L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie multigénique récessive rare qui atteint les enfants en bas âge. Plusieurs protéines FA forment un complexe nucléaire essentiel à l'activité de la voie de l'anémie de Fanconi au cours des mécanismes de réparation de l'ADN et d'apoptose ainsi qu'au cours du cycle cellulaire et du développement. Les patients FA présentent tous une pancytopénie qui résulte du non renouvellement des cellules souches de la moelle osseuse et sont souvent atteints de malformations congénitales. Malgré les récentes avancées sur la compréhension de la dynamique et de la régulation de la voie Fanconi, la fonction de la plupart des protéines FA demeure toujours inconnue. L'objectif principal du projet de recherche était donc d'identifier d'éventuels partenaires biochimiques de la protéine FANCC par un criblage de banque d'ADNc afin de mieux comprendre la fonction des protéines FA dans les divers mécanismes cellulaires. Deux interacteurs potentiels retenus, soit CtBPl et UNC5A, ont été analysés pour leur capacité à interagir ou colocaliser avec d'autres protéines Fanconi par double hybride dans la levure, par coimmunoprécipitation et par immunofluorescence. Il a été montré que CtBPl interagit avec le complexe Fanconi et que UNC5A interagit avec la protéine FANCC. Aussi, l'activation de la voie Wnt induit une translocation nucléaire et une colocalisation des protéines F ANC A, FANCC et CtBPl. L'interaction directe entre le corépresseur CtBPl et le complexe FA suggère un rôle de la voie Fanconi dans les mécanismes de développement par le biais de la voie de développement Wnt. D'autres analyses sont nécessaires pour postuler sur l'implication de la protéine UNC5A dans l'anémie de Fanconi.

L'anémie de Fanconi (FA) est caractérisée par une aplasie médullaire, un risque accru de développer des cancers, ainsi que plusieurs types de malformations congénitales. La voie de NOTCH1 est impliquée dans l'embryogenèse et le maintien des cellules souches hématopoïétiques (HSC), qui sont déréglés chez les patients FA. Puisque les voies signalétiques de l'anémie de Fanconi et de NOTCH1 jouent un rôle essentiel dans l'hématopoïèse et le développement, nous avons étudié les liens qui existent entre les protéines FA et Hairy Enhancer of Split 1 (HES1), un effecteur de la voie de NOTCH1. Nous avons montré une interaction entre l'effecteur HES1 et le complexe FA, nécessaire à l'intégrité de la voie de l'anémie de Fanconi. Nos résultats indiquent également que la protéine HES1, en plus d'être un partenaire du complexe FA, est une cible de son activité E3 ubiquitine ligase. De plus, nous avons montré que le complexe FA est un co-régulateur de l'expression génique des cibles de l'effecteur HES1, en bloquant la formation du complexe de répression transcriptionnelle HESl-TLE/Gro. Finalement, l'étude fonctionnelle de l'interaction du complexe FA avec HES1 nous a permis de comprendre l'inter-relation qui existe entre les voies signalétiques de l'anémie de Fanconi et de NOTCH1, par le biais de l'effecteur HES1.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare se manifestant par des troubles développementaux, sanguins, et une prédisposition à certains cancers. Les cellules de patients montrent une sensibilité élevée aux agents causant des ponts interbrins dans l'ADN, dont la réparation implique l'activation de la recombinaison homologue. La présence de PALB2, mutée dans l'anémie de Fanconi, est nécessaire pour la localisation chromatinienne de BRCA2 et RAD51, en réponse aux dommages à l'ADN. Comme BRCA2, PALB2 est un gène de prédisposition au cancer du sein. Il devient important de mieux comprendre le rôle de PALB2/FANCN dans la recombinaison homologue. Nous avons entrepris la caractérisation de l'activité biochimique de PALB2 en la purifiant, de même qu'un mutant associé au cancer du sein, PALB2Q775X, afin de clarifier son rôle dans la réparation de l'ADN. Les données obtenues suggèrent que PALB2 possède les caractéristiques d'un médiateur de la recombinaison homologue, ce qui en fait une cible privilégiée dans le développement de thérapies anticancéreuses dans le futur.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie infantile multigénique et complexe. Les enfants atteints d’AF souffrent d’une insuffisance médullaire progressive potentiellement mortelle. En plus du phénotype hématologique, les enfants souffrant d’AF présentent de nombreuses malformations congénitales incluant le système nerveux central et une prédisposition accrue aux cancers particulièrement de type leucémique. Plusieurs gènes associés à la maladie ont été identifiés mais leur fonction dans l’étiologie de la maladie demeure inconnue. La présence d’une mutation dans l’un des gènes Fanconi entraine une perte progressive des cellules souches hématopoïétiques (CSH) menant à un épuisement médullaire et favorisant l’apparition de leucémies. Les protéines Fanconi forment trois complexes protéiques distincts qui participent de manière séquentielle dans une voie de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN. La protéine Fanconi Anemia de groupe C, ou FANCC, est une composante du complexe majeur de cette voie Fanconi. Outre son rôle dans la voie Fanconi et dans les mécanismes de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN, FANCC est connue pour son implication dans la mort cellulaire programmée, la détoxification des radicaux oxygénés et la réponse aux cytokines. Afin d’identifier la fonction de la protéine FANCC dans les mécanismes de développement, nous avons procédé à un criblage d’une banque d’ADNc et identifié certains partenaires biochimiques de FANCC tel le récepteur de la Netrine-1, uncoordinated-5A (UNC5A). Puisque le récepteur UNC5A a une fonction de signal de survie cellulaire et est impliqué dans les mécanismes de croissance neuronale, nous avons étudié le rôle de l’interaction FANCC-UNC5A dans les mécanismes de différenciation neuronale. Nos résultats indiquent que FANCC régule la fonction pro-apoptotique de UNC5A. Lorsque FANCC est surexprimée, les cellules retardent leur entrée en apoptose tandis qu’en absence de FANCC, UNC5A favorise l’entrée en apoptose. De plus, nos résultats indiquent que FANCC conjointement à UNC5A promeut la neurogénèse; FANCC et UNC5A colocalisent dans les neurites cellulaires. Globalement, nos résultats suggèrent que FANCC par le biais de UNC5A joue un rôle important dans la mort cellulaire et la croissance axonale. Ainsi, une dérégulation de l’interaction FANCC-UNC5A chez les patients souffrent de FA pourrait expliquer certains aspects cliniques notamment les anomalies de développement. / Fanconi anemia (FA) is a recessive syndrome characterized by diverse clinical symptoms including progressive bone marrow failure, various congenital abnormalities, chromosomal instability and predisposition to malignancies. Studies of the canonical FA pathway have focused on the mechanism of repair of DNA cross-linking damage. However, some data suggest that FA proteins may have other functions besides DNA damage signaling events, and these functions may explain some of the disease phenotypes such as defects in hematopoiesis and congenital malformations. For instance, FANCC, which is predominantly located in the cytoplasm, has multifunctional roles and is an anti-apoptotic regulator. In addition to its function as a repulsive mediator in neural development, UNC5A, the receptor for the axon guidance molecule Netrin-1, has also been proposed to be a “dependence receptor” that triggers apoptosis in the absence of its ligand. Here, we identified a novel interaction of UNC5A with FANCC and showed that FANCC positively regulates UNC5A-mediated apoptosis. Under conditions of FANCC overexpression, apoptosis is decreased, whereas the absence of a functional FANCC protein increases UNC5A-mediated apoptosis. Furthermore, FANCC and UNC5A function as a complex in neurogenesis; they co-localize at synapses formed by neurites, and FANCC is required for the promotion of neuronal outgrowth by UNC5A. Based on these findings, we propose that FANCC plays a key role in tissue morphogenesis by either delaying UNC5A-mediated apoptosis or positively impacting the expression of UNC5A. Under FANCC-deficient conditions, dysregulation of the UNC5A signal pathway can lead to developmental defects such as those seen in FA patients.

L'anémie de Fanconi (AF) est une pathologie génétique rare (1/350 000 naissances), transmise selon le mode récessif. Son tableau clinique regroupe de nombreuses malformations congénitales, une aplasie médullaire, une pancytopénie et une prédisposition accrue aux cancers. Au plan cellulaire, une mutation sur l'un des treize gènes Fanconi suffit à induire une instabilité chromosomique et une hypersensibilité aux agents pontant l'ADN. La perte de fonction des protéines Fanconi est probablement responsable du défaut d'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de l'état pro-apoptotique des progéniteurs médullaires. Les principaux traitements ont une très faible efficacité et induisent de dangereuses complications (toxicité, leucémies). La thérapie génique qui consiste à introduire ex vivo dans les CSH, une copie fonctionnelle du gène Fanconi altéré, apparaît ici comme le traitement alternatif le plus prometteur. Les premiers travaux effectués dans le laboratoire et confirmés pas d'autres, ont montré que la correction génique ex vivo est néfaste pour les CSH Fanconi. Une nouvelle approche thérapeutique a été mise en place, consistant à introduire la copie fonctionnelle du gène altéré directement in vivo, par injection intra-fémorale (IIF). Cette technique novatrice permet de délivrer le gène dans le milieu natif des CSH, leur évitant le stress induit par la culture. Après l'IIF de virions porteurs du gène EGFP (enhanced green fluorescent protein), des analyses sanguines mensuelles montrent une augmentation régulière de la fluorescence, confirmant l'efficacité technique du transfert génique in vivo. L'étape suivante consistait en l'injection du gène correcteur FancC, en fusion avec le marqueur EGFP (FancC-EGFP), dans des souris FancC-/-, FancA-/- et sauvages. L'expression sanguine de la protéine FANCC-EGFP confirme la transduction de cellules médullaires. L'efficacité de correction est évaluée lors de tests de survie des souris aux injections intra-péritonéales d'un agent pontant l'ADN : la mitomycine-C (MMC), sur une période de quinze semaines. Ce traitement vise à évaluer l'effet correcteur de la transduction et la fonctionnalité de la protéine transgénique, seules les cellules corrigées seront en mesure de restaurer l'intégrité de leur ADN et de proliférer. La nature des cellules corrigées a été analysée au cours de transplantations successives. Les résultats démontrent que les CSH FancC-/- recouvrent, après correction in vivo, par le transgène FancC-EGFP, une fonctionnalité semblable à celle des sauvages. Les résultats préliminaires obtenus dans le modèle murin aplasique confirment l'efficacité de la correction génique et sont particulièrement encourageants puisqu'ils permettent d'envisager l'IIF comme une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l'AF.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une insuffisance médullaire, des malformations congénitales et une prédisposition accrue au développement de cancers. Aujourd’hui, 16 protéines sont identifiées pour coopérer ensemble dans la voie métabolique de Fanconi, impliquées principalement dans la réparation de l’ADN. Pour mieux comprendre le rôle des protéines Fanconi dans d’autres mécanismes cellulaires, un criblage en double hybride a été réalisé au laboratoire afin d’identifier plusieurs nouveaux partenaires protéiques d’intérêt. La protéine associée aux microtubules, la stathmine (STMN) a ainsi été identifiée comme un nouveau partenaire potentiel de la protéine Fanconi C (FANCC). L’étude de l’interaction a confirmé un lien direct entre FANCC et STMN et révèle qu’une mutation ponctuelle, ou une délétion de l’exon 1 de FANCC, cause une perte de cette interaction. Afin d’éclaircir la fonction du complexe FANCC-STMN, nous avons étudié la localisation des protéines durant le cycle cellulaire par immunofluorescence. Les résultats ont permis de mettre en évidence une localisation commune de FANCC et STMN dans les centrosomes de cellules en mitose. Une variation de l’état de phosphorylation de STMN dans les centrosomes a été observée dans plusieurs lignées cellulaires de patients. Ainsi, les protéines FANC semblent participer à la régulation de l’état de phosphorylation de STMN durant la progression du cycle cellulaire. Pour finir, les cellules de patients FA présentent de nombreuses malformations mitotiques, tels qu’un nombre important de centrosomes surnuméraire et un fuseau mitotique de petites tailles. Notre étude a permis de montrer que la protéine FANCC participe à la régulation de l’état de phosphorylation de STMN durant la division cellulaire, via une interaction directe. Nos résultats suggèrent également que les protéines FANC semblent participer à la progression du cycle cellulaire, en régulant de manière indirecte l’activité de STMN. Puisque la dérégulation de STMN est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse, une augmentation de l’activité de STMN dans les cellules FA semble expliquer la sensibilité des patients à développer différents types de cancer et représente une nouvelle cible prometteuse pour le traitement des cancers chez les patients FA. / The Fanconi Anemia (FA) is a genetic recessive disease characterized by a bone marrow failure, various congenital malformations, and predispose to the development of cancers. Currently, 16 proteins are identified to cooperate together in Fanconi pathway, known mainly to play a role in DNA reparation. For better understanding the involvement of Fanconi proteins in other cellular mechanisms and to identify new partners of interest, a double hybrid screen had been realized at the laboratory. The microtubule-associated protein, the stathmin (STMN), had been identified as a new potential protein partner of the Fanconi protein C (FANCC). Our study has confirmed a direct interaction between FANCC and STMN proteins, and identified that a punctually mutation or exon 1 deletion in FANCC induced a loss of this interaction. In order to clarify the function of the FANCC-STMN complex, we have study the localization of these proteins during the cell cycle by immunofluorescence experiments. These results have unveiled a co-localization of FANCC and STMN proteins in the centrosome of cells in mitosis. A decrease of STMN phosphorylation in the centrosome had been observed in fibroblast cells of FA patients. So, the FANC protein seems to be involved in the regulation of STMN phosphorylation during the cell cycle progression. Finally, the cells from FA patients display many mitotic spindle abnormities, such as an elevated number of supernumerary centrosomes and a decrease of mitotic spindle sizes. Our study demonstrates that the FANCC protein is involved in the regulation of STMN phosphorylation during the cell division. Our results suggest also that the FANC protein seems participate in the cell cycle progression. Knowing that the STMN deregulation is involved in the carcinogenesis, an increase of STMN activity in the FA cells seems explain the sensibility of patients to develop various cancers. The STMN protein represents a possible therapeutic target to cancer treatment of FA patients.

L'anémie de Fanconi (AF), causée par les mutations de 22 gènes de l'AF (FANCA-FANCW), est une maladie rare associée à une instabilité du génome. Cette maladie est caractérisée par un large éventail de phénotypes cliniques, notamment des anomalies congénitales, une insuffisance progressive de la moelle osseuse, une susceptibilité au cancer, ainsi qu'une hypersensibilité aux agents causant des pontages inter-brins (ICLs) de l'ADN. Plusieurs modèles de souris ont été produits pour étudier l'AF. Cependant, la manifestation la plus répandue chez les patients AF, soit l'insuffisance médullaire progressive, est à peine retrouvée dans ces modèles. Le formaldéhyde, l'aldéhyde le plus simple, existe dans l'environnement et dans nos corps. En fait, nos corps libèrent une concentration relativement élevée de formaldéhyde. Le formaldéhyde peut entraîner des ICLs et des pontages ADN-protéine (DPCs), qui nuisent à la stabilité du génome. Des modèles de souris ont été créés afin d'identifier si une augmentation du niveau de formaldéhyde contribuait à une insuffisance médullaire ou une leucémie comme chez les patients AF. Les souris portant une double inactivation *Fancd2$^\textup{-/-}$ Aldh2$^\textup{-/-}$* ainsi que *Fancd2$^\textup{-/-}$ Adh5$^\textup{-/-}$*, permettant l'accumulation d'aldéhydes, ont mis en lumière l'importance potentielle des aldéhydes, en particulier le formaldéhyde, sur l'apparition de l'AF. Le principal objectif de mon doctorat est d'étudier le mécanisme de réponse cellulaire aux dommages de l'ADN induits par le formaldéhyde en essayant d'identifier une cible thérapeutique potentielle pour les patients atteints d'AF. Afin d'identifier tous les gènes susceptibles d'être impliqués dans la réponse aux dommages de l'ADN induits par le formaldéhyde, nous avons effectué un criblage CRISPR-Cas9 à l'aide de la librairie TKOv1 qui cible plus de 17000 gènes humains. Nous avons identifié plusieurs gènes appartenant soit à la voie AF, à la voie de réparation par excision des nucléotides (NER) ou à la voie du métabolisme du formaldéhyde, qui sont capable d'enrayer les dommages induits par le formaldéhyde confirmant la validité de notre criblage. Fait intéressant, l'exonucléase 1 (EXO1), une nucléase qui participe à la fois aux processus réplicatifs et post-réplicatifs, s'est avérée une cible majeure. Nous avons donc caractérisé les rôles d'EXO1 dans la réponse aux dommages à l'ADN induits par le formaldéhyde tant au niveau des ICLs que DPCs. Nous avons effectué un deuxième criblage CRISPR-Cas9 en utilisant la librairie TKOv3 qui cible environ 18000 gènes dans les lignées cellulaires déficientes en FANCA. Notre objectif pour le deuxième crible est d'identifier les gènes qui pourraient devenir des cibles de traitement thérapeutique. L'inactivation de ces gènes ou l'inhibition des protéines correspondantes pourraient aider les cellules AF ou les patients AF à mieux survivre une exposition au formaldéhyde. Nous validons et caractérisons actuellement les candidats probables de ce ciblage. En résumé, cette thèse élucide le rôle d'EXO1 dans les dommages induits par le formaldéhyde et identifie des cibles diagnostiques et thérapeutiques potentielles pour les patients AF. / Fanconi anemia (FA), caused by the mutations of 22 FA genes (FANCA-FANCW), is a rare, genome instability associated disease. FA is characterized by a wide range of clinical phenotypes including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, cancer susceptibility and hypersensitivity to DNA inter-strand crosslinks (ICLs). Several mouse models have been produced to study FA. However, progressive bone marrow failure, the most prevalent manifestation in FA patients, is hardly recaptured in FA mouse models. Formaldehyde, the simplest aldehyde, exists in the environment and in our bodies. In fact, our bodies release a relatively high concentration of formaldehyde. Formaldehyde can cause ICLs and DNA-protein crosslinks (DPCs), which impair genome stability. Mouse models have been created in order to identify whether increased formaldehyde levels contribute to bone marrow failure or leukemia as in FA patients. *Fancd2$^\textup{-/-}$ Aldh2$^\textup{-/-}$* as well as *Fancd2$^\textup{-/-}$ Adh5$^\textup{-/-}$* double inactivation mouse models allowing for aldehyde accumulation highlighted the potential importance of aldehydes, in particular formaldehyde, on the development of FA. The main objective of my Ph.D. is to study the mechanism of cellular response to formaldehyde-induced DNA damage to identify a potential therapeutic target for FA patients. To gain insights into deciphering which genes may be involved in responding to formaldehyde-induced DNA damage, we carried out a CRISPR-Cas9 screen using the TKOv1 library that targets more than 17000 genes. Our results were validated by the identification of several genes that belong to the FA pathway, the nucleotide excision repair (NER) pathway, or the formaldehyde metabolism pathway, which have been shown to cope with formaldehyde-induced damages or formaldehyde directly. Interestingly, exonuclease 1 (EXO1), a nuclease that participates in both replicative and post-replicative processes, was found to be a major target. Therefore, we characterized the roles of EXO1 in response to formaldehyde-induced DNA damage in both ICLs and DPCs. We also performed a second CRISPR-Cas9 screen using the TKOv3 library targeting around 18000 genes in FANCA-deficient cell lines. Our aim for the second screen is to identify genes that could become actionable therapeutic targets. The knockout of these genes or the inhibition of corresponding proteins could help FA cells or FA patients survive better under the exposure to formaldehyde. We are currently validating and characterizing the possible candidates. In summary, this thesis elucidates the role of EXO1 in formaldehyde-induced DNA damage and identifies potential diagnostic and therapeutic targets for FA patients.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie congénitale rare résultant d’une mutation sur chaque allèle parental d’un gène FANC. Nous avons récemment identifié un variant d'épissage de FANCL contenant une exclusion de l'exon 4. Une analyse par minigène nous a permis de démontrer que le polymorphisme de séquence (SNP) rs7958831 augmente substantiellement le saut de l'exon 4 de FANCL, et que les porteurs de ce SNP ont une quantité significativement plus élevée de transcrits FANCL∆4. L'étude de fractions ribosomales nous a permis de confirmer que le transcrit alternatif est bel et bien traduit en protéine. Toutefois, une protéine de fusion FANCL∆4-GFP ne migre pas au noyau comme le fait FANCLwt-GFP. L'isoforme FANCL∆4 n'est pas en mesure d'accomplir la fonction principale de FANCL, soit de monoubiquitiner FANCD2. De plus, des cellules EUFA868 déficientes en FANCL complémentées avec FANCL∆4 ne retrouvent pas leur phénotype normal en test de survie et ont une proportion plus importante bloquée en phase G2/M. Ces résultats nous permettent de penser que le SNP rs7958831 pourrait moduler le risque de cancer du sein puisque l'isoforme FANCL∆4 ne semble pas fonctionnelle.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique récessive caractérisée par des anomalies congénitales, une défaillance progressive de la moelle osseuse, une hypersensibilité aux pontages inter-brins de l’ADN (ICLs) et une susceptibilité à développer le cancer. La voie AF implique au minimum 20 gènes FANC (FANCA-FANCU) et les protéines encodées par ces gènes interagissent également dans une voie cellulaire connue permettant la résistance des cellules aux ICLs de l’ADN. Les agents pontants qui génèrent les ICLs lient de manière covalente les deux brins de l’ADN, créant de ce fait une obstruction physique aux processus cellulaires qui nécessitent le déroulement des deux brins d’ADN tels que la réplication de l’ADN et la transcription. La monoubiquitination de FANCI et FANCD2 par la E3 ubiquitine ligase FANCL est l’évènement culminant de l’activation de la voie AF. Ce processus est dépendant des protéines FANC ayant un rôle en amont de cette étape. Le complexe moléculaire formé par FANCI et FANCD2 coordonne plusieurs événements de la voie AF à la suite de sa monoubiquitination. Tout au long de mon travail de doctorat, nous avons étudié différents aspects de la voie de l’anémie de Fanconi. Nous avons montré deux importants domaines de liaison à l’ADN dans FANCD2 dans lesquels se trouvent six acides aminés polaires, principalement des résidus lysines, très conservés à travers l’évolution. Ces domaines contribuent de manière importante à la liaison à l’ADN dépendante des charges spécifiques. Un de ces domaines de liaison à l’ADN s’avère être également une séquence de localisation nucléaire (NLS) dont la mutation empêche la localisation nucléaire de FANCD2. Les mutants cytoplasmiques de FANCD2 ont aboli leur monoubiquitination et furent incapables de promouvoir la monoubiquitination de FANCI, de même que l’association à la chromatine. Lorsque les défauts de transport nucléaire sont complémentés par un NLS hétérologue, il en résulte une réduction de la monoubiquitination de FANCD2. Ainsi, nos résultats suggèrent que le domaine de liaison à l’ADN et le NLS identifiés dans cette étude soient des régions cruciales de FANCD2. Les cassures double-brins de l’ADN (CDB) sont un autre aspect de la voie de AF qui a fait l’objet de nos études. Les CDB sont des structures intermédiaires formées au moment du décrochage (« unhooking ») du pont inter-brin lors du processus de résolution des ICLs. Nous avons attribué de nouvelles fonctions pour la protéine FANCG dans l’inhibition de la résection des extrémités d’ADN générées par la CDB, affectant ainsi le choix de la voie de réparation de l’ADN. Cette fonction de FANCG est indépendante des autres protéines FANC ayant un rôle en amont, à l’exception de la protéine FANCA. Nous avons également mis en lumière de nouvelles fonctions pour les protéines AF/cancer du sein BRCA2 et PALB2 aux fourches de réplication bloquées. Puis, nous avons également montré qu’un rôle pour ces protéines consiste en la stimulation de la polymérase eta (Polη) afin d’initier la synthèse de l’ADN. En effet, BRCA2 et PALB2 interagissent avec Polη et sont requises pour le recrutement de cette polymérase aux fourches de réplication bloquées. De plus, elles stimulent la synthèse d’ADN dans la D-Loop via la stimulation de la Polη, un élément essentiel à ce processus. Nous concluons donc que PALB2 et BRCA2, en plus de leurs fonctions dans la stimulation de la formation de la D-Loop par RAD51, jouent un rôle crucial dans la synthèse d’ADN associée à la recombinaison via la réparation de l’ADN régulée par la Polη. / Fanconi anemia (FA) is a recessive genetic disorder characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, DNA interstrand cross-links (ICLs) hypersensitivity, and cancer susceptibility. The FA pathway consists of at least 20 FANC genes (FANCA-FANCU), and the encoded protein products interact in a common cellular pathway to gain resistance against DNA ICLs. The ICL-producing agents covalently cross-link two DNA strands and thus, are obstructions to processes which requires unwinding of the two DNA strands such as DNA replication, and transcription. FA pathway activation culminates in the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI proteins by E3 ubiquitin ligase FANCL, a process dependent on other upstream FA proteins. The molecular complex formed by FANCI and FANCD2 coordinates multiple events in the FA pathway upon its monoubiquitination. Throughout my doctoral work, we studied various aspects of the FA pathway. We have demonstrated two major DNA binding motifs (DBMs) in FANCD2, comprising of six evolutionally conserved polar amino acids predominantly consisting of lysine, which contributed to the specific charge dependent DNA binding. One of the DBM also consisted of a nuclear localization sequence (NLS), disruption of which abrogated the nuclear localization of FANCD2. The cytoplasmic mutants of FANCD2 had abolished monoubiquitination and were unable to promote FANCI monoubiquitination and chromatin association. Complementation of the nuclear transport defect by a heterologous NLS resulted in the reduction of FANCD2 monoubiquitination. Our results suggest that the DNA binding and NLS identified in this study are crucial regions of FANCD2. DNA double-strand breaks (DSB) are produced as one of the structural intermediates upon ICL unhooking step. We assigned novel functions to the FA protein FANCG in limiting the DNA end-resection, and thus it affects the repair pathway choice. This function of FANCG is independent of other upstream FA proteins except FANCA. We also reveal new functions for FA/breast cancer proteins BRCA2 and PALB2 at blocked replication forks and show a role for these proteins in stimulating polymerase eta (Polη) to initiate DNA synthesis. PALB2 and BRCA2 interact with Polη, and are required to sustain the recruitment of Polη at blocked replication forks. PALB2 and BRCA2 stimulate Polη-dependent DNA synthesis on Displacement loop (D-loop) substrates. We conclude that PALB2 and BRCA2, in addition to their functions in stimulating D-loop formation by RAD51, play crucial roles in the initiation of recombination-associated DNA synthesis by Polη-mediated DNA repair.

L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie rare et les patients présentent des malformations congénitales, des problèmes hématologiques et une prédisposition à certains cancers. Jusqu'à maintenant, 13 protéines FA ont été identifiées, dont 8 (FANC- A, B, C, E, F, G, L, M) s'associent pour former un complexe qui permet l'ubiquitination de FANCD2 et FANCI. Les autres protéines FA sont impliquées au niveau de la réparation de l'ADN ce qui ne permet pas d'expliquer en totalité le phénotype des patients. Récemment, HES1, effecteur de la voie de Notch, a été identifié comme un partenaire essentiel à la formation du complexe FA. HES1 est connue pour être impliquée dans le développement et l'hématopoïèse. L'interaction d'HES1 avec le complexe FA altérée pourrait expliquer en partie le phénotype des patients. L'objectif principal est de créer un peptide inhibiteur visant à altérer la liaison d'HES1 avec le complexe FA, sans toutefois modifier les autres fonctions d'HES1 dans la cellule. Un deuxième objectif est d'identifier de nouveaux partenaires au complexe FA afin de mieux comprendre le lien génotype-phénotype. L'identification d'un peptide inhibiteur a été réalisée premièrement par la sélection de quatre régions d'HES1 (les acides aminés 90-123, 86-121, 76-111 et 152-190) et deuxièmement par le criblage d'une banque de peptides aléatoires avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²². Le système double hybride en levure a été utilisé pour vérifier les interactions directes entre les peptides et les membres du complexe FA et ces interactions ont été testées dans un modèle cellulaire par la technique de co-immunoprécipitation. L'identification de nouveau partenaire au complexe FA a été réalisée par le criblage d'une banque d'ADNc de moelle osseuse avec FANCE. Le criblage avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²² a permis d'identifier deux peptides, mais leur activité inhibitrice n'a pas été évaluée. Les quatre régions d'HES1 semblent n'avoir aucun effet sur la liaison entre HES1 et le complexe FA. Le criblage de la banque d'ADNc n'a pas permis d'identifier de nouveaux partenaires à FANCE. Des études approfondies sont nécessaires pour confirmer les effets des peptides sur la liaison entre HES1 et le complexe FA.