Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare se manifestant par des troubles développementaux, sanguins, et une prédisposition à certains cancers. Les cellules de patients montrent une sensibilité élevée aux agents causant des ponts interbrins dans l'ADN, dont la réparation implique l'activation de la recombinaison homologue. La présence de PALB2, mutée dans l'anémie de Fanconi, est nécessaire pour la localisation chromatinienne de BRCA2 et RAD51, en réponse aux dommages à l'ADN. Comme BRCA2, PALB2 est un gène de prédisposition au cancer du sein. Il devient important de mieux comprendre le rôle de PALB2/FANCN dans la recombinaison homologue. Nous avons entrepris la caractérisation de l'activité biochimique de PALB2 en la purifiant, de même qu'un mutant associé au cancer du sein, PALB2Q775X, afin de clarifier son rôle dans la réparation de l'ADN. Les données obtenues suggèrent que PALB2 possède les caractéristiques d'un médiateur de la recombinaison homologue, ce qui en fait une cible privilégiée dans le développement de thérapies anticancéreuses dans le futur.

L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie multigénique récessive rare qui atteint les enfants en bas âge. Plusieurs protéines FA forment un complexe nucléaire essentiel à l'activité de la voie de l'anémie de Fanconi au cours des mécanismes de réparation de l'ADN et d'apoptose ainsi qu'au cours du cycle cellulaire et du développement. Les patients FA présentent tous une pancytopénie qui résulte du non renouvellement des cellules souches de la moelle osseuse et sont souvent atteints de malformations congénitales. Malgré les récentes avancées sur la compréhension de la dynamique et de la régulation de la voie Fanconi, la fonction de la plupart des protéines FA demeure toujours inconnue. L'objectif principal du projet de recherche était donc d'identifier d'éventuels partenaires biochimiques de la protéine FANCC par un criblage de banque d'ADNc afin de mieux comprendre la fonction des protéines FA dans les divers mécanismes cellulaires. Deux interacteurs potentiels retenus, soit CtBPl et UNC5A, ont été analysés pour leur capacité à interagir ou colocaliser avec d'autres protéines Fanconi par double hybride dans la levure, par coimmunoprécipitation et par immunofluorescence. Il a été montré que CtBPl interagit avec le complexe Fanconi et que UNC5A interagit avec la protéine FANCC. Aussi, l'activation de la voie Wnt induit une translocation nucléaire et une colocalisation des protéines F ANC A, FANCC et CtBPl. L'interaction directe entre le corépresseur CtBPl et le complexe FA suggère un rôle de la voie Fanconi dans les mécanismes de développement par le biais de la voie de développement Wnt. D'autres analyses sont nécessaires pour postuler sur l'implication de la protéine UNC5A dans l'anémie de Fanconi.

L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie rare et les patients présentent des malformations congénitales, des problèmes hématologiques et une prédisposition à certains cancers. Jusqu'à maintenant, 13 protéines FA ont été identifiées, dont 8 (FANC- A, B, C, E, F, G, L, M) s'associent pour former un complexe qui permet l'ubiquitination de FANCD2 et FANCI. Les autres protéines FA sont impliquées au niveau de la réparation de l'ADN ce qui ne permet pas d'expliquer en totalité le phénotype des patients. Récemment, HES1, effecteur de la voie de Notch, a été identifié comme un partenaire essentiel à la formation du complexe FA. HES1 est connue pour être impliquée dans le développement et l'hématopoïèse. L'interaction d'HES1 avec le complexe FA altérée pourrait expliquer en partie le phénotype des patients. L'objectif principal est de créer un peptide inhibiteur visant à altérer la liaison d'HES1 avec le complexe FA, sans toutefois modifier les autres fonctions d'HES1 dans la cellule. Un deuxième objectif est d'identifier de nouveaux partenaires au complexe FA afin de mieux comprendre le lien génotype-phénotype. L'identification d'un peptide inhibiteur a été réalisée premièrement par la sélection de quatre régions d'HES1 (les acides aminés 90-123, 86-121, 76-111 et 152-190) et deuxièmement par le criblage d'une banque de peptides aléatoires avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²². Le système double hybride en levure a été utilisé pour vérifier les interactions directes entre les peptides et les membres du complexe FA et ces interactions ont été testées dans un modèle cellulaire par la technique de co-immunoprécipitation. L'identification de nouveau partenaire au complexe FA a été réalisée par le criblage d'une banque d'ADNc de moelle osseuse avec FANCE. Le criblage avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²² a permis d'identifier deux peptides, mais leur activité inhibitrice n'a pas été évaluée. Les quatre régions d'HES1 semblent n'avoir aucun effet sur la liaison entre HES1 et le complexe FA. Le criblage de la banque d'ADNc n'a pas permis d'identifier de nouveaux partenaires à FANCE. Des études approfondies sont nécessaires pour confirmer les effets des peptides sur la liaison entre HES1 et le complexe FA.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie congénitale rare résultant d’une mutation sur chaque allèle parental d’un gène FANC. Nous avons récemment identifié un variant d'épissage de FANCL contenant une exclusion de l'exon 4. Une analyse par minigène nous a permis de démontrer que le polymorphisme de séquence (SNP) rs7958831 augmente substantiellement le saut de l'exon 4 de FANCL, et que les porteurs de ce SNP ont une quantité significativement plus élevée de transcrits FANCL∆4. L'étude de fractions ribosomales nous a permis de confirmer que le transcrit alternatif est bel et bien traduit en protéine. Toutefois, une protéine de fusion FANCL∆4-GFP ne migre pas au noyau comme le fait FANCLwt-GFP. L'isoforme FANCL∆4 n'est pas en mesure d'accomplir la fonction principale de FANCL, soit de monoubiquitiner FANCD2. De plus, des cellules EUFA868 déficientes en FANCL complémentées avec FANCL∆4 ne retrouvent pas leur phénotype normal en test de survie et ont une proportion plus importante bloquée en phase G2/M. Ces résultats nous permettent de penser que le SNP rs7958831 pourrait moduler le risque de cancer du sein puisque l'isoforme FANCL∆4 ne semble pas fonctionnelle.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique caractérisée par une insuffisance médullaire, un risque augmenté de cancers et plusieurs types de malformations. FANCC constitue la seule des 15 protéines FA qui se localise principalement au cytoplasme. De ce fait, en plus de son rôle dans la réparation de l’ADN, FANCC pourrait intervenir dans d’autres mécanismes régulant la croissance des cellules hématopoïétiques. Pour mieux comprendre ses fonctions, nous avons cherché de nouveaux partenaires de FANCC. Le corépresseur de la transcription CtBP1 a été retenu pour analyse. L’étude des interactions a confirmé le lien physique FANCC CtBP1 et révélé que CtBP1 est un membre du complexe FA. Afin d’éclaircir la fonction des interactions, nous avons analysé le profil d’expression génique de cellules réprimées pour les gènes FA ou CtBP1. Les résultats ont montré une expression augmentée de l’antagoniste de la voie Wnt Dickkopf 1 (DKK1). Ainsi, les essais de gènes rapporteurs ont établi que CtBP1 et FANCC agissent comme répresseur transcriptionnel du promoteur DKK1. Nous avons aussi observé que FANCD2 réprime indirectement DKK1 en favorisant l’expression de l’oncogène c Myc. Le mécanisme pourrait dépendre d’interactions entre les protéines FA, incluant FANCC, et les protéines de l’appareil transcriptionnel Wnt, CtBP1 et b caténine. Par ailleurs, nous avons montré que FANCC s’accumule au noyau en réponse à la signalisation Wnt et qu’elle participe avec d’autres protéines FA à l’activation de la b caténine. Ainsi, nous avons trouvé des niveaux élevés de DKK1 dans le surnageant des cellules appauvries en protéines FA et CtBP1, de même que dans les sérums de souris knockout FancA et FancC. Notre étude a permis de montrer que FANCC et les protéines FA, de concert avec CtBP1, agissent dans la régulation transcriptionnelle de l’antagoniste DKK1. Ces résultats suggèrent que FANCC est une protéine clé impliquée dans la signalisation Wnt. Puisque DKK1 est impliqué dans des processus connus pour être perturbés dans la FA, la régulation de DKK1 par FANCC et CtBP1 représente un mécanisme pouvant expliquer la perte progressive des cellules souches hématopoïétiques et représente une étape cruciale pour la découverte de stratégies visant à prévenir l’insuffisance médullaire chez les patients FA. / Fanconi anemia (FA) is a genetic disease characterized by bone marrow failure, excess cancer risk, as well as a broad array of malformations. FANCC is one of fifteen genes linked to the FA disease and encodes a protein that, unlike other FA proteins, is localized primarily to the cell cytoplasm. Because of this, in addition to its role in DNA crosslink repair, FANCC is proposed to function in other mechanisms that can regulate hematopoietic progenitor cell fate. To better understand its functions, we investigated for new partners of the FANCC protein. One candidate, the transcriptional corepressor CtBP1, was selected for further analyses. Interatomic studies confirmed the physical link between FANCC and CtBP1 and revealed that CtBP1 is a member of the FA core complex. To investigate biological function of these interactions, we used a microarray strategy and found that the Wnt antagonist Dickkopf 1 (DKK1) is upregulated in FA and CtBP1 depleted cells. Accordingly, CtBP1 and FANCC were found to act as transcriptional repressor on DKK1 promoter in reporter gene assays. We also observed that FANCD2 indirectly represses DKK1 in promoting the expression of c Myc. Functional mechanism of these repressions may be explained on the observation that FANCC and FA core complex proteins interact with the Wnt transcriptional machinery proteins including CtBP1 and b catenin. Furthermore, we showed that FANCC accumulates into the nucleus in response to Wnt signalisation and participates with other FA proteins in b catenin activation. Therefore, we found increased levels of DKK1 in FA and CtBP1 depleted cells supernatant as well as in sera from FancA and FancC knockout mice. Functional interaction studies showed that FANCC and FA proteins with CtBP1 act in transcriptional regulation of the Wnt antagonist DKK1. These findings suggest that FANCC is a key protein involved in the Wnt signalling response. Because DKK1 is implicated in biological processes similar to those involved in FA pathogenesis, linking FANCC with CtBP1 to the regulation of DKK1 suggests a possible mechanism explaining the progressive loss of bone marrow cells and represents a crucial step for the development of novel strategies aimed at preventing bone marrow failure in FA patients.