L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique récessive caractérisée par des anomalies congénitales, une défaillance progressive de la moelle osseuse, une hypersensibilité aux pontages inter-brins de l’ADN (ICLs) et une susceptibilité à développer le cancer. La voie AF implique au minimum 20 gènes FANC (FANCA-FANCU) et les protéines encodées par ces gènes interagissent également dans une voie cellulaire connue permettant la résistance des cellules aux ICLs de l’ADN. Les agents pontants qui génèrent les ICLs lient de manière covalente les deux brins de l’ADN, créant de ce fait une obstruction physique aux processus cellulaires qui nécessitent le déroulement des deux brins d’ADN tels que la réplication de l’ADN et la transcription. La monoubiquitination de FANCI et FANCD2 par la E3 ubiquitine ligase FANCL est l’évènement culminant de l’activation de la voie AF. Ce processus est dépendant des protéines FANC ayant un rôle en amont de cette étape. Le complexe moléculaire formé par FANCI et FANCD2 coordonne plusieurs événements de la voie AF à la suite de sa monoubiquitination. Tout au long de mon travail de doctorat, nous avons étudié différents aspects de la voie de l’anémie de Fanconi. Nous avons montré deux importants domaines de liaison à l’ADN dans FANCD2 dans lesquels se trouvent six acides aminés polaires, principalement des résidus lysines, très conservés à travers l’évolution. Ces domaines contribuent de manière importante à la liaison à l’ADN dépendante des charges spécifiques. Un de ces domaines de liaison à l’ADN s’avère être également une séquence de localisation nucléaire (NLS) dont la mutation empêche la localisation nucléaire de FANCD2. Les mutants cytoplasmiques de FANCD2 ont aboli leur monoubiquitination et furent incapables de promouvoir la monoubiquitination de FANCI, de même que l’association à la chromatine. Lorsque les défauts de transport nucléaire sont complémentés par un NLS hétérologue, il en résulte une réduction de la monoubiquitination de FANCD2. Ainsi, nos résultats suggèrent que le domaine de liaison à l’ADN et le NLS identifiés dans cette étude soient des régions cruciales de FANCD2. Les cassures double-brins de l’ADN (CDB) sont un autre aspect de la voie de AF qui a fait l’objet de nos études. Les CDB sont des structures intermédiaires formées au moment du décrochage (« unhooking ») du pont inter-brin lors du processus de résolution des ICLs. Nous avons attribué de nouvelles fonctions pour la protéine FANCG dans l’inhibition de la résection des extrémités d’ADN générées par la CDB, affectant ainsi le choix de la voie de réparation de l’ADN. Cette fonction de FANCG est indépendante des autres protéines FANC ayant un rôle en amont, à l’exception de la protéine FANCA. Nous avons également mis en lumière de nouvelles fonctions pour les protéines AF/cancer du sein BRCA2 et PALB2 aux fourches de réplication bloquées. Puis, nous avons également montré qu’un rôle pour ces protéines consiste en la stimulation de la polymérase eta (Polη) afin d’initier la synthèse de l’ADN. En effet, BRCA2 et PALB2 interagissent avec Polη et sont requises pour le recrutement de cette polymérase aux fourches de réplication bloquées. De plus, elles stimulent la synthèse d’ADN dans la D-Loop via la stimulation de la Polη, un élément essentiel à ce processus. Nous concluons donc que PALB2 et BRCA2, en plus de leurs fonctions dans la stimulation de la formation de la D-Loop par RAD51, jouent un rôle crucial dans la synthèse d’ADN associée à la recombinaison via la réparation de l’ADN régulée par la Polη. / Fanconi anemia (FA) is a recessive genetic disorder characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, DNA interstrand cross-links (ICLs) hypersensitivity, and cancer susceptibility. The FA pathway consists of at least 20 FANC genes (FANCA-FANCU), and the encoded protein products interact in a common cellular pathway to gain resistance against DNA ICLs. The ICL-producing agents covalently cross-link two DNA strands and thus, are obstructions to processes which requires unwinding of the two DNA strands such as DNA replication, and transcription. FA pathway activation culminates in the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI proteins by E3 ubiquitin ligase FANCL, a process dependent on other upstream FA proteins. The molecular complex formed by FANCI and FANCD2 coordinates multiple events in the FA pathway upon its monoubiquitination. Throughout my doctoral work, we studied various aspects of the FA pathway. We have demonstrated two major DNA binding motifs (DBMs) in FANCD2, comprising of six evolutionally conserved polar amino acids predominantly consisting of lysine, which contributed to the specific charge dependent DNA binding. One of the DBM also consisted of a nuclear localization sequence (NLS), disruption of which abrogated the nuclear localization of FANCD2. The cytoplasmic mutants of FANCD2 had abolished monoubiquitination and were unable to promote FANCI monoubiquitination and chromatin association. Complementation of the nuclear transport defect by a heterologous NLS resulted in the reduction of FANCD2 monoubiquitination. Our results suggest that the DNA binding and NLS identified in this study are crucial regions of FANCD2. DNA double-strand breaks (DSB) are produced as one of the structural intermediates upon ICL unhooking step. We assigned novel functions to the FA protein FANCG in limiting the DNA end-resection, and thus it affects the repair pathway choice. This function of FANCG is independent of other upstream FA proteins except FANCA. We also reveal new functions for FA/breast cancer proteins BRCA2 and PALB2 at blocked replication forks and show a role for these proteins in stimulating polymerase eta (Polη) to initiate DNA synthesis. PALB2 and BRCA2 interact with Polη, and are required to sustain the recruitment of Polη at blocked replication forks. PALB2 and BRCA2 stimulate Polη-dependent DNA synthesis on Displacement loop (D-loop) substrates. We conclude that PALB2 and BRCA2, in addition to their functions in stimulating D-loop formation by RAD51, play crucial roles in the initiation of recombination-associated DNA synthesis by Polη-mediated DNA repair.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique caractérisée par une insuffisance médullaire, un risque augmenté de cancers et plusieurs types de malformations. FANCC constitue la seule des 15 protéines FA qui se localise principalement au cytoplasme. De ce fait, en plus de son rôle dans la réparation de l’ADN, FANCC pourrait intervenir dans d’autres mécanismes régulant la croissance des cellules hématopoïétiques. Pour mieux comprendre ses fonctions, nous avons cherché de nouveaux partenaires de FANCC. Le corépresseur de la transcription CtBP1 a été retenu pour analyse. L’étude des interactions a confirmé le lien physique FANCC CtBP1 et révélé que CtBP1 est un membre du complexe FA. Afin d’éclaircir la fonction des interactions, nous avons analysé le profil d’expression génique de cellules réprimées pour les gènes FA ou CtBP1. Les résultats ont montré une expression augmentée de l’antagoniste de la voie Wnt Dickkopf 1 (DKK1). Ainsi, les essais de gènes rapporteurs ont établi que CtBP1 et FANCC agissent comme répresseur transcriptionnel du promoteur DKK1. Nous avons aussi observé que FANCD2 réprime indirectement DKK1 en favorisant l’expression de l’oncogène c Myc. Le mécanisme pourrait dépendre d’interactions entre les protéines FA, incluant FANCC, et les protéines de l’appareil transcriptionnel Wnt, CtBP1 et b caténine. Par ailleurs, nous avons montré que FANCC s’accumule au noyau en réponse à la signalisation Wnt et qu’elle participe avec d’autres protéines FA à l’activation de la b caténine. Ainsi, nous avons trouvé des niveaux élevés de DKK1 dans le surnageant des cellules appauvries en protéines FA et CtBP1, de même que dans les sérums de souris knockout FancA et FancC. Notre étude a permis de montrer que FANCC et les protéines FA, de concert avec CtBP1, agissent dans la régulation transcriptionnelle de l’antagoniste DKK1. Ces résultats suggèrent que FANCC est une protéine clé impliquée dans la signalisation Wnt. Puisque DKK1 est impliqué dans des processus connus pour être perturbés dans la FA, la régulation de DKK1 par FANCC et CtBP1 représente un mécanisme pouvant expliquer la perte progressive des cellules souches hématopoïétiques et représente une étape cruciale pour la découverte de stratégies visant à prévenir l’insuffisance médullaire chez les patients FA. / Fanconi anemia (FA) is a genetic disease characterized by bone marrow failure, excess cancer risk, as well as a broad array of malformations. FANCC is one of fifteen genes linked to the FA disease and encodes a protein that, unlike other FA proteins, is localized primarily to the cell cytoplasm. Because of this, in addition to its role in DNA crosslink repair, FANCC is proposed to function in other mechanisms that can regulate hematopoietic progenitor cell fate. To better understand its functions, we investigated for new partners of the FANCC protein. One candidate, the transcriptional corepressor CtBP1, was selected for further analyses. Interatomic studies confirmed the physical link between FANCC and CtBP1 and revealed that CtBP1 is a member of the FA core complex. To investigate biological function of these interactions, we used a microarray strategy and found that the Wnt antagonist Dickkopf 1 (DKK1) is upregulated in FA and CtBP1 depleted cells. Accordingly, CtBP1 and FANCC were found to act as transcriptional repressor on DKK1 promoter in reporter gene assays. We also observed that FANCD2 indirectly represses DKK1 in promoting the expression of c Myc. Functional mechanism of these repressions may be explained on the observation that FANCC and FA core complex proteins interact with the Wnt transcriptional machinery proteins including CtBP1 and b catenin. Furthermore, we showed that FANCC accumulates into the nucleus in response to Wnt signalisation and participates with other FA proteins in b catenin activation. Therefore, we found increased levels of DKK1 in FA and CtBP1 depleted cells supernatant as well as in sera from FancA and FancC knockout mice. Functional interaction studies showed that FANCC and FA proteins with CtBP1 act in transcriptional regulation of the Wnt antagonist DKK1. These findings suggest that FANCC is a key protein involved in the Wnt signalling response. Because DKK1 is implicated in biological processes similar to those involved in FA pathogenesis, linking FANCC with CtBP1 to the regulation of DKK1 suggests a possible mechanism explaining the progressive loss of bone marrow cells and represents a crucial step for the development of novel strategies aimed at preventing bone marrow failure in FA patients.

L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare, caractérisée par une défaillance de la moelle osseuse, des anomalies du développement et une forte incidence de cancer, essentiellement des leucémies myéloïdes aiguës. L'anémie de Fanconi peut être causée par la mutation de 13 gènes différents, et neuf des protéines Fane sont responsables de la monoubiquitination de FANCD2, qui est donc centrale dans la 'voie Fanconi'. Le complexe MRN joue plusieurs rôles essentiels dans la réparation des cassures double-brin dans l'ADN par recombinaison homologue : dans la signalisation du dommage et dans les points de contrôle du cycle cellulaire, dans la préparation des extrémités de la cassure pour les étapes suivantes de la réparation ainsi qu'un rôle structural afin de faciliter la réparation. Il a été montré précédemment que la protéine FANCD2 colocalise avec NBS1. Cependant, la relation fonctionnelle entre FANCD2 et MRE11 est mal comprise. Mes travaux de doctorat montrent que l'inhibition de MRE11, NBS1 ou RAD50 conduit à la déstabilisation de FANCD2. FANCD2 s'accumule de la phase S à la phase G2 aux sites contenant de l'ADN simple brin ou aux sites de dommages à l'ADN. La protéine FANCD2 purifiée lie préférentiellement d'ADN simple brin en comparaison à différents substrats d'ADN. L'inhibition de l'activité nuclease de MRE11 par le MIRIN diminue le nombre de foyers de FANCD2 formés in vivo. Nous proposons donc que FANCD2 lie l'ADN simple brin provenant de la résection de la cassure double brin par MRE11. Nos données établissent que MRN est un régulateur essentiel de la stabilité et de la fonction de FANCD2 au cours de la réponse aux dommages à l'ADN.

L'anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique rare. Chez l’homme, toute mutation dans l’une des 22 protéines du complexe de Fanconi entraîne une insuffisance médullaire et une prédisposition au cancer. Cette pathologie est également caractérisée par divers défauts de développement, dont une petite taille et des malformations squelettiques des membres supérieurs et inférieurs. En effet, plus de la moitié des enfants atteints de l’AF ont des anomalies radiales (radial-ray anomalies) couplées à une tendance précoce à l’ostéoporose. Cependant, les mécanismes sous-jacents conduisant à des défauts osseux dans l’AF restent inexpliqués. Notre laboratoire a mis en évidence la surexpression de Dickkopf-1 (DKK1), un inhibiteur de la voie de Wnt, dans le plasma des souris Fanconi. Cette protéine est impliquée dans le développement des membres et l’activité ostéoblastique. De plus, sa surexpression dans le plasma corrèle avec une diminution de la densité minérale osseuse chez les humains. La surexpression de DKK1 pourrait donc refléter une altération du système squelettique chez les souris Fanconi. Ce manuscrit présente le travail que j’ai réalisé dans le laboratoire de Madeleine Carreau au cours de mon doctorat afin de caractériser le développement squelettique embryonnaire des souris Fanconi et déterminer les mécanismes responsables de l'altération du développement et du métabolisme osseux chez les souris adultes. À ces fins, une double coloration à l’alizarine et au bleu Alcian a été réalisée sur des embryons de souris FancC - / -, FancA - / - et de souris de type sauvage E15.5 à 19.5 day post conception (dpc) pour évaluer leur maturation squelettique. Chez les adultes, la structure et le contenu minéral osseux ont été évalués à l’aide d’analyses de micro-computed tomography (μ- CT) sur des tibias provenant de souris FancC - / - et de souris sauvages. Des analyses histomorphométriques ont été effectuées pour évaluer la capacité de formation osseuse des ostéoblastes et la résistance osseuse a été évaluée en utilisant un test de flexion en trois points. De plus, des cultures in vitro ont été réalisées pour évaluer la capacité de différenciation des cellules souches mésenchymateuses et des analyses des transcrits sur des cellules osseuses et de la moelle osseuse ont été réalisées pour identifier les mécanismes moléculaires conduisant à une altération de la physiologie osseuse. Nos résultats montrent que les embryons des souris FancC - / - et FancA - / - présentent une forte diminution de la minéralisation de leur squelette indiquant un développement squelettique anormal chez ces souris. Les souris FancC -/- adultes présentent une diminution de la densité minérale osseuse associée à une diminution de la résistance osseuse chez les mâles. Grâce aux études in vitro, nous avons pu constater que les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse FancC - / - et FancA - / - ont une capacité de différenciation ostéoblastique altérée et présentent un biais de différenciation en faveur de l’adipogenèse. Ces résultats sont associés à l’altération des profils d’expression génique des cellules osseuses. Nos résultats suggèrent que la physiologie osseuse défectueuse dans l’AF survient in utero et résulte éventuellement d’une altération de la fonction des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Ces résultats fournissent, pour la première fois, des informations précieuses sur les mécanismes impliqués dans les défauts de développement dans l’AF. Nos résultats renforcent le lien important entre le comportement des cellules souches hématopoïétiques et l’altération du métabolisme osseux dans cette maladie. De futures études devraient se concentrer sur ce domaine pour mieux comprendre les mécanismes des défauts osseux et espérer un traitement limitant l’altération du tissu osseux dans l’AF. / Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disease. In humans, any mutation in one of the 22 proteins of the Fanconi complex leads to bone marrow failure and cancer predisposition. This pathology is also characterized by various developmental defects including short stature and skeletal malformations of the upper and lower limbs. Indeed, more than half of children affected with FA have radial-ray abnormalities with a tendency to develop early osteoporosis. However, the underlying mechanisms leading to bone defects in FA remains elusive. Previous results from our laboratory showed that Fanconi mice overexpress the Wnt signaling pathway inhibitor Dickkopf-1 (DKK1) in their plasma. This protein is implicated in limb development and osteoblast activity and its overexpression in plasma correlates with a decrease in bone mineral density in humans. Therefore, DKK1 overexpression could reflect an alteration of the skeletal system in Fanconi mice. This manuscript presents the work I achieved in Madeleine Carreau’s lab to characterize the embryonic skeletal development of Fanconi mice and determine the mechanisms leading to altered bone development and metabolism in adult mice. To this aim, alizarin red and Alcian blue double staining was performed on mouse embryos (E15.5 to 19.5 dpc) to evaluate skeletal maturation. In adults, bone structure and mineral content were evaluated using μCT-scan analyses of tibias from FancC-/- and wild-type mice. Histomorphometric analyses were performed to assess bone forming abilities of osteoblasts and bone stiffness was evaluated using three points bending test. In vitro cultures were performed to assess mesenchymal stem cell differentiation ability and q-PCR analysis of bone and marrow cells were performed to identify molecular mechanisms leading to altered bone physiology. Our results show that FancC-/- and FancA-/- embryos have an abnormal skeletal development indicated by a twenty percent decrease of bone mineralization surface. In adults, FancC-/- mice present a decrease in bone mineral density associated with a decrease in male’s bone stiffness. Using in vitro studies, we found that FancC-/- and FancA-/- bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) have reduced osteoblastic differentiation capabilities and favor adipogenesis. Those results were associated with the alteration of bone cells gene expression profiles. Our results suggest that defective bone physiology in FA occurs in utero and possibly results from altered BM-MSCs function. These results provide, for the first time, valuable insights into the mechanisms involved in FA developmental defects. Our results strengthen the important link between hematopoietic stem cells behavior and bone metabolism alteration in this disease. Future studies should focus on this area to better understand the mechanisms of bone defects and hope for targeted treatment for Fanconi Anemia.