La dystrophie musculaire de Duchenne, est une maladie qui résulte d’une mutation dans le gène codant pour la dystrophine. Cette mutation entraine l'absence de la protéine dystrophine dans les fibres musculaires et mène à une dégénérescence des différents muscles ce qui engendre une défaillance cardiorespiratoire suivie d’un décès prématuré. La récente découverte du système CRISPR/Cas9 ouvre de nouvelles perspectives pour le développement d’un traitement curatif pour la DMD. A l’aide d’un ARNg, reconnaissant une séquence cible protospacer localisée à proximité d’un PAM (protospacer adjacent motif), l’endonucléase Cas9 génère une coupure double brin dans l’ADN. Il a été démontré que l’utilisation d’une paire d’ARNgs ciblant des introns permettait de générer de larges délétions et de restaurer un cadre de lecture propice à l’expression d’une dystrophine tronquée dans des cellules de patients DMD. Cependant, cette approche ne prend pas en considération la structure de la dystrophine qui résulte de cette délétion. Il a été suggéré que chez les patients atteints de la dystrophie musculaire de Becker, produisant une dystrophine tronquée mais fonctionnelle, la sévérité de la maladie serait reliée au type de délétion et à la structure de la dystrophine qui en résulte. Il semble donc pertinent de travailler au développement d’une approche qui prend aussi en considération la structure des répétitions de type spectrine. D’autre part, le système CRISPR/Cas9 envahit progressivement toutes les sphères des sciences de la vie et soulève par la même occasion des questions de sécurité pour les patients. En effet, la possibilité de mutations hors-cible ou d’une réponse immunitaire dirigée contre ces endonucléases pourrait freiner l’application clinique de ces outils. Ainsi nous avons envisagé différentes approches qui contribueraient à limiter des tels effets pouvant s’avérer néfastes pour les patients. Nos résultats montrent qu’il est possible d’utiliser la Cas9 de S.aureus ainsi qu’une paire d’ARNgs ciblant des exons pour induire une délétion dans l’ADN génomique. Cette délétion permet la formation d’un exon hybride qui restaure non seulement le cadre de lecture du gène de la dystrophine[1], mais contribue aussi à la formation d’une répétition de type spectrine hybride correctement phasée. Lors de nos expérimentations, nous avons été capables d’induire la production de dystrophine in vitrosur des lignées de cellules de quatre patients DMD et in vivodans un modèle de souris dystrophique. Ensuite, avec la technologie du Feldan Shuttle nous avons montré qu’il était possible d’induire l’édition du gène de la dystrophine (gène humain ou murin) en livrant directement des complexes ribonucléoprotéiques dans le muscle d’une souris dystrophique. Cette édition a permis d’induire l’expression de protéine dystrophine dans les fibres musculaires, mais cette approche reste pour le moment réduite à des applications localisées. Enfin, nous avons démontré que l’inactivation de l’activité autocatalytique du ribozyme N79 serait une stratégie envisageable pour contrôler l’expression d’une endonucléase. Présentement, ce système n’a fait ses preuves que lors d’expérimentations in vitro, mais il ouvre la porte au développement de nouveaux moyens de contrôler pharmacologiquement l’édition du génome par le système CRISPR/Cas9. Finalement, l’ensemble de ces travaux contribuent à une meilleure compréhension des défis à relever pour mettre au point un traitement curatif pour la dystrophie musculaire de Duchenne, de façon plus efficace et sécuritaire. / Duchenne Muscular Dystrophy is one of the most severe genetic disease. It is caused by a mutation in the dystrophin gene. Such mutation is responsible for the absence of the dystrophin protein in the muscles thus leading to muscle wasting and to a premature death following cardiorespiratory failure. The discovery of the CRISPR/Cas9 systems opened the path for the establishment of curative treatments for genetic diseases, such as DMD. A Cas9 endonuclease can generate a double strand break in the DNA at a targeted locus through a guide RNA that specifically recognize a DNA protospacer sequence located closed to a protospacer adjacent motif (PAM). Recent work published by others demonstrated that the use of a pair of sgRNAs targeting introns permitted to create a genomic deletion that restores the DMD gene reading frame thus leading to de novosyn thesis of a truncated dystrophin protein. However, such deletion does not consider the resulting structure of the central part of the dystrophin. In Becker muscular dystrophic patients, a truncated dystrophin protein is synthesized but the severity of the disease could be related to the structure of this protein. Consequently, it seems relevant to develop a therapeutic approach that considers the structure of the spectrin-like repeat that forms the central rod-domain of the dystrophin protein. Further more, while CRISPR/Cas9 is on the rise it also raises safety issues for patients. Indeed, off-target mutations and immune response directed against such endonuclease can occur thus preventing the possibility of starting clinical trials. Consequently, there is an increasing need to develop safer approaches that may counter such undesirable effects. Our results demonstrated the feasibility of inducing a large genomic deletion with the Cas9 from S. aureus with a pair of sgRNAs targeting exons. Such deletion allows the formation of a hybrid exon that could, in addition to restoring the expression of the dystrophin protein, restore the correct structure of the spectrin-like repeat in its central rod-domain. We have been able to demonstrate such dystrophin expression in vitroand in vivoin four different DMD patient cell lines and in a dystrophic mouse model, respectively. Next, we envisioned the delivery of Cas9/sgRNA ribonucleoprotein complexes using the Feldan Shuttle technology. We provided proof-of-principle that such delivery permits the editing of the dystrophin gene in the TA of mouse models. Following the editing, dystrophin protein expression was restored in the treated muscles of a dystrophic mouse model. Since this approach remains restricted to in situ treatments, further development should be addressed to allow systemic delivery of Cas9/sgRNA. Finally, we provided evidence that the self-catalytic activity of the ribozyme N79 can be controlled using toyocamycin. Even if it only demonstrated its efficacy in vitro, this system opens the path to the development of a different tool for the pharmacological induction of endonuclease protein expression. Finally, this work contributes to the improvement of our understanding for the establishment of a potent and safe therapy to find a cure for DMD.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Titre de l'écran-titre (visionné le 25 mars 2009). Bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Titre de l'écran-titre (visionné le 2 sept. 2008). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 71-80. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Titre de l'écran-titre (visionné le 29 novembre 2004). Bibliogr.

La protéine hétérotrimérique laminine-111 permet le lien entre la matrice-extracellulaire et l’intégrine α7β1 du sarcolemme, remplaçant ainsi dans les muscles dystrophiques, des liens normalement assurés par le complexe de la dystrophine. L’injection de laminine-111 dans des souris mdx a permis, entre autre, l’augmentation de l'expression de l'intégrine α7β1, d’empêcher les bris du sarcolemme lors de la contraction musculaire, de restaurer un niveau normal de la créatine kinase sérique, ainsi que d’augmenter la résistance et la force dans les muscles déficients en dystrophine. Ces résultats suggèrent que l'augmentation de la laminine-111 est un potentiel traitement pour la DMD. Les chaines β1 et γ1 de la laminine sont déjà exprimées dans le muscle humain adulte, mais la chaine α1 de la laminine (Lamα1) est exprimée uniquement pendant le stade très précoce 16 cellules de l'embryogenèse. Nous avons donc développé une méthode alternative à l’injection répétée de Laminine-111 en induisant l'expression endogène du gène LAMA1, afin de reformer le complexe trimérique α1β1γ1, la laminine 111. Ceci a été réalisé avec une technologie récente, le système CRISPR/Cas9, dont la Cas9 a été désactivée (dCas9) puis couplée à un domaine d’activation de la transcription, le VP160 (dCas9-VP160). L’utilisation d’un ou plusieurs ARN guides (ARNg) a permis de cibler le promoteur du gène LAMA1. L’ARNm de Lamα1 (qRT-PCR) ainsi que la protéine (immunohistochimie et immunobuvardage) n’ont pas été détecté dans le contrôle négatif, des myoblastes murins (C2C12). Cependant, une expression significative a été observée dans ces myoblastes transfectés avec des plasmides codant pour dCas9-VP160 et un ARNg. L’analyse protéique in vivo, dans des muscles de souris électroporés avec le même plasmide, a démontré une forte augmentation de la chaine α1 de la laminine. Des augmentations plus importantes de l’ARNm de Lamα1 ont été observées en utilisant 2 ARNg, suggérant un effet synergique. L’augmentation de l’expression de Lamα1 par le système de CRISPR/Cas9 devrait être étudiée d’avantage afin de vérifier si cette stratégie pourrait s’avérer efficace dans des cas de myopathies. / Laminin-111 protein complex links the extra-cellular matrix to integrin α7β1 in sarcolemma, thus replacing in dystrophic muscles links normally insured by dystrophin complex. Laminin-111 injection in mdx mouse increased expression of integrin α7β1, stabilized sarcolemma, restored serum creatine kinase to wild-type levels, and protected muscles from exercised-induced damages. These results suggested that increased Laminin-111 is a potential therapy for DMD. Laminin β1 and γ1 chains are expressed in adult human muscle but laminin α1 (LAMA1) gene is expressed only during embryogenesis. We thus developed an alternative method to Laminin-111 protein repeated administration by inducing expression of the endogenous LAMA1 gene. This was done with the CRSPR/Cas9 system, i.e., by targeting the LAMA1 promoter with one or several gRNAs and a dCas9 coupled with the VP160 transcription activation domain. LAMA1 mRNA (qRT-PCR) and proteins (immunohistochemistry and western blot) were not detected in the control C2C12 myoblasts. However, significant expression was observed in cells transfected and in mouse muscles electroporated with plasmids coding for dCas9-VP160 a gRNA. Larger synergic increases were observed by using 2 or 3 gRNAs. Increased expression of LAMA1 by the CRISPR/Cas9 system will have to be further investigated to verify whether this could be a treatment for several myopathies.

Thèse (Ph. D.) -- Université Laval, 1997. / Légendes sur f. en regard des ill. Bibliogr.: f. [334]-364. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [95]-106. Publié aussi en version électronique.