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The nucleo-cytoplasmic compartmentalization enables eukaryotic cells to develop sophisticated post-transcriptional regulations of gene expression. However, managing the exchanges of macromolecules between the two compartments also represents a formidable challenge for the cells. Nucleo-cytoplasmic exchanges rely on specialized soluble carriers and take place at nuclear pore complexes that span the nuclear envelope. Active nucleo-cytoplasmic transport of proteins, in particular, is performed mainly by a family of carriers called karyopherins, which includes about twenty members in mammals. Some of them, called importins, recognize nuclear localization signals (NLSs) in their substrates and convey them into the nucleus. Others, called exportins, recognize nuclear export signals (NESs) in their substrates and bring them back to the cytoplasm. <p>Many RNA-binding proteins (RBPs) shuttle between the nucleus and the cytoplasm, where they can often fulfill different functions. RBPs also frequently localize into specialized microdomains that are not delimited by a membrane but in which specific factors are concentrated. Those include processing bodies and stress granules, which are cytoplasmic foci associated with mRNA decay, storage and translational repression. Post-transcriptional regulations mediated by RBPs can therefore be modulated rapidly and efficiently through changes in the localization of RBPs.<p>The first part of this work focuses on the subcellular localization and nucleo-cytoplasmic transport of the Drosophila RBP dTIS11. Like its mammalian and yeast homologues, dTIS11 binds AU-rich elements in the 3’UTR of its target mRNAs, and stimulates their rapid deadenylation and decay. Here, we have observed that although dTIS11 appears to be located mostly in the cytoplasm, it is constantly shuttling in and out of the nucleus. We show that the export of dTIS11 from the nucleus depends on the CRM1 exportin and is mediated by a hydrophobic NES that encompasses residues 101 to 113 in dTIS11 sequence. We also identify a cryptic Transportin-dependent PY nuclear localization signal (PY-NLS) in the tandem zinc finger region of dTIS11 and show that it is conserved across the TIS11 protein family. This PY-NLS partially overlaps the second zinc finger (ZnF2) of dTIS11. Importantly, mutations disrupting the capacity of the ZnF2 to coordinate a Zn2+ ion unmask dTIS11 and TTP PY-NLS and promote nuclear import. Taken together, our results indicate that the nuclear export of Drosophila and mammalian TIS11 proteins is mediated by CRM1 through diverging NESs, while their nuclear import mechanism might rely on a conserved PY-NLS whose activity is negatively regulated by ZnF2 folding.<p>In the second part, we present preliminary results which implicate the nucleo-cytoplasmic transport machinery in the assembly of stress granules (SGs) in mammalian cells. SGs contain silenced mRNPs which resemble stalled initiation complexes, and they form transiently in response to acute stress, concomitantly with a global arrest of translation. While their exact role remains undefined, it seems clear that SGs are able to exchange mRNPs with polysomes and with PBs, and that they are connected to post-transcriptional and translational regulations of gene expression during stress. Here, we show that inhibition of Transportin-1 expression or function does not affect the translational status of cells but impairs the assembly of stress granules. Finally, we show that Transportin-1 and -2B, but not -2A, localize into stress granules in response to several stresses. <p>In conclusion, we suggest two potential new roles for Transportins, in the nucleo-cytoplasmic traffic of TIS11 proteins on the one hand and in the assembly of stress granules on the other hand.<p>/<p>Le compartimentage nucléo-cytoplasmique permet aux cellules eucaryotes de réguler l’expression génétique par des mécanismes post-transcriptionnels élaborés. Les ARN messagers subissent plusieurs étapes de maturation dans le noyau avant d’être exportés vers le cytoplasme où ils sont traduits et dégradés. Ces processus sont effectués via des protéines de liaison à l’ARN, ou RBPs. Beaucoup de RBPs exercent des fonctions différentes dans le noyau et dans le cytoplasme, et leur activité peut dès lors être rapidement modulée par une modification de leur localisation.<p>Le transport nucléo-cytoplasmique actif des protéines s’effectue à travers les pores nucléaires et fait majoritairement appel à des transporteurs solubles de la famille des karyophérines. Ceux-ci reconnaissent au sein des protéines à transporter une séquence-passeport appelée NLS (nuclear localization signal) ou NES (nuclear export signal) selon la direction nécessitée. <p>Le présent travail comporte deux parties. La première porte sur la localisation subcellulaire et le transport nucléo-cytoplasmique des protéines de la famille TIS11, et plus particulièrement de dTIS11 qui est le seul représentant de cette famille chez la Drosophile. Comme ses homologues dans d’autres espèces, dTIS11 est une RBP qui favorise la déadénylation et la dégradation de ses ARN messagers cibles. Nos résultats démontrent que dTIS11 fait la navette entre le noyau et le cytoplasme. L’export de dTIS11 hors du noyau est réalisé par la karyophérine CRM1 et fait appel à un NES différent de celui présent chez les protéines TIS11 mammaliennes. Nous identifions également un NLS cryptique au sein du domaine à deux doigts de zinc avec lequel dTIS11 lie l’ARN. Ce NLS correspond partiellement au signal consensus reconnu par la Transportine. Il est démasqué par la mutation du second doigt de zinc ;dans ces conditions, il permet l’import de dTIS11 par la Transportine. Enfin, nous montrons qu’il est conservé dans d’autres protéines de la famille TIS11. <p>Dans la seconde partie, nous nous intéressons aux granules de stress, qui sont des microdomaines cytoplasmiques dans lesquels se concentrent des RBPs et des ARN messagers non traduits en réponse à un stress cellulaire. Nous montrons que les karyophérines appartenant à la sous-famille des Transportines sont présentes dans ces granules et que l’inhibition de l’expression ou de la fonction des Transportines réduit la formation de ces granules en réponse à divers stress cellulaires. Nous écartons la possibilité que ce résultat soit un effet indirect d’un ralentissement du métabolisme traductionnel. Nos résultats suggèrent donc une implication des Transportines dans la formation des granules de stress. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

De nombreuses voies de signalisation cellulaire complexes permettent de répondre à la présence de dommages à l’ADN. Cette réponse cellulaire est indispensable afin d’éviter l’accumulation de mutations pouvant éventuellement conduire à la transformation tumorale. Ces différentes voies de réponse aux dommages à l’ADN sont hautement coordonnées et sont regroupées au sein d’un mécanisme global appelé DNA damage response (DDR). Les facteurs du DDR sont régulés à plusieurs niveaux de la cascade de l’expression des gènes. De façon notable, plusieurs protéines de liaison à l’ARN (RBP) participent à la régulation de l’expression des gènes du DDR via la régulation post- transcriptionnelle de leur ARN messager. La RBP STAU2 est connue pour lier plusieurs ARNm codant pour des protéines impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire ainsi que dans les voies du DDR. La protéine STAU2 est elle-même régulée au niveau transcriptionnel par le facteur de transcription E2F1. De récentes observations laissent penser que la kinase centrale du DDR, CHK1, pourrait être impliquée dans la régulation de la stabilité de STAU2. Par ailleurs, les conséquences cellulaires de la diminution du niveau d’expression de STAU2 sont à ce jour très peu connues. Ce mémoire a d’abord été entrepris dans le but de mieux comprendre l’implication de la voie de la kinase CHK1 dans la régulation de la protéine de liaison à l’ARN STAU2. CHK1 est une protéine centrale des voies du DDR ainsi que du contrôle de la progression du cycle cellulaire en l’absence de dommages à l’ADN. Nos résultats montrent que la diminution de CHK1 induit une dégradation rapide de STAU2 par les caspases d’une façon indépendante de l’apoptose. Nous avons également renforcé ce lien entre STAU2 et les mécanismes de réparation des dommages à l’ADN en identifiant plusieurs protéines des voies de réparation dans l’environnement immédiat de STAU2. D’autre part nos travaux visent à mettre en évidence les conséquences de la déplétion de STAU2 dans plusieurs types cellulaires. STAU2 étant une RBP, sa dérégulation impacte inévitablement le devenir de plusieurs ARNm. Afin de caractériser ces différentes conséquences, nous avons dans un premier temps réalisé la déplétion totale de STAU2 dans des cellules hTert-RPE par la technique de CRISPR/Cas9. Nos résultats montrent que ces cellules accumulent anormalement des dommages à l’ADN et prolifèrent plus rapidement que des cellules normales. En outre plusieurs gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN se retrouvent diminués dans ces cellules. Dans un second temps, afin de définir si cet effet est dépendant du type cellulaire, nous avons induit la diminution de l’expression de STAU2 dans des cellules IMR90. Nous avons montré que dans ce cas, la diminution de STAU2 induit un arrêt du cycle cellulaire et une entrée des cellules en sénescence. Ainsi, les données présentées dans ce mémoire contribuent à mieux comprendre l’implication de STAU2 dans les processus cellulaires majeurs que sont la régulation du DDR et le contrôle du cycle cellulaire. / Many complex cellular pathways are induced in response to DNA damages. This cellular response is indispensable to prevent the accumulation of mutations and to avoid malignant transformation. These different pathways are highly coordinated and are organized in a global mechanism called DNA damage response (DDR). Proteins involved in the DDR are regulated at different levels of the gene expression process. Notably, several RNA binding proteins are involved in the regulation of DDR gene expression through the post-transcriptional control of their mRNA. The RBP STAU2 is known to bind various mRNAs coding for proteins involved in the DDR or cell cycle control. STAU2 is regulated at the transcriptional levels by the major transcription factor E2F1. Recent observations suggest that CHK1 could be implicated in the control of the steady-state level of STAU2. Otherwise, the cellular consequences of STAU2 downregulation remain elusive. The purpose of this research was first to elucidate the implication of CHK1 pathway in STAU2 regulation. CHK1 is a major protein involved in the DDR regulation as well as in the control of cell cycle progression in the absence of DNA damage. Our data show that the downregulation of CHK1 rapidly leads to a caspase-dependent degradation of STAU2 independently of apoptosis. The link between STAU2 and mechanisms of DNA repair was reinforced by our BioID2 experiment that identified several proteins of the DDR in close proximity with STAU2. On the other hand, the aim of this study was to determine the consequences of STAU2 downregulation in different cell lines. Given that STAU2 is an RBP, its dysregulation will inevitably change the fate of several mRNA. In order to increase our understanding of theses consequences, we generated an hTert-RPE1 STAU2-KO cell line using the CRISPR/Cas9 technique. Our data show that these cells accumulate DNA damage and have an increased proliferation rate. Moreover, several genes involved in the DNA repair pathway are downregulated. We also downregulated STAU2 in IMR90 to determine if the previous observations are cell-type specifics. In the latter case, STAU2 diminution triggers cell cycle arrest and cellular senescence. Altogether, these results contribute to improve our knowledge of STAU2 function, especially in DNA damage response pathway and in cell cycle regulation.