On compte aujourd’hui plus de 2000 patients dans le monde affectés par l’anémie de Fanconi (AF). Cette maladie rare est causée au niveau cellulaire par un défaut de réparation d’un type très particulier de lésions de l’ADN : les pontages inter-brins (ou ICLs, pour Interstrand CrossLink). Ceux-ci peuvent compromettre la transcription et la réplication, et donc à long terme la survie cellulaire. Pour y faire face, plus d’une vingtaine de protéines sont impliquées dans la voie FA-BRCA, chargée de détecter et d’activer la réparation de ces lésions dangereuses pour la cellule. Au niveau macroscopique, les manifestations de l’AF sont vastes et pas systématiquement présentes, ce qui en complique le diagnostic : pancytonémie, malformations développementales congénitales et prédisposition à certains cancers. Comme la plupart des symptômes ne sont pas spécifiques à l’AF, les enjeux et l’intérêt de son étude deviennent multiples. L’anémie de Fanconi offre un modèle d’étude particulièrement intéressant, qui permet d’explorer des mécanismes aussi variés que la cancérogenèse, l’hématopoïèse, la gamétogenèse et la réparation de l’ADN. Les connaissances sur le mécanisme moléculaire à proprement parler sont grandissantes, même si de nombreuses interrogations persistent. Parmi elles, le rôle précis du complexe ID2, formé des protéines FANCI et FANCD2, reste nébuleux. De plus en plus d’études décrivent des fonctions exclusives à FANCD2, laissant formuler l’hypothèse que la protéine FANCI pourrait elle aussi posséder ses propres rôles. Cependant, les études biochimiques ont certaines limites, comme par exemple l’impossibilité d’étudier in vitro des processus biologiques trop complexes. La création de modèles animaux peut être une solution. Pour répondre aux interrogations portées sur les fonctions de la protéine FANCI, nous avons décidé de caractériser un nouveau modèle murin Fanci-/- et de le comparer à la souris Fancd2-/-, déjà décrite dans la littérature. Nos résultats indiquent d’une part plusieurs rôles épistatiques avec FANCD2 et d’autre part un rôle propre dans le cadre de la gamétogenèse. En conclusion, cette thèse apporte un tout nouveau modèle animal pour étudier l’AF et plus spécifiquement FANCI. Elle apporte aussi les preuves physiologiques d’un rôle de FANCI indépendant au complexe ID2, ce qui viendrait nuancer le mécanisme biochimique actuellement établi. / Nowadays, about 2000 patients have been diagnosed with Fanconi Anemia (FA). At a cellular level, this rare disease is caused by a defect in reparing a specific type of DNA damage: Interstrand CrossLinks (ICLs). Both transcription and replication can be compromised by ICLs, and therefore long term cell survival. The FA-BRCA pathway is in charge of detecting DNA lesions caused by ICLs and activating their repair, and counts now more than twenty proteins. At a macroscopic level, FA diagnosis is complex due to various and not systematic symptoms: pancytonemia, congenital and developmental defects, and cancer predisposition. As most of FA symptoms are not exclusive to the disease, concerns and interests are multiple. As a consequence, Fanconi Anemia represents an interesting model of study, when it comes to work on oncogenesis, hematopoiesis, gametogenesis, and DNA repair. The description of the molecular mechanism is improving, although many questions remain. Among them, the exact role of the ID2 complex, formed by FANCI and FANCD2 proteins, remains nebulous. More and more studies have been describing unique functions for FANCD2, leading to the hypothesis of independent functions for FANCI. As complex physiological processes can not be studied in vitro, creating and studying animal models represents an interesting alternative. In order to answer the questions raised on FANCI functions, we have decided to create and characterize the new Fanci-/- mouse model, with a possible comparison with the already described Fancd2-/- mouse. Our results show epistatic roles with FANCD2 on one hand, and independent functions of FANCI during gametogenesis on the other hand. To conclude, this thesis brings a strong and new mouse model to study Fanconi Anemia and more specifically the roles of FANCI. It also gives some physiological proofs that FANCI can act independently of the ID2 complex, which could slightly nuance the actual molecular pathway.

L'anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique rare. Chez l’homme, toute mutation dans l’une des 22 protéines du complexe de Fanconi entraîne une insuffisance médullaire et une prédisposition au cancer. Cette pathologie est également caractérisée par divers défauts de développement, dont une petite taille et des malformations squelettiques des membres supérieurs et inférieurs. En effet, plus de la moitié des enfants atteints de l’AF ont des anomalies radiales (radial-ray anomalies) couplées à une tendance précoce à l’ostéoporose. Cependant, les mécanismes sous-jacents conduisant à des défauts osseux dans l’AF restent inexpliqués. Notre laboratoire a mis en évidence la surexpression de Dickkopf-1 (DKK1), un inhibiteur de la voie de Wnt, dans le plasma des souris Fanconi. Cette protéine est impliquée dans le développement des membres et l’activité ostéoblastique. De plus, sa surexpression dans le plasma corrèle avec une diminution de la densité minérale osseuse chez les humains. La surexpression de DKK1 pourrait donc refléter une altération du système squelettique chez les souris Fanconi. Ce manuscrit présente le travail que j’ai réalisé dans le laboratoire de Madeleine Carreau au cours de mon doctorat afin de caractériser le développement squelettique embryonnaire des souris Fanconi et déterminer les mécanismes responsables de l'altération du développement et du métabolisme osseux chez les souris adultes. À ces fins, une double coloration à l’alizarine et au bleu Alcian a été réalisée sur des embryons de souris FancC - / -, FancA - / - et de souris de type sauvage E15.5 à 19.5 day post conception (dpc) pour évaluer leur maturation squelettique. Chez les adultes, la structure et le contenu minéral osseux ont été évalués à l’aide d’analyses de micro-computed tomography (μ- CT) sur des tibias provenant de souris FancC - / - et de souris sauvages. Des analyses histomorphométriques ont été effectuées pour évaluer la capacité de formation osseuse des ostéoblastes et la résistance osseuse a été évaluée en utilisant un test de flexion en trois points. De plus, des cultures in vitro ont été réalisées pour évaluer la capacité de différenciation des cellules souches mésenchymateuses et des analyses des transcrits sur des cellules osseuses et de la moelle osseuse ont été réalisées pour identifier les mécanismes moléculaires conduisant à une altération de la physiologie osseuse. Nos résultats montrent que les embryons des souris FancC - / - et FancA - / - présentent une forte diminution de la minéralisation de leur squelette indiquant un développement squelettique anormal chez ces souris. Les souris FancC -/- adultes présentent une diminution de la densité minérale osseuse associée à une diminution de la résistance osseuse chez les mâles. Grâce aux études in vitro, nous avons pu constater que les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse FancC - / - et FancA - / - ont une capacité de différenciation ostéoblastique altérée et présentent un biais de différenciation en faveur de l’adipogenèse. Ces résultats sont associés à l’altération des profils d’expression génique des cellules osseuses. Nos résultats suggèrent que la physiologie osseuse défectueuse dans l’AF survient in utero et résulte éventuellement d’une altération de la fonction des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Ces résultats fournissent, pour la première fois, des informations précieuses sur les mécanismes impliqués dans les défauts de développement dans l’AF. Nos résultats renforcent le lien important entre le comportement des cellules souches hématopoïétiques et l’altération du métabolisme osseux dans cette maladie. De futures études devraient se concentrer sur ce domaine pour mieux comprendre les mécanismes des défauts osseux et espérer un traitement limitant l’altération du tissu osseux dans l’AF. / Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disease. In humans, any mutation in one of the 22 proteins of the Fanconi complex leads to bone marrow failure and cancer predisposition. This pathology is also characterized by various developmental defects including short stature and skeletal malformations of the upper and lower limbs. Indeed, more than half of children affected with FA have radial-ray abnormalities with a tendency to develop early osteoporosis. However, the underlying mechanisms leading to bone defects in FA remains elusive. Previous results from our laboratory showed that Fanconi mice overexpress the Wnt signaling pathway inhibitor Dickkopf-1 (DKK1) in their plasma. This protein is implicated in limb development and osteoblast activity and its overexpression in plasma correlates with a decrease in bone mineral density in humans. Therefore, DKK1 overexpression could reflect an alteration of the skeletal system in Fanconi mice. This manuscript presents the work I achieved in Madeleine Carreau’s lab to characterize the embryonic skeletal development of Fanconi mice and determine the mechanisms leading to altered bone development and metabolism in adult mice. To this aim, alizarin red and Alcian blue double staining was performed on mouse embryos (E15.5 to 19.5 dpc) to evaluate skeletal maturation. In adults, bone structure and mineral content were evaluated using μCT-scan analyses of tibias from FancC-/- and wild-type mice. Histomorphometric analyses were performed to assess bone forming abilities of osteoblasts and bone stiffness was evaluated using three points bending test. In vitro cultures were performed to assess mesenchymal stem cell differentiation ability and q-PCR analysis of bone and marrow cells were performed to identify molecular mechanisms leading to altered bone physiology. Our results show that FancC-/- and FancA-/- embryos have an abnormal skeletal development indicated by a twenty percent decrease of bone mineralization surface. In adults, FancC-/- mice present a decrease in bone mineral density associated with a decrease in male’s bone stiffness. Using in vitro studies, we found that FancC-/- and FancA-/- bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) have reduced osteoblastic differentiation capabilities and favor adipogenesis. Those results were associated with the alteration of bone cells gene expression profiles. Our results suggest that defective bone physiology in FA occurs in utero and possibly results from altered BM-MSCs function. These results provide, for the first time, valuable insights into the mechanisms involved in FA developmental defects. Our results strengthen the important link between hematopoietic stem cells behavior and bone metabolism alteration in this disease. Future studies should focus on this area to better understand the mechanisms of bone defects and hope for targeted treatment for Fanconi Anemia.

L'anémie de Fanconi (AF), causée par les mutations de 22 gènes de l'AF (FANCA-FANCW), est une maladie rare associée à une instabilité du génome. Cette maladie est caractérisée par un large éventail de phénotypes cliniques, notamment des anomalies congénitales, une insuffisance progressive de la moelle osseuse, une susceptibilité au cancer, ainsi qu'une hypersensibilité aux agents causant des pontages inter-brins (ICLs) de l'ADN. Plusieurs modèles de souris ont été produits pour étudier l'AF. Cependant, la manifestation la plus répandue chez les patients AF, soit l'insuffisance médullaire progressive, est à peine retrouvée dans ces modèles. Le formaldéhyde, l'aldéhyde le plus simple, existe dans l'environnement et dans nos corps. En fait, nos corps libèrent une concentration relativement élevée de formaldéhyde. Le formaldéhyde peut entraîner des ICLs et des pontages ADN-protéine (DPCs), qui nuisent à la stabilité du génome. Des modèles de souris ont été créés afin d'identifier si une augmentation du niveau de formaldéhyde contribuait à une insuffisance médullaire ou une leucémie comme chez les patients AF. Les souris portant une double inactivation Fancd2⁻/⁻ Aldh⁻/⁻ainsi que Fancd2⁻/⁻ Adh5⁻/⁻ , permettant l'accumulation d'aldéhydes, ont mis en lumière l'importance potentielle des aldéhydes, en particulier le formaldéhyde, sur l'apparition de l'AF. Le principal objectif de mon doctorat est d'étudier le mécanisme de réponse cellulaire aux dommages de l'ADN induits par le formaldéhyde en essayant d'identifier une cible thérapeutique potentielle pour les patients atteints d'AF. Afin d'identifier tous les gènes susceptibles d'être impliqués dans la réponse aux dommages de l'ADN induits par le formaldéhyde, nous avons effectué un criblage CRISPR-Cas9 à l'aide de la librairie TKOv1 qui cible plus de 17000 gènes humains. Nous avons identifié plusieurs gènes appartenant soit à la voie AF, à la voie de réparation par excision des nucléotides (NER) ou à la voie du métabolisme du formaldéhyde, qui sont capable d'enrayer les dommages induits par le formaldéhyde confirmant la validité de notre criblage. Fait intéressant, l'exonucléase 1 (EXO1), une nucléase qui participe à la fois aux processus réplicatifs et post-réplicatifs, s'est avérée une cible majeure. Nous avons donc caractérisé les rôles d'EXO1 dans la réponse aux dommages à l'ADN induits par le formaldéhyde tant au niveau des ICLs que DPCs. Nous avons effectué un deuxième criblage CRISPR-Cas9 en utilisant la librairie TKOv3 qui cible environ 18000 gènes dans les lignées cellulaires déficientes en FANCA. Notre objectif pour le deuxième crible est d'identifier les gènes qui pourraient devenir des cibles de traitement thérapeutique. L'inactivation de ces gènes ou l'inhibition des protéines correspondantes pourraient aider les cellules AF ou les patients AF à mieux survivre une exposition au formaldéhyde. Nous validons et caractérisons actuellement les candidats probables de ce ciblage. En résumé, cette thèse élucide le rôle d'EXO1 dans les dommages induits par le formaldéhyde et identifie des cibles diagnostiques et thérapeutiques potentielles pour les patients AF. / Fanconi anemia (FA), caused by the mutations of 22 FA genes (FANCA-FANCW), is a rare, genome instability associated disease. FA is characterized by a wide range of clinical phenotypes including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, cancer susceptibility and hypersensitivity to DNA inter-strand crosslinks (ICLs). Several mouse models have been produced to study FA. However, progressive bone marrow failure, the most prevalent manifestation in FA patients, is hardly recaptured in FA mouse models. Formaldehyde, the simplest aldehyde, exists in the environment and in our bodies. In fact, our bodies release a relatively high concentration of formaldehyde. Formaldehyde can cause ICLs and DNA-protein crosslinks (DPCs), which impair genome stability. Mouse models have been created in order to identify whether increased formaldehyde levels contribute to bone marrow failure or leukemia as in FA patients. Fancd2⁻/⁻ Aldh2⁻/⁻as well as Fancd2⁻/⁻ Adh5⁻/⁻ double inactivation mouse models allowing for aldehyde accumulation highlighted the potential importance of aldehydes, in particular formaldehyde, on the development of FA. The main objective of my Ph.D. is to study the mechanism of cellular response to formaldehyde-induced DNA damage to identify a potential therapeutic target for FA patients. To gain insights into deciphering which genes may be involved in responding to formaldehyde-induced DNA damage, we carried out a CRISPR-Cas9 screen using the TKOv1 library that targets more than 17000 genes. Our results were validated by the identification of several genes that belong to the FA pathway, the nucleotide excision repair (NER) pathway, or the formaldehyde metabolism pathway, which have been shown to cope with formaldehyde-induced damages or formaldehyde directly. Interestingly, exonuclease 1 (EXO1), a nuclease that participates in both replicative and post-replicative processes, was found to be a major target. Therefore, we characterized the roles of EXO1 in response to formaldehyde-induced DNA damage in both ICLs and DPCs. We also performed a second CRISPR-Cas9 screen using the TKOv3 library targeting around 18000 genes in FANCA-deficient cell lines. Our aim for the second screen is to identify genes that could become actionable therapeutic targets. The knockout of these genes or the inhibition of corresponding proteins could help FA cells or FA patients survive better under the exposure to formaldehyde. We are currently validating and characterizing the possible candidates. In summary, this thesis elucidates the role of EXO1 in formaldehyde-induced DNA damage and identifies potential diagnostic and therapeutic targets for FA patients.