC et STMN et révèle qu’une mutation ponctuelle, ou une délétion de l’exon 1 de FANCC, cause une perte de cette interaction. Afin d’éclaircir la fonction du complexe FANCC-STMN, nous avons étudié la localisation des protéines durant le cycle cellulaire par immunofluorescence. Les résultats ont permis de mettre en évidence une localisation commune de FANCC et STMN dans les centrosomes de cellules en mitose. Une variation de l’état de phosphorylation de STMN dans les centrosomes a été observée dans plusieurs lignées cellulaires de patients. Ainsi, les protéines FANC semblent participer à la régulation de l’état de phosphorylation de STMN durant la progression du cycle cellulaire. Pour finir, les cellules de patients FA présentent de nombreuses malformations mitotiques, tels qu’un nombre important de centrosomes surnuméraire et un fuseau mitotique de petites tailles. Notre étude a permis de montrer que la protéine FANCC participe à la régulation de l’état de phosphorylation de STMN durant la division cellulaire, via une interaction directe. Nos résultats suggèrent également que les protéines FANC semblent participer à la progression du cycle cellulaire, en régulant de manière indirecte l’activité de STMN. Puisque la dérégulation de STMN est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse, une augmentation de l’activité de STMN dans les cellules FA semble expliquer la sensibilité des patients à développer différents types de cancer et représente une nouvelle cible prometteuse pour le traitement des cancers chez les patients FA. / The Fanconi Anemia (FA) is a genetic recessive disease characterized by a bone marrow failure, various congenital malformations, and predispose to the development of cancers. Currently, 16 proteins are identified to cooperate together in Fanconi pathway, known mainly to play a role in DNA reparation. For better understanding the involvement of Fanconi proteins in other cellular mechanisms and to identify new partners of interest, a double hybrid screen had been realized at the laboratory. The microtubule-associated protein, the stathmin (STMN), had been identified as a new potential protein partner of the Fanconi protein C (FANCC). Our study has confirmed a direct interaction between FANCC and STMN proteins, and identified that a punctually mutation or exon 1 deletion in FANCC induced a loss of this interaction. In order to clarify the function of the FANCC-STMN complex, we have study the localization of these proteins during the cell cycle by immunofluorescence experiments. These results have unveiled a co-localization of FANCC and STMN proteins in the centrosome of cells in mitosis. A decrease of STMN phosphorylation in the centrosome had been observed in fibroblast cells of FA patients. So, the FANC protein seems to be involved in the regulation of STMN phosphorylation during the cell cycle progression. Finally, the cells from FA patients display many mitotic spindle abnormities, such as an elevated number of supernumerary centrosomes and a decrease of mitotic spindle sizes. Our study demonstrates that the FANCC protein is involved in the regulation of STMN phosphorylation during the cell division. Our results suggest also that the FANC protein seems participate in the cell cycle progression. Knowing that the STMN deregulation is involved in the carcinogenesis, an increase of STMN activity in the FA cells seems explain the sensibility of patients to develop various cancers. The STMN protein represents a possible therapeutic target to cancer treatment of FA patients.

L'anémie de Fanconi (FA) est caractérisée par une aplasie médullaire, un risque accru de développer des cancers, ainsi que plusieurs types de malformations congénitales. La voie de NOTCH1 est impliquée dans l'embryogenèse et le maintien des cellules souches hématopoïétiques (HSC), qui sont déréglés chez les patients FA. Puisque les voies signalétiques de l'anémie de Fanconi et de NOTCH1 jouent un rôle essentiel dans l'hématopoïèse et le développement, nous avons étudié les liens qui existent entre les protéines FA et Hairy Enhancer of Split 1 (HES1), un effecteur de la voie de NOTCH1. Nous avons montré une interaction entre l'effecteur HES1 et le complexe FA, nécessaire à l'intégrité de la voie de l'anémie de Fanconi. Nos résultats indiquent également que la protéine HES1, en plus d'être un partenaire du complexe FA, est une cible de son activité E3 ubiquitine ligase. De plus, nous avons montré que le complexe FA est un co-régulateur de l'expression génique des cibles de l'effecteur HES1, en bloquant la formation du complexe de répression transcriptionnelle HESl-TLE/Gro. Finalement, l'étude fonctionnelle de l'interaction du complexe FA avec HES1 nous a permis de comprendre l'inter-relation qui existe entre les voies signalétiques de l'anémie de Fanconi et de NOTCH1, par le biais de l'effecteur HES1.

L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie multigénique récessive rare qui atteint les enfants en bas âge. Plusieurs protéines FA forment un complexe nucléaire essentiel à l'activité de la voie de l'anémie de Fanconi au cours des mécanismes de réparation de l'ADN et d'apoptose ainsi qu'au cours du cycle cellulaire et du développement. Les patients FA présentent tous une pancytopénie qui résulte du non renouvellement des cellules souches de la moelle osseuse et sont souvent atteints de malformations congénitales. Malgré les récentes avancées sur la compréhension de la dynamique et de la régulation de la voie Fanconi, la fonction de la plupart des protéines FA demeure toujours inconnue. L'objectif principal du projet de recherche était donc d'identifier d'éventuels partenaires biochimiques de la protéine FANCC par un criblage de banque d'ADNc afin de mieux comprendre la fonction des protéines FA dans les divers mécanismes cellulaires. Deux interacteurs potentiels retenus, soit CtBPl et UNC5A, ont été analysés pour leur capacité à interagir ou colocaliser avec d'autres protéines Fanconi par double hybride dans la levure, par coimmunoprécipitation et par immunofluorescence. Il a été montré que CtBPl interagit avec le complexe Fanconi et que UNC5A interagit avec la protéine FANCC. Aussi, l'activation de la voie Wnt induit une translocation nucléaire et une colocalisation des protéines F ANC A, FANCC et CtBPl. L'interaction directe entre le corépresseur CtBPl et le complexe FA suggère un rôle de la voie Fanconi dans les mécanismes de développement par le biais de la voie de développement Wnt. D'autres analyses sont nécessaires pour postuler sur l'implication de la protéine UNC5A dans l'anémie de Fanconi.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie infantile multigénique et complexe. Les enfants atteints d’AF souffrent d’une insuffisance médullaire progressive potentiellement mortelle. En plus du phénotype hématologique, les enfants souffrant d’AF présentent de nombreuses malformations congénitales incluant le système nerveux central et une prédisposition accrue aux cancers particulièrement de type leucémique. Plusieurs gènes associés à la maladie ont été identifiés mais leur fonction dans l’étiologie de la maladie demeure inconnue. La présence d’une mutation dans l’un des gènes Fanconi entraine une perte progressive des cellules souches hématopoïétiques (CSH) menant à un épuisement médullaire et favorisant l’apparition de leucémies. Les protéines Fanconi forment trois complexes protéiques distincts qui participent de manière séquentielle dans une voie de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN. La protéine Fanconi Anemia de groupe C, ou FANCC, est une composante du complexe majeur de cette voie Fanconi. Outre son rôle dans la voie Fanconi et dans les mécanismes de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN, FANCC est connue pour son implication dans la mort cellulaire programmée, la détoxification des radicaux oxygénés et la réponse aux cytokines. Afin d’identifier la fonction de la protéine FANCC dans les mécanismes de développement, nous avons procédé à un criblage d’une banque d’ADNc et identifié certains partenaires biochimiques de FANCC tel le récepteur de la Netrine-1, uncoordinated-5A (UNC5A). Puisque le récepteur UNC5A a une fonction de signal de survie cellulaire et est impliqué dans les mécanismes de croissance neuronale, nous avons étudié le rôle de l’interaction FANCC-UNC5A dans les mécanismes de différenciation neuronale. Nos résultats indiquent que FANCC régule la fonction pro-apoptotique de UNC5A. Lorsque FANCC est surexprimée, les cellules retardent leur entrée en apoptose tandis qu’en absence de FANCC, UNC5A favorise l’entrée en apoptose. De plus, nos résultats indiquent que FANCC conjointement à UNC5A promeut la neurogénèse; FANCC et UNC5A colocalisent dans les neurites cellulaires. Globalement, nos résultats suggèrent que FANCC par le biais de UNC5A joue un rôle important dans la mort cellulaire et la croissance axonale. Ainsi, une dérégulation de l’interaction FANCC-UNC5A chez les patients souffrent de FA pourrait expliquer certains aspects cliniques notamment les anomalies de développement. / Fanconi anemia (FA) is a recessive syndrome characterized by diverse clinical symptoms including progressive bone marrow failure, various congenital abnormalities, chromosomal instability and predisposition to malignancies. Studies of the canonical FA pathway have focused on the mechanism of repair of DNA cross-linking damage. However, some data suggest that FA proteins may have other functions besides DNA damage signaling events, and these functions may explain some of the disease phenotypes such as defects in hematopoiesis and congenital malformations. For instance, FANCC, which is predominantly located in the cytoplasm, has multifunctional roles and is an anti-apoptotic regulator. In addition to its function as a repulsive mediator in neural development, UNC5A, the receptor for the axon guidance molecule Netrin-1, has also been proposed to be a “dependence receptor” that triggers apoptosis in the absence of its ligand. Here, we identified a novel interaction of UNC5A with FANCC and showed that FANCC positively regulates UNC5A-mediated apoptosis. Under conditions of FANCC overexpression, apoptosis is decreased, whereas the absence of a functional FANCC protein increases UNC5A-mediated apoptosis. Furthermore, FANCC and UNC5A function as a complex in neurogenesis; they co-localize at synapses formed by neurites, and FANCC is required for the promotion of neuronal outgrowth by UNC5A. Based on these findings, we propose that FANCC plays a key role in tissue morphogenesis by either delaying UNC5A-mediated apoptosis or positively impacting the expression of UNC5A. Under FANCC-deficient conditions, dysregulation of the UNC5A signal pathway can lead to developmental defects such as those seen in FA patients.

L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie rare et les patients présentent des malformations congénitales, des problèmes hématologiques et une prédisposition à certains cancers. Jusqu'à maintenant, 13 protéines FA ont été identifiées, dont 8 (FANC- A, B, C, E, F, G, L, M) s'associent pour former un complexe qui permet l'ubiquitination de FANCD2 et FANCI. Les autres protéines FA sont impliquées au niveau de la réparation de l'ADN ce qui ne permet pas d'expliquer en totalité le phénotype des patients. Récemment, HES1, effecteur de la voie de Notch, a été identifié comme un partenaire essentiel à la formation du complexe FA. HES1 est connue pour être impliquée dans le développement et l'hématopoïèse. L'interaction d'HES1 avec le complexe FA altérée pourrait expliquer en partie le phénotype des patients. L'objectif principal est de créer un peptide inhibiteur visant à altérer la liaison d'HES1 avec le complexe FA, sans toutefois modifier les autres fonctions d'HES1 dans la cellule. Un deuxième objectif est d'identifier de nouveaux partenaires au complexe FA afin de mieux comprendre le lien génotype-phénotype. L'identification d'un peptide inhibiteur a été réalisée premièrement par la sélection de quatre régions d'HES1 (les acides aminés 90-123, 86-121, 76-111 et 152-190) et deuxièmement par le criblage d'une banque de peptides aléatoires avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²². Le système double hybride en levure a été utilisé pour vérifier les interactions directes entre les peptides et les membres du complexe FA et ces interactions ont été testées dans un modèle cellulaire par la technique de co-immunoprécipitation. L'identification de nouveau partenaire au complexe FA a été réalisée par le criblage d'une banque d'ADNc de moelle osseuse avec FANCE. Le criblage avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²² a permis d'identifier deux peptides, mais leur activité inhibitrice n'a pas été évaluée. Les quatre régions d'HES1 semblent n'avoir aucun effet sur la liaison entre HES1 et le complexe FA. Le criblage de la banque d'ADNc n'a pas permis d'identifier de nouveaux partenaires à FANCE. Des études approfondies sont nécessaires pour confirmer les effets des peptides sur la liaison entre HES1 et le complexe FA.

On compte aujourd’hui plus de 2000 patients dans le monde affectés par l’anémie de Fanconi (AF). Cette maladie rare est causée au niveau cellulaire par un défaut de réparation d’un type très particulier de lésions de l’ADN : les pontages inter-brins (ou ICLs, pour Interstrand CrossLink). Ceux-ci peuvent compromettre la transcription et la réplication, et donc à long terme la survie cellulaire. Pour y faire face, plus d’une vingtaine de protéines sont impliquées dans la voie FA-BRCA, chargée de détecter et d’activer la réparation de ces lésions dangereuses pour la cellule. Au niveau macroscopique, les manifestations de l’AF sont vastes et pas systématiquement présentes, ce qui en complique le diagnostic : pancytonémie, malformations développementales congénitales et prédisposition à certains cancers. Comme la plupart des symptômes ne sont pas spécifiques à l’AF, les enjeux et l’intérêt de son étude deviennent multiples. L’anémie de Fanconi offre un modèle d’étude particulièrement intéressant, qui permet d’explorer des mécanismes aussi variés que la cancérogenèse, l’hématopoïèse, la gamétogenèse et la réparation de l’ADN. Les connaissances sur le mécanisme moléculaire à proprement parler sont grandissantes, même si de nombreuses interrogations persistent. Parmi elles, le rôle précis du complexe ID2, formé des protéines FANCI et FANCD2, reste nébuleux. De plus en plus d’études décrivent des fonctions exclusives à FANCD2, laissant formuler l’hypothèse que la protéine FANCI pourrait elle aussi posséder ses propres rôles. Cependant, les études biochimiques ont certaines limites, comme par exemple l’impossibilité d’étudier in vitro des processus biologiques trop complexes. La création de modèles animaux peut être une solution. Pour répondre aux interrogations portées sur les fonctions de la protéine FANCI, nous avons décidé de caractériser un nouveau modèle murin Fanci-/- et de le comparer à la souris Fancd2-/-, déjà décrite dans la littérature. Nos résultats indiquent d’une part plusieurs rôles épistatiques avec FANCD2 et d’autre part un rôle propre dans le cadre de la gamétogenèse. En conclusion, cette thèse apporte un tout nouveau modèle animal pour étudier l’AF et plus spécifiquement FANCI. Elle apporte aussi les preuves physiologiques d’un rôle de FANCI indépendant au complexe ID2, ce qui viendrait nuancer le mécanisme biochimique actuellement établi. / Nowadays, about 2000 patients have been diagnosed with Fanconi Anemia (FA). At a cellular level, this rare disease is caused by a defect in reparing a specific type of DNA damage: Interstrand CrossLinks (ICLs). Both transcription and replication can be compromised by ICLs, and therefore long term cell survival. The FA-BRCA pathway is in charge of detecting DNA lesions caused by ICLs and activating their repair, and counts now more than twenty proteins. At a macroscopic level, FA diagnosis is complex due to various and not systematic symptoms: pancytonemia, congenital and developmental defects, and cancer predisposition. As most of FA symptoms are not exclusive to the disease, concerns and interests are multiple. As a consequence, Fanconi Anemia represents an interesting model of study, when it comes to work on oncogenesis, hematopoiesis, gametogenesis, and DNA repair. The description of the molecular mechanism is improving, although many questions remain. Among them, the exact role of the ID2 complex, formed by FANCI and FANCD2 proteins, remains nebulous. More and more studies have been describing unique functions for FANCD2, leading to the hypothesis of independent functions for FANCI. As complex physiological processes can not be studied in vitro, creating and studying animal models represents an interesting alternative. In order to answer the questions raised on FANCI functions, we have decided to create and characterize the new Fanci-/- mouse model, with a possible comparison with the already described Fancd2-/- mouse. Our results show epistatic roles with FANCD2 on one hand, and independent functions of FANCI during gametogenesis on the other hand. To conclude, this thesis brings a strong and new mouse model to study Fanconi Anemia and more specifically the roles of FANCI. It also gives some physiological proofs that FANCI can act independently of the ID2 complex, which could slightly nuance the actual molecular pathway.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie récessive rare associée à un défaut dans la voie de réparation des cassures double-brin de l’ADN causées par des agents pontants (voie de l’AF). Ces agents pontant l’ADN créent un lien covalent entre les deux brins et bloquent les polymérases lors de la réplication ou de la transcription. Mon projet s’intéresse à une protéine importante de la voie de l’AF : FANCI. Celle-ci est décrite comme agissant de pair avec la protéine FANCD2 pour recruter la machinerie de réparation de l’ADN. Nous posons l’hypothèse que FANCI a un rôle important lors du développement, lors de la méiose et est impliquée dans la résistance des cellules aux aldéhydes. Suite à la création d’un modèle murin déplété en FANCI, nous avons effectué des essais comportementaux de mémoire ou d’anxiété pour caractériser le modèle plus en profondeur. Ensuite, des résultats de coupes histologiques de gonades ont mené à la confirmation de la stérilité des souris KO. Plus spécifiquement, un étalage de chromosomes méiotiques et une immunofluorescence ont été effectués pour vérifier la localisation de FANCI sur ces derniers. De plus, le traitement à la mitomycine C (agent pontant) de cellules embryoniques conférant une instabilité génomique, nous avons voulu tester l’effet d’une source endogène, les aldéhydes, sur des cellules déplétées en FANCI. Nous avons observé les foyers des protéines 53BP1 et γ-H2AX pour vérifier l’accumulation de cassures double-brin. Les essais comportementaux montrent une tendance non significative. Une co-localisation de FANCI avec le marqueur de résection RPA est observée. De plus, la déplétion de FANCI rend les cellules résistantes aux aldéhydes. Les foyers 53BP1 et γ-H2AX montrent qu’une petite population de ces mêmes cellules a un nombre très élevé de dommages à l’ADN alors que d’autres ont un niveau de dommages similaire au contrôle. / Fanconi anemia (FA) is a rare recessive disease associated with a defect in the pathway of DNA double strand breaks repair (FA pathway). These double stranded breaks are caused by crosslinking agents by creating a covalent bond between the two opposite strands and blocking polymerases during DNA replication or transcription. My project’s principal interest is a major protein it this pathway : the FANCI protein. It is described as acting together with FANCD2 protein to recruit DNA repair machinery. We hypothesised that FANCI has an important role in development, in meiosis and that it is implicated in cells’ aldehydes resistance. After the creation of a mouse model depleted in FANCI, with did anxiety and memory behavior tests to deeply characterize our mouse model. Also, results of gonad histologic cuts confirmed mouse sterility. More specifically, we did a meiotic spread and immunofluorescence to see FANCI on meiotic chromosomes. We also treated embryonic fibroblasts with mitomycin C, an exogenous crosslinking agent, and then wanted to check with an endogenous source, like aldehydes, on FANCI depleted human cells. We also observed 53BP1 and γ-H2AX foci formation to check for double strand break accumulation. Behavior tests do not show any significative tendancy. We observe a colocalization between FANCI and the resection marker RPA. Moreover, FANCI depletion gives an aldehyde resistance to cells. 53BP1 and γ-H2AX foci show a population of cells with a very high level of foci and others that have the same amount of foci as the control cells.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie congénitale rare résultant d’une mutation sur chaque allèle parental d’un gène FANC. Nous avons récemment identifié un variant d'épissage de FANCL contenant une exclusion de l'exon 4. Une analyse par minigène nous a permis de démontrer que le polymorphisme de séquence (SNP) rs7958831 augmente substantiellement le saut de l'exon 4 de FANCL, et que les porteurs de ce SNP ont une quantité significativement plus élevée de transcrits FANCL∆4. L'étude de fractions ribosomales nous a permis de confirmer que le transcrit alternatif est bel et bien traduit en protéine. Toutefois, une protéine de fusion FANCL∆4-GFP ne migre pas au noyau comme le fait FANCLwt-GFP. L'isoforme FANCL∆4 n'est pas en mesure d'accomplir la fonction principale de FANCL, soit de monoubiquitiner FANCD2. De plus, des cellules EUFA868 déficientes en FANCL complémentées avec FANCL∆4 ne retrouvent pas leur phénotype normal en test de survie et ont une proportion plus importante bloquée en phase G2/M. Ces résultats nous permettent de penser que le SNP rs7958831 pourrait moduler le risque de cancer du sein puisque l'isoforme FANCL∆4 ne semble pas fonctionnelle.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique récessive caractérisée par des anomalies congénitales, une défaillance progressive de la moelle osseuse, une hypersensibilité aux pontages inter-brins de l’ADN (ICLs) et une susceptibilité à développer le cancer. La voie AF implique au minimum 20 gènes FANC (FANCA-FANCU) et les protéines encodées par ces gènes interagissent également dans une voie cellulaire connue permettant la résistance des cellules aux ICLs de l’ADN. Les agents pontants qui génèrent les ICLs lient de manière covalente les deux brins de l’ADN, créant de ce fait une obstruction physique aux processus cellulaires qui nécessitent le déroulement des deux brins d’ADN tels que la réplication de l’ADN et la transcription. La monoubiquitination de FANCI et FANCD2 par la E3 ubiquitine ligase FANCL est l’évènement culminant de l’activation de la voie AF. Ce processus est dépendant des protéines FANC ayant un rôle en amont de cette étape. Le complexe moléculaire formé par FANCI et FANCD2 coordonne plusieurs événements de la voie AF à la suite de sa monoubiquitination. Tout au long de mon travail de doctorat, nous avons étudié différents aspects de la voie de l’anémie de Fanconi. Nous avons montré deux importants domaines de liaison à l’ADN dans FANCD2 dans lesquels se trouvent six acides aminés polaires, principalement des résidus lysines, très conservés à travers l’évolution. Ces domaines contribuent de manière importante à la liaison à l’ADN dépendante des charges spécifiques. Un de ces domaines de liaison à l’ADN s’avère être également une séquence de localisation nucléaire (NLS) dont la mutation empêche la localisation nucléaire de FANCD2. Les mutants cytoplasmiques de FANCD2 ont aboli leur monoubiquitination et furent incapables de promouvoir la monoubiquitination de FANCI, de même que l’association à la chromatine. Lorsque les défauts de transport nucléaire sont complémentés par un NLS hétérologue, il en résulte une réduction de la monoubiquitination de FANCD2. Ainsi, nos résultats suggèrent que le domaine de liaison à l’ADN et le NLS identifiés dans cette étude soient des régions cruciales de FANCD2. Les cassures double-brins de l’ADN (CDB) sont un autre aspect de la voie de AF qui a fait l’objet de nos études. Les CDB sont des structures intermédiaires formées au moment du décrochage (« unhooking ») du pont inter-brin lors du processus de résolution des ICLs. Nous avons attribué de nouvelles fonctions pour la protéine FANCG dans l’inhibition de la résection des extrémités d’ADN générées par la CDB, affectant ainsi le choix de la voie de réparation de l’ADN. Cette fonction de FANCG est indépendante des autres protéines FANC ayant un rôle en amont, à l’exception de la protéine FANCA. Nous avons également mis en lumière de nouvelles fonctions pour les protéines AF/cancer du sein BRCA2 et PALB2 aux fourches de réplication bloquées. Puis, nous avons également montré qu’un rôle pour ces protéines consiste en la stimulation de la polymérase eta (Polη) afin d’initier la synthèse de l’ADN. En effet, BRCA2 et PALB2 interagissent avec Polη et sont requises pour le recrutement de cette polymérase aux fourches de réplication bloquées. De plus, elles stimulent la synthèse d’ADN dans la D-Loop via la stimulation de la Polη, un élément essentiel à ce processus. Nous concluons donc que PALB2 et BRCA2, en plus de leurs fonctions dans la stimulation de la formation de la D-Loop par RAD51, jouent un rôle crucial dans la synthèse d’ADN associée à la recombinaison via la réparation de l’ADN régulée par la Polη. / Fanconi anemia (FA) is a recessive genetic disorder characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, DNA interstrand cross-links (ICLs) hypersensitivity, and cancer susceptibility. The FA pathway consists of at least 20 FANC genes (FANCA-FANCU), and the encoded protein products interact in a common cellular pathway to gain resistance against DNA ICLs. The ICL-producing agents covalently cross-link two DNA strands and thus, are obstructions to processes which requires unwinding of the two DNA strands such as DNA replication, and transcription. FA pathway activation culminates in the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI proteins by E3 ubiquitin ligase FANCL, a process dependent on other upstream FA proteins. The molecular complex formed by FANCI and FANCD2 coordinates multiple events in the FA pathway upon its monoubiquitination. Throughout my doctoral work, we studied various aspects of the FA pathway. We have demonstrated two major DNA binding motifs (DBMs) in FANCD2, comprising of six evolutionally conserved polar amino acids predominantly consisting of lysine, which contributed to the specific charge dependent DNA binding. One of the DBM also consisted of a nuclear localization sequence (NLS), disruption of which abrogated the nuclear localization of FANCD2. The cytoplasmic mutants of FANCD2 had abolished monoubiquitination and were unable to promote FANCI monoubiquitination and chromatin association. Complementation of the nuclear transport defect by a heterologous NLS resulted in the reduction of FANCD2 monoubiquitination. Our results suggest that the DNA binding and NLS identified in this study are crucial regions of FANCD2. DNA double-strand breaks (DSB) are produced as one of the structural intermediates upon ICL unhooking step. We assigned novel functions to the FA protein FANCG in limiting the DNA end-resection, and thus it affects the repair pathway choice. This function of FANCG is independent of other upstream FA proteins except FANCA. We also reveal new functions for FA/breast cancer proteins BRCA2 and PALB2 at blocked replication forks and show a role for these proteins in stimulating polymerase eta (Polη) to initiate DNA synthesis. PALB2 and BRCA2 interact with Polη, and are required to sustain the recruitment of Polη at blocked replication forks. PALB2 and BRCA2 stimulate Polη-dependent DNA synthesis on Displacement loop (D-loop) substrates. We conclude that PALB2 and BRCA2, in addition to their functions in stimulating D-loop formation by RAD51, play crucial roles in the initiation of recombination-associated DNA synthesis by Polη-mediated DNA repair.