Thesis--University of Helsinki, 1990. / Includes bibliographical references (p. 86-102).

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique qui touche environ 1 garçon sur 3500. Cette pathologie liée au chromosome X est caractérisée par l’absence de dystrophine au niveau des muscles. Ce manque de dystrophine fragilise le sarcolemme des fibres musculaires menant à une faiblesse progressive du muscle. Les patients décèdent généralement dans la vingtaine et il n’y a pas à l’heure actuelle de traitement curatif pour cette maladie. Une approche pour restaurer la dystrophine chez le patient DMD est d’introduire un transgène codant pour cette protéine dans ses muscles. Cela peut être fait par thérapie génique et particulièrement par la thérapie génique ex vivo et l’électroporation. Bien que ces deux techniques aient fait leurs preuves dans différents modèles animaux, elles n’ont jamais été utilisées chez le chien dystrophique alors que c’est le modèle le plus proche de la DMD en termes de phénotype. Deux versions de la dystrophine de chien ont été utilisées dans nos expériences : une version pleine longueur et une autre plus petite afin qu’elle puisse être incluse dans un lentivirus. La transplantation de myoblastes génétiquement modifiés par ce lentivirus (thérapie génique ex vivo) nous a permis d’obtenir l’expression de micro-dystrophine dans les muscles des souris immunodéficientes greffés. Néanmoins, l’autotransplantation de myoblastes de chien génétiquement modifiés a mené à un rejet spécifique des cellules greffées. L’électroporation, c.-à-d. l’injection de plasmide suivie d’un choc électrique, a également été utilisée pour introduire ce transgène ainsi que celui de la dystrophine pleine longueur dans des muscles de souris et de chien. Ces deux transgènes furent retrouvés avec succès chez la souris et le chien. Cependant, des infiltrations de cellules de l’immunité spécifique furent retrouvées au niveau des fibres exprimant le transgène chez le chien (pour l’utilisation de micro-dystrophine) et chez le chien dystrophique (pour la dystrophine pleine longueur). Bien que les résultats obtenus avec la thérapie génique ex vivo et l’électroporation soient très bons chez la souris, ceux obtenus chez le chien sont plus modérés. Il reste donc encore beaucoup d’améliorations à apporter à ces deux méthodes avant qu’elles puissent être utilisées comme approche thérapeutique dans le cadre de la DMD. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease affecting 1 out of every 3500 boys. This X-linked pathology is characterised by the absence of dystrophin in myofibers. This lack of dystrophin leads to a progressive muscular degeneration. DMD patients die between 17 and 30 years of age. There are currently no curative treatments for this disease. An approach to restore dystrophin in DMD patients is to introduce a transgene coding for this protein into their muscles. This can be done by gene therapy, particularly by ex vivo gene therapy or by electroporation. Even if these 2 techniques have shown good results in mouse models, they have not been used in the dystrophic dog. Two different isoforms of the dystrophin were used in our experiments: the full length dog dystrophin and a shorter version, the dog micro-dystrophin, introduced in a lentivirus backbone. Myoblasts were transduced with this lentivirus and transplanted successfully in immunodeficient mouse. However, the autotransplantation of genetically modified dog myoblasts led to a specific rejection of the grafted cells. A non viral gene therapy (electroporation, i.e., injection of a plasmid followed by a sequence of electric pulses) was used to introduce these two different isoforms of dystrophin in mouse and (normal and dystrophic) dog muscles. The two transgenes were electroporated with success in these muscles. However, a specific immune response was found in some myofibers expressing the transgene in the normal dog (using micro-dystrophin) and in the dystrophic dog (using full length dystrophin). Although the results obtained with the ex vivo gene therapy and with the electroporation were relatively effective in the mouse model, those obtained with the dog model were much lower. Thus, lots of improvements remain to be made in order to consider these two techniques as potential approaches to restore dystrophin in a large animal model and eventually in DMD patients.

La transplantation de myoblastes (TM) est une des thérapies potentielles des plus prometteuses pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Une des limites de cette approche est le rejet des myoblastes du donneur par le système immunitaire de l’hôte. L’induction d’une tolérance immunologique envers les myoblastes greffés permettrait de contourner les effets secondaires conséquents à une immunosuppression soutenue, aujourd’hui indispensable à la survie de la greffe. Notre objectif est donc d'induire une tolérance immunologique via l’établissement d’un chimérisme mixte par un protocole non-myéloablatif, chez des souris dystrophiques. Le protocole testé a permis d'induire une tolérance périphérique transitoire au donneur ainsi que l'établissement de taux variables de chimérisme mixte. Cependant, il n’a pas permis d’induire une tolérance à la TM. Bien que nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés quant à la TM, des améliorations, telle qu’une association à court terme à la rapamycine, pourraient être envisagées en vue d'une application en clinique. / Myoblast transplantation (MT) is one of the most promising potential therapies for Duchenne muscular dystrophy (DMD). One limitation of this approach is the rejection of the donor myoblast by the host immune system. Induction of donor-specific immune tolerance would avoid the toxicities of chronic immunosuppressive therapy that is currently required to prevent graft rejection. Our objective is to induce immunological tolerance through the establishment of mixed-chimerism using a non-myeloablative protocol, into DMD mice. Our results show that the tested protocol permits the induction of transient peripheral tolerance status to the donor. It also allows the establishment of variable rate of mixed-chimerism. However, this protocol failed to induce tolerance to MT. Although we did not obtain the expected results on the MT, improvements, such as association with a short-term rapamycin treatment, may be considered to enhance the outcome of the proposed protocol in perspective of clinical application for DMD patients.

Thèse de doctorat : Biologie cellulaire et moléculaire : Paris 12 : 2005. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 150 réf.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biologie : Lyon 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. f. 191-209.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 224-254. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. [76]-97. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 80-88. Publié aussi en version électronique.

La dystrophie musculaire de Duchenne, maladie héréditaire causée par la mutation du gène codant la protéine appelée dystrophine, se caractérise par une dégénérescence musculaire progressive et létale. Présentement, c’est une maladie incurable. La transplantation de cellules myogéniques (TM) est une des approches thérapeutiques envisagées pour améliorer la condition et l’espérance de vie des patients. Cette thérapie consiste à prélever des myoblastes d’un donneur sain et de les transplanter dans les muscles d’un patient dystrophique. Cette approche comporte plusieurs difficultés, dont la survie des myoblastes post-transplantation. Premièrement, les myoblastes injectés meurent rapidement et massivement, le succès de la transplantation ne reposant alors que sur une faible portion de cellules transplantées. Tous les facteurs impliqués dans cette mortalité cellulaire ne sont pas encore déterminés. Néanmoins, il est établi que la régénération musculaire se base sur les capacités de prolifération et de différenciation des myoblastes. Le premier article de cette thèse propose l’administration de la forme active de la vitamine D3 pour compenser la perte initiale des myoblastes injectés. Nous avons confirmé l’effet mitogénique et morphogénique de la vitamine D3 sur les myoblastes humains permettant ainsi, via son administration, d’augmenter le succès des TMs. La deuxième partie de cette thèse traite du rejet immunitaire lié à la TM allogénique. Actuellement, pour bloquer ce rejet, les approches cliniques proposent une immunosuppression soutenue des patients, se révélant toxique à long terme et augmentant le risque de contracter des maladies iatrogènes. Une autre procédure, moins délétère, repose sur le développement d’une tolérance immunologique, via l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique mixte. Pour obtenir ce chimérisme, les procédures existantes nécessitent un lourd conditionnement des patients, incluant l’injection d’anticorps bloquants ou déplétants, ainsi qu’une irradiation pancorporelle. Le deuxième article de ce manuscrit propose l’administration de drogues cytoréductrices, déjà connues et approuvées en clinique. Ce protocole conduit au développement d’un statut de tolérance stable ainsi que le maintien à long terme des TMs. Les travaux effectués au cours de cette thèse proposent donc deux solutions pour circonvenir à la destruction précoce et plus tardive des myoblastes transplantés. Ces deux approches pourraient réduire l’aspect invasif de l’essai clinique basé sur la TM. / Duchenne muscular dystrophy is a fatal neuromuscular recessive disease characterized by widespread muscle damage throughout the body. No cure is currently available this disease. Myoblast transplantation (MT) is an interesting approach to enhance the life quality and life expectancy of patients. This therapy consists in harvesting myoblasts of a non-dystrophic donor and in transplanting them in dystrophic muscles. This approach involves many drawbacks and predominantly the loss of the grafted cells in post-transplantation period. Firstly, an important part of injected myoblasts quickly dies following their injection. Thus, the graft success relies on the survival of a little proportion of grafted cells. The pathways involved in this important death of cells are not well established. However, following a muscle injury, the muscular regeneration depends on the proliferation and the differentiation of myoblasts. In a first study, we propose an administration of the activated form of vitamin D3 on human myoblasts to compensate the early loss of injected cells. Actually, some previous studies demonstrated that this vitamin acted directly on myoblasts, regulating their proliferation and fusion. We have confirmed these effects and demonstrated that the administration of the vitamin D3 enhances the success of human MT. The second part of this thesis broaches the specific immune rejection associated with the allogeneic MT. Currently, Duchenne patients are treated with chronic immunosuppression for MT. However, the problem in humans is that the long-term use of immunosuppressive treatments has adverse effects: nephrotoxicity, increased cancer risk etc... Mixed-haematopoietic chimerism is a promising approach to circumvent sustained immunosuppression but most of proposed protocols need antibodies treatment or host irradiation. The second study of this thesis shows that we have developed a protocol based on a short term administration of two cytoreductive drugs, both approved for clinical use. The mixed-chimerism development obtained with our conditioning regimen promotes donor specific stable tolerance. Taken together, this thesis gives two solutions to circumvent the early and late destruction of transplanted myoblasts. These approaches could be further included in the clinical essay developed for the Duchenne muscular dystrophy by promoting the efficiency and decrease the clinical risk related to the MT.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique liée au chromosome X qui atteint un garçon sur 3 500. Cette maladie est caractérisée par l'absence de dystrophine à la surface des fibres musculaires. Sans cette protéine, les fibres se brisent plus fréquemment et une faiblesse musculaire progressive apparait. Les patients décèdent généralement au début de la vingtaine. Il n'y a présentement aucun traitement pour cette pathologie. La greffe de cellules myogéniques est une thérapie possible, mais se heurte à un rejet par le système immunitaire du patient. Pour contourner ce problème, il est possible de développer une thérapie génique ex vivo, basée sur la greffe de cellules autologues modifiées génétiquement. Malheureusement, aucune technique efficace de modification génétique des cellules n'était disponible il y a quatre ans. Nous avons testé deux nouvelles techniques de modification génétique. Une première est non virale et la seconde utilise les lentivirus. La première consiste à transfecter un plasmide d'expression de la dystrophine par Nucléofection. Pour intégrer les séquences, un second plasmide, codant pour l'intégrase PhiC31, est aussi introduit dans les cellules. Cette technique nous a permis de stabiliser des plasmides allant de 7 kb à 21 kb, ce qui en fait les plus grosses séquences jamais stabilisées dans des cellules de culture primaire humaine. Cette expression a pu être détectée dans les fibres musculaires après une greffe. Nous avons aussi utilisé des lentivirus pour effectuer une modification génétique des cellules. Ce vecteur viral est très efficace pour introduire des cassettes d'expression pour des versions tronquées de la dystrophine. L'expression de cette dystrophine est détectable in vitro, mais aussi in vivo après la transplantation. De plus, une cassette servant à faire le saut d'exon thérapeutique a aussi été introduite dans des cellules myogéniques et a permis de faire exprimer une dystrophine presque complète par des cellules issues de patients DMD. Cette expression a aussi été détectée dans des modèles murins. Ces travaux constituent une preuve de principe de la faisabilité d'une thérapie génique ex vivo pour la DMD. Plusieurs améliorations restent à apporter, mais il semble que ces travaux laissent croire qu'un essai clinique sera réalisable. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe X-linked muscle genetic illness that afflicts one boy per 3 500. Cell therapy is a possible cure for this illness that usually kills patients around age 25. Transplantation of the heterologus myogenic cells is, however, restricted by the immune rejection by the patient. Ex vivo gene therapy offers an evasion to this problem. Introduction of the therapeutic gene into the patient’s own myogenic precursor cells, followed by transplantation is the base of this therapeutic. Four years ago, no efficient procedure to stably modify myogenic cells was available. New gene introduction techniques were thus tested in the present thesis. The first one is a non-viral method. We used a new transfection technology (Nucleofection) to introduce plasmid DNA coding for dystrophin with success. To stabilize the expression, human myogenic cells were co-nucleofected with a PhiC31 expressing plasmid. This integrase was capable of stabilising expression plasmids ranging from 7 kb to 21 kb. This very large sequence was the largest plasmid ever stabilised into human primary cultured cells. The presence of full-length dystrophin protein was detected in vitro and confirmed in vivo, after the transplantation of the myogenic precursor. Another technique was used: the lentiviral vectors. These viral vectors were designed to deliver an expression cassette for a truncated version of the dystrophin gene. The viral vector was efficient at modifying the cells. The expression was shown in vitro and in vivo after the transplantation of the modified cells. The lentiviral vectors were also essayed to deliver a U7 exon skipping cassette into DMD cells. It was then possible to demonstrate that this introduction led to the expression of a quasi normal dystrophin protein in vitro. The expression was also shown in vivo after the transplantation into SCID mice model. A non-viral approach combining nucleofection and the PhiC31 integrase may eventually permit safe auto-transplantation of genetically modified cells. The utilisation of lentiviral vectors also provided evidences that an ex vivo gene therapy is possible for DMD. We believe these results are paving the way to an eventual clinical trial for ex vivo gene therapy.