Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le follicule pileux est un micro-organe spécifique des mammifères responsable de la formation des poils. Au cours de la vie postnatale, le follicule pileux subit des phases récurrentes de croissance (anagène), régression (catagène) et repos (télogène). Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent le cycle pilaire rappellent certains des évènements qui ont lieu durant la morphogénèse. Bien qu’il y ait eu des avancées significatives dans la connaissance de la biologie du follicule pileux ; les mécanismes qui régulent le passage de la phase anagène à la phase catagène restent mystérieux. Fgf5, un membre de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes, a été identifié comme un régulateur clé de la transition anagène-catagène. Les souris qui ne produisent pas de protéine Fgf5 active présentent un phénotype angora (go/go) caractérisé par une phase anagène plus longue et de longs poils. Cependant, les follicules pileux n’ayant pas Fgf5, entrent quand même dans la phase catagène, ce qui suggère que d’autres mécanismes contribuent au control du cycle pilaire. Des précédents résultats obtenus dans notre laboratoire ont établis une relation très proche entre le déclenchement de la phase catagène et le diamètre du poil. En utilisant le follicule de vibrisse comme modèle, nous avons confirmé ces résultats en démontrant, par in hybridation in situ, que l’expression du gène Fgf5 s’active dans les cellules de la gaine épithéliale externe localisées dans la région supra-bulbaire, progressivement l’expression de Fgf5 s’étend jusqu’à l’extrémité inférieur de la gaine épithéliale externe et s’éteint quelques jours avant le début de la phase catagène, de nouveau dans les cellules de la gaine épithéliale externe localisées dans la partie supra-bulbaire. Nous avons également démontré que le nombre de couche cellulaires dans la région du cortex du poil, augmente progressivement au cours du temps jusqu’à atteindre exactement le même nombre de couche, quelques jours avant la fin de la phase de croissance, chez la souris sauvage et la souris Fgf5LacZ/LacZ. Ces résultats confirment notre hypothèse établissant que Fgf5 ne déclenche pas de façon direct la phase catagène. Ensuite, nous avons démontré pour la première fois que les cellules progénitrices du cortex peuvent se diviser symétriquement. Ces divisions symétriques très rares se traduisent, quelques jours après, en la formation d’une nouvelle couche cellulaire dans le cortex du poil. Ces résultats appuient notre hypothèse qu’une boucle de régulation complexe impliquant, la gaine épithéliale externe, la papille dermique (qui exprime Fgfr1, le récepteur de Fgf5), la matrice et la région supra-bulbaire ; est indispensable au control du cycle pilaire. Nous avons ensuite démontré par qRT-PCR et des marquages immunologiques que plusieurs canaux mécano-sensitifs sont exprimés de façon spécifique dans ces régions d’intérêts. De plus, plusieurs gènes importants pour la signalisation, sont également exprimés dans ces régions. Tout cela mis ensemble nos résultats soutiennent l’hypothèse provocatrice que la croissance progressive de la largeur du poil induit une pression mécanique qui entraine l’activation de canaux mécano-sensitifs, qui vont à leur tour activer des voies de signalisation pour finalement contrôler l’expression de Fgf5 dans la région supra-bulbaire et ainsi contrôler le cycle pilaire. / The hair follicle is a skin micro-organ specific to mammals and responsible for the formation of the hair. During postnatal life, the hair follicle undergoes recurrent phases of growth (anagen), regression (catagen) and rest (telogen) termed the hair cycle. The cellular and molecular mechanisms that regulate the hair cycle recapitulate some of the events occurring during morphogenesis. Despite significant advances in the understanding of biology of the hair follicle, the mechanisms regulating the switch from anagen to catagen remain mysterious. Fgf5, a member of the fibroblast growth factor family, has been proposed as a key regulator of the transition between anagen and catagen. Mice that do not produce active Fgf5 have an angora (go/go) phenotype characterized by an extended anagen phase and long hairs. Nevertheless, Fgf5 null hair follicles still enter catagen, suggesting that other mechanisms contribute to the control of the hair cycle. Previous work in the laboratory using Fgf5Lacz/LacZ null mice has unraveled a close connection between the onset of catagen and the diameter of the hair. Using the whisker follicle as a model system, we have confirmed these results and demonstrated by in situ hybridization that the expression of the Fgf5 gene is switched-on in the supra-bulbar region of the outer root sheath, progressively extends towards the lower extremity of the outer root sheath and is switched-off in the supra-bulbar region of the outer root sheath several days before the onset of catagen. We have also demonstrated that the number of cell layers in the hair cortex progressively increases with time to reach the exact same number a few days before the end of anagen in both wild-type and Fgf5 null follicles confirming our working hypothesis that Fgf5 does not directly trigger catagen. Next, we have demonstrated for the first time that the basal cortex-forming cells could divide symmetrically. These rare symmetrical divisions result in the formation of additional cell layers in the cortex. These results support our working hypothesis that a complex regulatory loop involving the outer sheath, the dermal papilla (that express Fgfr1, the Fgf5 receptor), the cortical matrix and the supra bulbar region is critical in controlling whisker growth. We have then demonstrated by q-RTPCR and immunostaining that several mechanosensitive channels are specifically expressed in the regions of interest. Moreover, several genes important for signaling are also expressed in these regions. Altogether, our results support the provocative hypothesis that the progressive increase in the width of the hair induces a mechanical pressure that leads to the activation of mechanosensitive channels, which in turn activate specific signaling pathways and ultimately result in the control of the expression of the Fgf5 gene in the supra-bulbar region of the outer root sheath and then in the control of the hair cycle.

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La cryoconservation de cortex ovarien est la seule technique envisageable pour les patientes pré-pubères et les femmes dont la pathologie nécessite l’administration d’un traitement hautement gonadotoxique dont l’initiation ne peut être différée. L’autotransplantation est jusqu’à présent la seule méthode disponible de réutilisation du tissu ovarien cryoconservé, et a permis d’obtenir plus de 130 naissances dans le monde, dont trois au CHRU de Besançon. Toutefois, en cas de pathologie néoplasique à risque de localisation métastatique ovarienne, cette technique peut présenter un risque de réintroduction de cellules malignes susceptibles d’être présentes dans le greffon. Des méthodes alternatives à l’autogreffe de tissu ovarien cryopréservé fondées sur l’utilisation de follicules ovariens isolés sont actuellement en développement. L’objectif de cette thèse a été de développer un protocole permettant l’isolement et la qualification de follicules ovariens qui pourront être utilisés en thérapie cellulaire à usage humain. Dans un premier temps, une validation de la technique d’isolement de follicules ovariens a été réalisée à partir de la dissociation de fragments de cortex ovarien, issus de patientes ayant subit une résection percœlioscopique, à l’aide d’une collagénase NB6 produite selon les bonnes pratiques de fabrication. Les follicules ainsi obtenus ont été analysés en termes de viabilité (immédiate et après culture in vitro), rendement, morphologie et état prolifératif. Dans un deuxième temps, la sécurité carcinologique des suspensions folliculaires obtenues après isolement a été évaluée par cytométrie en flux multicouleurs à l’aide d’une modélisation ayant consisté en la contamination de suspensions folliculaires avec des cellules leucémiques issues de patients souffrant de leucémies aigües myéloïdes (LAM) ou lymphoblastiques (LAL) d’immunophénotype connu. La collagénase NB6 a permis l’isolement d’un grand nombre de follicules vivants, principalement au stade primordial, et dont la majorité était non activée, même après trois jours de culture in vitro dans un gel de fibrine. La technique d’isolement suivie de trois lavages a permis d’éliminer les cellules leucémiques préalablement ajoutées aux suspensions folliculaires dans 23 cas sur 24, sans endommager les follicules isolés. La cytométrie en flux multicouleurs est une technique d’analyse efficace pour évaluer la contamination, par des cellules leucémiques, de suspensions contenant des follicules ovariens isolés. Le protocole d’isolement de follicules ovariens humains, ayant été réalisé avec la collagénase NB6 de grade clinique, peut être envisagé pour une reconstruction ovarienne à visée thérapeutique humaine. / The cryopreservation of ovarian cortex is the only technique available for prepubertal girls and women when their pathology requires the administration of a highly gonadotoxic treatment whose initiation cannot be delayed. Autotransplantation has so far been the only available method to re-use cryopreserved ovarian tissue, and has resulted in more than 130 births worldwide, including three at the Besançon Hospital. However, in cases of neoplastic disease with a risk of ovarian metastatic localization, this technique may present a risk of reintroducing malignant cells likely to be present in the graft. Alternative methods to cryopreserved ovarian tissue autograft based on the use of isolated ovarian follicles are currently under development. The aim of this thesis was to develop a protocol allowing the isolation and the qualification of ovarian follicles that can be used in cell therapy for human purposes. In a first step, a validation of the technique to isolate ovarian follicles was carried out from the dissociation of cortical ovarian fragments, taken from patients undergoing a laparoscopic ovarian drilling, using collagenase NB6 which is produced according to good manufacturing practices. Follicles thus obtained were analyzed in terms of viability (before and after in vitro culture), yield, morphology and proliferative state. In a second step, the carcinologic safety of follicular suspensions obtained after isolation was evaluated by multicolor flow cytometry using a model involving the contamination of follicular suspensions with leukemic cells from patients suffering from acute myeloid leukemia (AML) or acute lymphoblastic leukemia (LAL) with known immunophenotype. Collagenase NB6 has allowed the isolation of a large number of viable follicles, mostly at the primordial stage and the majority of which were unactivated even after three days of in vitro culture in a fibrin matrice. Our isolation technique followed by three washes has allowed the elimination of leukemic cells previously added to follicular suspensions, in 23 out of 24 cases, without damaging isolated follicles. Multicolor flow cytometry is an effective analytical technique for assessing leukemic cell contamination of suspensions containing isolated ovarian follicles. The protocol to isolate human ovarian follicles, performed with the clinical grade collagenase NB6, may be considered for an ovarian reconstruction to human therapeutic purposes.

Depuis plusieurs années, la vectorisation de molécules est considérée comme la stratégie la plus prometteuse pour améliorer la pénétration cutanée des principes actifs et pour cibler et contrôler leur libération, augmentant ainsi l'efficacité thérapeutique des traitements tout en limitant leurs effets secondaires. Les nanoparticules polymériques ont fait l'objet de nombreuses études car elles possèdent une très grande stabilité et une capacité supérieure aux autres vecteurs à libérer les principes actifs de façon prolongée. Récemment, le laboratoire de Pharmacie Galénique de Besançon a montré, in vivo, que les nanoparticules polymériques de diamètre inférieure ou égale à 100 nm pénétraient spécifiquement dans la peau inflammée de la souris, alors qu'aucune pénétration n'était observée dans la peau saine. Le premier objectif de cette thèse était de confirmer ces hypothèses dans la peau inflammée d'un autre animal, le porc. Les résultats de notre étude in vivo confirment l'absence de pénétration des nanoparticules polymériques dans la peau saine du porc et montrent une pénétration taille dépendante dans la peau inflammée. Le second objectif poursuivi était de vérifier ces résultats chez l'Homme. Pour cela, une preuve de concept a été mise en place dans le service de Dermatologie du CHRU de Besançon. Les premiers résultats de cette étude clinique semblent confirmer l'absence de pénétration des nanoparticules polymérique de I 00 nm dans la peau des volontaires sains et dans la peau non lésée des patients souffrant de dermatite atopique. A l'inverse, une forte pénétration des nanoparticules est observée au niveau des plaques d'eczéma des patients. Si les résultats de l'étude clinique se confirment, nous prévoyons d'encapsuler un anti­inflammatoire ou un immunosuppresseur pour vérifier l'intérêt thérapeutique de ces vecteurs en médecine humaine dans le traitement de la dermatite atopique. Parallèlement, une évaluation pourrait être réalisée en médecine vétérinaire pour le traitement de cette pathologie fréquente chez le chien, et dont le traitement actuel repose sur l'administration per os de corticoïdes à l'origine de nombreux effets secondaires. / For several years now, nanocarriers have been considered as the most promising strategy to improve skin penetration of active ingredients. Moreover, these carriers are more efficient at targeting and controlling drug release into the skin, which leads to increased treatment efficiency and reduced side effects. Polymeric nanoparticles have been the object of an increasing number of studies due to their good physicochemical stability and prolonged release of active ingredients which is superior to any other carriers. Recently, the Laboratory of Pharmaceutical Engineering at Besançon proved in vivo, that polymeric nanoparticles with a diameter smaller or equivalent to I 00 nm specifically penetrated in inflamed skin of mice whilst no penetration was observed in healthy skin. The first aim ofthis thesis was to confirm this hypothesis on another animal's inflamed skin, in instance the pig. Our results confirm the poor penetration of polymeric nanoparticles in healthy skin ofpigs and show various degree ofpenetration depending on the size of the nanoparticles into the inflamed skin area. The second objective ofthis work was to evaluate the skin penetration of our polymeric nanoparticles in humans. A proof of concept has been developed in the Department of Dermatology at Besancon University Hospital. The first results ofthis clinical trial tend to confim1 the greater penetration ofour carrier, specifically in inflamed skin. In fact, no penetration of polymeric nanoparticles with a size close to 100 nm was observed in healthy skin ofvolunteers or in the non-inflamed skin of patients suffering from atopic dennatitis. Conversely, a high penetration ofthese carriers was observed in the skin lesions of patients with atopic dermatitis. If the results ofthis clinical trial are confirmed, we plan to load an anti-inflammatory or an immunosuppressive drug into the nanoparticles to evaluate the therapeutic value ofthese nanocarriers in human medicine in the treatment ofatopic dermatitis. Meanwhile, a similar study may be undertaken in veterinary medicine for the treatment of atopic dermatitis in dogs which is a common disease whose current treatment is based on the oral administration of corticosteroids and cause many undesirable side effects.

Les mammifères femelles naissent avec un très grand nombre de follicules ovariens primordiaux (104-106); par contre, la grande majorité (99%) de ces follicules n’atteignent jamais la maturité et subissent l’atrésie, principalement par l’apoptose des cellules de la granulosa. Notre laboratoire a démontré que les hyaluronidases des mammifères induisent l’apoptose des cellules de la granulosa et sont impliquées dans l’atrésie des follicules mais que cet effet apoptotique ne serait pas dû à leur activité enzymatique. Notre modèle propose que les hyaluronidases aient un rôle dans les follicules non destinés à ovuler. Le but de la présente étude est d’évaluer la folliculogénèse et la fertilité des souris déficientes de ces enzymes. Les résultats montrent que la délétion de Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne des souris mais qu’il pourrait y avoir un effet compensatoire par Hyal-1 chez les souris déficientes de Hyal-3 étant donné que son expression est augmentée chez ces souris. La délétion de Hyal-1 a pour effet d’augmenter le nombre des follicules primordiaux, primaires et secondaires, particulièrement chez les souris de bas âge, et de diminuer le niveau d’apoptose des cellules de la granulosa. Afin d’évaluer la fonction de Hyal-1, -2 et -3 sans effet compensatoire entre elles, nous avons voulu créer une souris déficiente des ces 3 hyaluronidases spécifiquement dans les gonades en utilisant le système Cre/loxP. Un vecteur contenant la séquence Cre sous le contrôle du promoteur de Inhibin-α, qui conduit l’expression des gènes en aval chez les cellules somatiques des gonades, a été construit avec succès. En conclusion, cette étude nous révèle que Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne mais que la délétion de Hyal-1 augmente la folliculogénèse et diminue l’apoptose des cellules de la granulosa. / Female mammals are born with a large number of ovarian primordial follicles, though the vast majority of these never reach the preovulatory stage and undergo atresia, mainly through granulosa cell apoptosis. Our laboratory has established that mammalian hyaluronidases induce apoptosis of ovarian granulosa cells and that they are involved in follicular atresia but that their apoptotic effect is not due to their enzymatic activity. Our model suggests that mammalian hyaluronidases might have a role in follicles not destined to ovulate. The aim of this study was to evaluate the folliculogenesis and fertility of mice devoid of these enzymes. Our results showed that Hyal-3 KO mice have normal folliculogenesis, which could be explained by a compensatory effect of Hyal-1 since its expression is upregulated in these mice. In contrast, Hyal-1 KO mice had increased numbers of primordial, primary and secondary follicles, particularly in young mice, and lower levels of granulosa cell apoptosis. In order to investigate the effect of the three hyaluronidases, Hyal-1, -2 and -3, without a compensatory effect by one another, we decided to create a transgenic mouse deficient in all these three hyaluronidases but only in the gonads by using the Cre/loxP system. We successfully created a plasmid containing the Cre sequence under the control of Inhibin-α promoter, which conducts gene expression in somatic cells of the gonads. In conclusion, the present work demonstrates that Hyal-3 does not have any effect on ovarian function, but that deletion of Hyal-1 in mice promotes increased folliculogenesis and lowers granulosa cell apoptosis.

Les mammifères femelles naissent avec un très grand nombre de follicules ovariens primordiaux (104-106); par contre, la grande majorité (99%) de ces follicules n’atteignent jamais la maturité et subissent l’atrésie, principalement par l’apoptose des cellules de la granulosa. Notre laboratoire a démontré que les hyaluronidases des mammifères induisent l’apoptose des cellules de la granulosa et sont impliquées dans l’atrésie des follicules mais que cet effet apoptotique ne serait pas dû à leur activité enzymatique. Notre modèle propose que les hyaluronidases aient un rôle dans les follicules non destinés à ovuler. Le but de la présente étude est d’évaluer la folliculogénèse et la fertilité des souris déficientes de ces enzymes. Les résultats montrent que la délétion de Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne des souris mais qu’il pourrait y avoir un effet compensatoire par Hyal-1 chez les souris déficientes de Hyal-3 étant donné que son expression est augmentée chez ces souris. La délétion de Hyal-1 a pour effet d’augmenter le nombre des follicules primordiaux, primaires et secondaires, particulièrement chez les souris de bas âge, et de diminuer le niveau d’apoptose des cellules de la granulosa. Afin d’évaluer la fonction de Hyal-1, -2 et -3 sans effet compensatoire entre elles, nous avons voulu créer une souris déficiente des ces 3 hyaluronidases spécifiquement dans les gonades en utilisant le système Cre/loxP. Un vecteur contenant la séquence Cre sous le contrôle du promoteur de Inhibin-α, qui conduit l’expression des gènes en aval chez les cellules somatiques des gonades, a été construit avec succès. En conclusion, cette étude nous révèle que Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne mais que la délétion de Hyal-1 augmente la folliculogénèse et diminue l’apoptose des cellules de la granulosa. / Female mammals are born with a large number of ovarian primordial follicles, though the vast majority of these never reach the preovulatory stage and undergo atresia, mainly through granulosa cell apoptosis. Our laboratory has established that mammalian hyaluronidases induce apoptosis of ovarian granulosa cells and that they are involved in follicular atresia but that their apoptotic effect is not due to their enzymatic activity. Our model suggests that mammalian hyaluronidases might have a role in follicles not destined to ovulate. The aim of this study was to evaluate the folliculogenesis and fertility of mice devoid of these enzymes. Our results showed that Hyal-3 KO mice have normal folliculogenesis, which could be explained by a compensatory effect of Hyal-1 since its expression is upregulated in these mice. In contrast, Hyal-1 KO mice had increased numbers of primordial, primary and secondary follicles, particularly in young mice, and lower levels of granulosa cell apoptosis. In order to investigate the effect of the three hyaluronidases, Hyal-1, -2 and -3, without a compensatory effect by one another, we decided to create a transgenic mouse deficient in all these three hyaluronidases but only in the gonads by using the Cre/loxP system. We successfully created a plasmid containing the Cre sequence under the control of Inhibin-α promoter, which conducts gene expression in somatic cells of the gonads. In conclusion, the present work demonstrates that Hyal-3 does not have any effect on ovarian function, but that deletion of Hyal-1 in mice promotes increased folliculogenesis and lowers granulosa cell apoptosis.