Les protozoaires du genre Leishmania sont responsables de différentes pathologies présentant des taux importants de morbidité et de mortalité à travers le monde. En l'absence de vaccin efficace, le contrôle de ces infections repose sur l'utilisation d'agents chimiothérapeutiques. Ce parasite étant dépourvu de promoteurs classiques, la régulation génique repose essentiellement sur des mécanismes post-transcriptionnels, ce qui rend l'étude des protéines primordiale. Toutefois, les protéines peu abondantes sont souvent sous-représentées avec les méthodes protéomiques classiques et le fractionnement protéique est donc à privilégier. L'étude des protéines exprimées de manière préférentielle chez l'un des deux stades de vie, soit les promastigotes présents chez l'insecte-vecteur et les amastigotes présents dans les macrophages de l'hôte mammifère infecté, peut mener à l'élaboration de vaccins et/ou de nouveaux traitements. Il est également essentiel de mieux caractériser les mécanismes de résistance aux médicaments actuels. Les objectifs de cette thèse étaient i) de mieux caractériser le protéome des deux stades de vie du parasite en étudiant les protéines basiques, membranaires et de haut poids moléculaire par la mise au point de méthodes protéomiques innovantes et ii) d'étudier les mécanismes de résistance de Leishmania à l'antimoine trivalent et l'amphotéricine B par protéomique quantitative et par séquençage à haut débit du génome complet. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont permis l'élaboration de méthodes de fractionnement protéique permettant une meilleure représentation des protéines peu abondantes chez Leishmania. Les analyses protéomiques subséquentes des protéines basiques, membranaires et de haut poids moléculaire ont permis l'identification de nombreuses protéines impliquées dans la différenciation entre les deux formes de vie du parasite. Des études de protéomique quantitative ont également permis de découvrir des protéines impliquées dans la résistance à l'antimoine trivalent et à l'amphotéricine B. De plus, l'aneuploïdie a également été impliquée dans la résistance à ces deux molécules. La formation d'amplicons circulaires extrachromosomiques a été observée en lien avec la résistance à l'antimoine trivalent. Finalement, deux nouvelles mutations ponctuelles ont été impliquées dans la résistance aux médicaments chez Leishmania, soit LinJ.33.1810-E629K dans le cas de l'antimoine trivalent et LinJ.13.1590-G433S dans le cas de l'amphotéricine B.

Le genre Leishmania regroupe des parasites protozoaires transmis par piqûre d’un insecte vecteur et qui sont responsables des leishmanioses. Le cycle de Leishmania alterne entre promastigotes dans l’appareil digestif de l’insecte et amastigotes dans les phagolysosomes des macrophages d’un hôte mammifère. Les delta-amastines sont une famille de protéines membranaires qui jouent potentiellement un rôle dans la virulence. L’expression exclusivement au stade intracellulaire de l’un de ces gènes est permise par une accumulation préférentielle de l’ARNm et la stimulation de la traduction, toutes deux chez les amastigotes. L’objectif de cette thèse est de caractériser les mécanismes permettant l’expression différentielle de l’ARNm de la delta-amastine. Ces organismes ont divergé rapidement des autres eucaryotes, ce qui engendre plusieurs différences fonctionnelles, dont notamment l’absence de régulation transcriptionnelle. Notre hypothèse est que la présence d’une région riche en uridines (URE) dans l’extrémité 3’ non traduite (3’UTR) du transcrit peut être impliquée dans la dégradation de l’ARNm. Nous démontrons que le URE est responsable d’une dégradation du transcrit au stade promastigote, par un phénomène indépendant de la déadénylation. Nous avons identifié une protéine à domaine Alba, LiAlba20, liant l’ARNm de la delta-amastine dans une région proche de l’URE. La suppression de cette protéine réduit l’accumulation du transcrit au stade amastigote. Ainsi, deux mécanismes complémentaires sont responsables de l’expression différentielle de ce transcrit. Le génome de Leishmania code pour une seconde protéine à domaine Alba, LiAlba13. Ces protéines interagissent ensemble, mais LiAlba13 n’affecte pas l’abondance de l’ARNm de la delta-amastine. Les protéines Alba ont une évolution exceptionnelle puisqu’elles stabilisent l’ADN chez les Archaea, et sont retrouvées dans les complexes RNase P/MRP chez les eucaryotes supérieurs. Nos résultats montrent qu’elles régulent l’expression de protéines spécifiques du stade amastigote, ce qui concorde avec les récents travaux chez d’autres parasites protozoaires. Ces protéines sont cytoplasmiques dans les deux stades de développement. Cependant, pendant la différenciation, elles s’accumulent dans le flagelle et le nucléole, respectivement décrits comme senseur et coordinateur de la réponse au stress. Nos travaux suggèrent donc l’implication du flagelle et du nucléole dans la coordination de la régulation de facteurs de virulence pendant la différenciation du parasite. / The Leishmania genus encompasses protozoan parasites which are transmitted through the bite of an insect vector and are responsible for leishmaniasis. The Leishmania life cycle alternates between promastigote forms within the gut of the insect vector and amastigotes which multiply in the phagolysosomal vacuoles of the mammalian host’s macrophages. Delta-amastins are part of a multigenic family of membrane proteins that potentially act in parasite virulence. One of the delta-amastin's exclusive expression in the intracellular stage is mediated by mRNA accumulation and translation stimulation, both taking place in the amastigote stage. The aim of this thesis is to characterize the mechanisms implicated in the differential expression of delta-amastin mRNA. Leishmania splits early in evolution from other eukaryotes and this split correlates with many functional differences, including the absence of transcriptional control of gene expression. Our hypothesis is that the presence of a uridine-rich element (URE) within the 3’ untranslated region (3’UTR) of the transcript might be implicated in an mRNA decay mechanism. We reveal that the URE is responsible for a fast mRNA decay only in the promastigote stage, performed by an unusual deadenylation-independent pathway. We next identified an Alba domain protein, LiAlba20, which binds to the delta-amastin mRNA in a region flanking the URE. Depletion of this protein leads to a reduced mRNA accumulation in the amastigote stage specifically. Therefore, we identified two complementary mechanisms taking part in the transcript’s differential expression. The Leishmania genome encodes a second Alba domain protein, LiAlba13. These proteins interact together, but LiAlba13 does not affect the delta-amastin mRNA level during the parasite life cycle. Alba domain proteins have a remarkable evolution, being involved in DNA stabilization in Archaea and subunits of the RNAses P/MRP complexes in higher eukaryotes. In addition, our data show that these proteins regulate stage-specific protein expression, which is in agreement with recent works in other protozoan parasites. Alba domain proteins are constitutively expressed in the cytoplasm of both parasite life cycle stages. Nevertheless, during the differentiation, those proteins accumulate in flagellar and nucleolus compartments, respectively described as sensor and stress response coordinators in higher eukaryotes. Our work suggests that the flagellum is implicated in the coordination of stage-specific transcript expression in response to stress in Leishmania.

Le parasite protozoaire Leishmania possède un cycle de vie dimorphique; le stade promastigote présent chez l'insecte vecteur et le stade amastigote présent dans les phagolysosomes des macrophages de l'hôte vertébré. L'étude des gènes exprimés préférentiellement ou spécifiquement au stade intracellulaire pourrait nous en apprendre d'avantage sur les mécanismes de survie du parasite à l'intérieur des macrophages. Parmi les gènes exprimés préférentiellement au stade amastigote nous avons identifié la famille des amastines qui codent pour des protéines de surface. Cette famille est présente chez plusieurs espèces de Leishmania où on retrouve en moyenne 50 membres. Toutes les amastines possèdent une séquence signature de 11 acides aminés qui leur est unique. La majorité des amastines sont plus abondantes au stade amastigote et cette régulation implique des séquences situées en 3'UTR. La comparaison des génomes de deux espèces de Leishmania causant des pathologies distinctes, soit L. major et L. infantum a révélé une grande conservation au niveau de la synténie du génome. Cela suggère que ce qui est responsable de chaque pathologie se situe au niveau des quelques gènes uniques à chaque espèce ou encore au niveau de l'expression différentielle des gènes communs. Pour identifier de nouveaux gènes exprimés au stade intracellulaire et également identifier des gènes impliqués dans le tropisme, une analyse du transcriptome entier a été effectuée à l'aide de la technologie de puces à ADN. Lors de cette étude, où des parasites intracellulaires ont été utilisés, les résultats ont montré que chez L. infantum, 7.1 % des gènes étaient différemment exprimés entre les deux stades tandis que 9.3% l'étaient chez L. major. Parmi ces gènes modulés très peu (=10%) sont communs aux deux espèces. Une expérience indépendante avec les puces a été réalisée avec des parasites axéniques de L. infantum, pour comparer les deux stades de développement mais aussi pour évaluer la pertinence du système de culture axénique pour les amastigotes par rapport aux amastigotes obtenus de macrophages ou d'animaux infectés. Cette expérience a révélé que 12.8% des gènes étaient modulés entre les deux stades et que parmi ces gènes très peu étaient en commun avec ceux identifiés chez les amastigotes intracellulaires.