Une synchronicité existe entre l’apparition de l’atrophie musculaire et osseuse (ostéoporose) mais, très peu de groupes de recherche se sont intéressés à la possibilité qu’une voie de signalisation commune puisse contrôler simultanément ces tissus dans un contexte pathologique. Le but de cette thèse est de caractériser les rôles du sentier signalétique principal du remodelage osseux soit la voie RANK/RANKL/OPG, sur le muscle squelettique sain ou pathologique. Premièrement, nous avons démontré que RANK est exprimé dans le muscle squelettique et que son absence dans ce tissu induit un effet inotropique sur le muscle rapide extensor digitorum longus (EDL), limitant ainsi la perte de force maximale spécifique, tout en augmentant l'atrophie musculaire, la fatigabilité et la proportion de fibres rapides. Ensuite, nous avons montré qu’un blocage pharmacologique de la voie RANKL/RANK par l’OPG atténue la perte de la force musculaire de manière dose-dépendante et préserve l'intégrité musculaire, en particulier des muscles rapides EDL de souris dystrophiques. Cette étude nous a également permis de démontrer que l’OPG-Fc a un effet intéressant mais plus limité sur la préservation de la force du muscle lent soleus (Sol). Par contre, nous avons découvert que l’OPG-Fc potentialise les effets positifs d'une faible dose de formotérol, un membre de la famille des β2-agonistes, et leur combinaison restaure complètement la fonction du Sol des souris dystrophiques. Finalement, nous avons débuté une étude mécanistique sur l’effet protecteur de l’OPG-Fc sur le muscle squelettique dystrophique. Structurellement, l'OPG-Fc pleine longueur contient quatre domaines TNFR (RANKL), deux domaines de la mort cellulaire par apoptose (TRAIL) et un domaine lié à l'héparine. Nos résultats indiquent que les injections d'anti-RANKL, d’anti-TRAIL et d’OPG-Fc tronquée (possédant seulement les domaines TNFR) ou la suppression génétique de RANK dans le muscle sont nettement moins efficaces sur la préservation de la force des muscles dystrophiques que celles d’OPG-Fc pleine longueur. Étonnamment, l'absence de Ca2+ extracellulaire réduit considérablement les effets de l’OPG-Fc pleine longueur sur la force des muscles dystrophiques dans un modèle de contractilité in vitro. Nos analyses en microscopie confocale ont démontré que l’OPG-Fc pleine longueur pourrait se lier à un récepteur présentement non identifié localisé sur les myotubes et que cette liaison entraîne possiblement une activation d’une kinase liée aux intégrines (ILK) et la surexpression d’une pompe calcique ATPase du réticulum sarcoplasmique appelée SERCA-2a, un déterminant clé de la performance musculaire. Les myotubes traités à l'héparinase, une enzyme connue pour cliver les domaines de l'héparine ou encore l’inhibition de l’ILK réduit significativement la surexpression de SERCA-2a induite par l’OPG-Fc. Cette thèse apporte globalement, une meilleure compréhension des fonctions de RANK/RANKL/OPG dans le muscle squelettique dénervé ou dystrophique et s’inscrit dans la liste des travaux pré-cliniques qui pourrait éventuellement contribuer à l’élaboration de nouveaux traitements pour les maladies musculaires et osseuses. / Although there is an obvious dynamic cross-talk between muscle and bone, a common signalling pathway that efficiently and synchronously controls these tissues has barely been investigated in all forms of muscle diseases. The aim of this thesis is to characterize the roles of RANK/RANKL/OPG, key regulators of bone remodeling, on skeletal muscle atrophy, phenotype and dysfunction. Firstly, we show that RANK is expressed in skeletal muscle and that muscle RANK deletion has inotropic effects in denervated fast-twitch extensor digitorum longus (EDL) muscles, preventing on one side the loss of maximum specific force while promoting muscle atrophy and fatigability, and increasing the proportion of fast-twitch fibers. We next demonstrate that a pharmacological treatment of dystrophic mdx mice with recombinant full-length OPG-Fc mitigates the loss of muscle force in a dose-dependent manner and preserves muscle integrity, particularly in EDL muscles. We also found that the full-length OPG-Fc has limited effects on slow-twitch soleus (Sol) muscles. However OPG-Fc potentiates the positive effects of a low dose of formoterol, a member of β2-agonists, and completely restores the function of the Sol dystrophic muscles. Finally, we investigated the mechanism by which the full-length OPGFc protects the dystrophic muscles. Structurally, the OPG protein contains four TNFR domains (RANKL), two death domains ( TRAIL) and a heparin-binding region. Our results indicate that anti-RANKL or anti-TRAIL or truncated OPG treatments (only TNFR domains) or RANK deletion are much less effective in preserving the strength of dystrophic muscles than full-length OPG-Fc. Surprisingly, the absence of extracellular Ca2+ significantly reduces the effects of full-length OPG-Fc on the force production of dystrophic muscles when incubated in a physiological bath in vitro. Confocal microscopy images showed that the full-length OPG-Fc binds directly to myotubes through a receptor that is currently unidentified activating possibly integrin-linked kinase (ILK) which upregulates sarco/endoplasmic calcium ATPase pump (SERCA-2a) expression in C2C12 myotubes. Heparinase, which cleaves heparin and heparin sulphate proteoglycan, or an inhibitor of ILK activity abrogates OPG-induced SERCA-2a expression, suggesting that OPG through ILK upregulates SERCA-2a expression, a key determinant of muscle performance. Overall, this thesis shed some light on RANK/RANKL/OPG functions in skeletal muscle which will potentially contribute to the development of new treatments for several forms of muscle and bone diseases.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie héréditaire récessive liée au chromosome X. Elle est causée par l’absence de la dystrophine dans les fibres musculaires. La thérapie cellulaire est l’une des approches thérapeutiques possibles, mais son succès dépend du contrôle du rejet des myoblastes greffés et des fibres musculaires hybrides. À présent, le contrôle du rejet est obtenu par l’administration d’immunosuppresseurs puissants. Notre objectif à long terme est de développer un protocole de tolérance immunologique qui permettrait de prévenir le rejet, sans recours à une immunosuppression soutenue. La première étape du protocole de tolérance immunologique que nous souhaitons développer est d’induire la formation de lymphocytes T régulateurs en utilisant le facteur de transcription Foxp3. Nos travaux nous ont permis de produire, dans des bactéries E. coli, la protéine de fusion Tat-Foxp3. Par des essais in vitro nous avons démontré l’augmentation de l’expression du récepteur CD25 sur les lymphocytes T CD4+ naïfs après transduction de la protéine Tat-Foxp3. Cela suggère que la protéine Tat-Foxp3 pourrait convertir les lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs. D’autres travaux seront nécessaires pour confirmer que ces cellules exprimant le CD25 sont vraiment des T régulateurs. / The Duchenne muscular dystrophy is the most common hereditary muscular disease. This disease is inherited as an X-linked recessive trait. It is caused by the absence of dystrophin in muscle fibers. Cell therapy is the potential treatment but, its success depends on the control of the rejection of the transplanted myoblasts and of the hybrid fibers that they formed. At present, the control of the graft rejection is achieved by administration of powerful immunosuppressive drug. Our long-term aim is to develop a protocol for immune tolerance that would prevent the graft rejection without sustained immunosuppression. The first step of this tolerance protocol that we want to develop is to induce the formation of regulatory T cells using the transcription factor Foxp3. In this study we generated, in bacteria E. coli, a fusion protein Tat-Foxp3. By in vitro assays, we demonstrated that Tat-Foxp3 protein up-regulated the expression of CD25 in naïve CD4+ T cells. Additional experiments will be required to confirm that these CD25 expressing cells are Treg.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie neuromusculaire affectant un garçon sur 3200. Cette maladie se caractérise par l'absence d'une simple protéine, la dystrophine, qui assure normalelnent l'intégrité des fibres musculaires. Sans cette protéine, les fibres musculaires sont plus facilement endommagées, provoquant une dégénérescence musculaire. Rapidement, les facultés locomotrices diminuent, confinant habituellement le patient à un fauteuil roulant vers l'âge de 10 ans. L'utilisation d' une assi stance respiratoire s'avère généralement nécessaire au début de la vingtaine et le décès peut survenir dès l'âge de 17 ans. Les patients atteignent rarement la trentaine. La thérapie cellulaire se situe parmi les traitements curatifs potentiels et consiste à implanter au patient dystrophique des myoblastes contenant le gène normal de la dystrophine. Évidemment, cette thérapie présente quelques inconvénients, dont une réaction immune du patient contre les myoblastes transplantés. C'est ici qu'interviennent les travaux présentés dans ce mémoire avec comme objectif principal d'utiliser les Iymphocytes T régulateurs (Tregs) afin de créer un protocole de tolérance non-toxique pour les patients dystrophiques. Jusqu 'à maintenant, nous avons réussi à isoler efficacement et de manière reproductible ces Tregs en utilisant une armada d'anticorps spécifiques. Plus précisément, nous avons actuellement une pureté moyenne se situant entre 90% et 95%. Par après, en démontrant l'expression du FoxP3 au sein de ces cellules, ces travaux prouvent hors de tout doute que les cellules purifiées sont des Tregs au sens propre du tenne. Finalement, par des essais in vitro, nous avons efficacement démontré que les Tregs isolés conservaient leur capacité immunorégulatrice. En effet, suite à une stimulation artificielle, les lymphocytes T CD4⁺ mis en co-culture avec un ratio de Tregs de 1:4 se divisent deux fois moins que ceux sans Tregs. Afin de conclure ces travaux, il reste deux étapes majeures avant de crier victoire. Premièrement, il faut réussir à multiplier des Tregs spécifiques afin d'en avoir un nombre suffisant et d'avoir une plus grande spécificité. Deuxièmement, il faudra les réintroduire chez un modèle animal afin de tester s' ils empêchent le rejet d' une greffe allogénique.

La transplantation de myoblastes (cellules précurseurs du muscle) est une thérapie potentielle prometteuse pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne. À ce jour, aucun traitement efficace n'existe pour cette maladie. Cette thérapie consiste en l'injection des cellules directement dans le muscle malade. Comme tous les autres types de transplantation allogénique, les myoblastes sont rapidement rejetés par le système immunitaire, mais le rejet peut être contrôlé par l'emploi soutenu d'immunosuppresseurs. L'utilisation de ces immunosuppresseurs serait idéale si ce n'était de leurs effets indésirables importants. Pour contourner ce problème, il est possible d'induire une tolérance immunologique envers les myoblastes transplantés. Cet état de tolérance peut-être induit par deux voies principales : la tolérance périphérique et la tolérance centrale. Plusieurs protocoles d'induction de tolérance périphérique et centrale ont été démontrés efficaces dans la littérature chez des modèles animaux et, dans certains cas, chez l'humain. Nous avons donc appliqué certains de ces protocoles d'induction de tolérance à la transplantation de myoblastes. Lors de cette étude, il est démontré que l'induction de tolérance périphérique, avec les protocoles utilisés, n'ont permis que la prolongation de la survie des myoblastes et qu'une modulation centrale du système immunitaire pourrait améliorer les résultats de survie. C'est pourquoi nous nous sommes tournés vers l'utilisation de protocoles non-myéloablatifs de greffe de moelle osseuse utilisant des anticorps monoclonaux bloquant les signaux d'activation des lymphocytes. Par le développement de chimérisme, nous avons démontré, pour la première fois, l'induction d'une tolérance robuste et spécifique à la transplantation de myoblastes, sans aucune immunosuppression soutenue. Cette démonstration montre que l'induction de tolérance par modulation centrale pourrait un jour être appliquée à un traitement de transplantation de myoblastes pour la dystrophie musculaire de Duchenne, améliorant ainsi l'espoir d'une qualité de vie meilleure pour ces jeunes malades.

Titre de l'écran-titre (visionné le 31 juillet 2023) / Depuis 2019, un nouvel outil biologique a le potentiel de faciliter le champ d'application du système CRISPR-Cas9. Le Prime editing utilise un pegRNA (prime editing guide RNA) et une protéine fusionnée (SpCas9n-RT) comprenant une transcriptase inverse (un synthétiseur de brin) et une SpCas9n (un coupeur de brin) pour éditer le génome sans nécessiter une cassure double de l'ADN. La protéine SpCas9n-RT reconnaît une séquence d'amarrage spécifique PAM (Protospacer Adjacent Motif) et le pegRNA, une séquence précise de 20 nucléotides qui peut être modifiée selon un modèle prédéterminé. Cette technologie semble être un candidat idéal pour de futures thérapies géniques visant les mutations ponctuelles en raison de sa capacité à corriger spécifiquement les mutations ponctuelles souhaitées tout en diminuant les mutations hors cibles en raison des étapes supplémentaires requises lors de l'édition. Dans un premier temps, la première partie de ce mémoire vise principalement à démontrer que le Prime editing est une avenue thérapeutique intéressante pour la dystrophie musculaire de Duchenne, soit en modifiant directement le gène de la dystrophine. Les expériences ont été réalisées sur des cellules HEK293T, puis sur des modèles murins. Nous avons déterminé que le gène de la dystrophine est facilement modifiable, et ce, efficacement sur des cellules HEK293T avec le Prime editing optimisé. La deuxième partie de ce mémoire est constitué d'un article traitant sur l'introduction de la mutation protectrice de l'Alzheimer (A673T) avec le Prime editing. Les expériences ont été réalisées sur des cellules HEK293T. Plusieurs techniques d'optimisation du système dérivé de CRISPR-Cas9 ont été comparées dans le but d'obtenir une édition génique efficace et avec un bas taux d'indels (insertion-deletion). Les résultats obtenus sur la dystrophie musculaire de Duchenne et la maladie d'Alzheimer seront des éléments importants dans le développement d'une approche unique, efficace et reproductible pour corriger différentes mutations ponctuelles responsables de milliers de maladies génétiques. / Since 2019, a new biological tool has the potential to facilitate the scope of the CRISPR-Cas9 system. Prime editing, consisting of a pegRNA (a guide for editing) and a fusion protein (SpCas9n-RT) including a reverse transcriptase (a strand synthesizer) and a SpCas9n (a strand cutter) enables editing of the genome without requiring a double DNA break. The SpCas9n-RT protein recognizes a specific PAM (adjacent protospacer motif) docking sequence and the pegRNA, a precise sequence of 20 nucleotides that can be modified according to a predetermined pattern. This technology appears to be an ideal candidate for future gene therapies targeting point mutations due to its ability to specifically correct desired point mutations while decreasing off-target mutations due to the additional steps required during editing. The first part of this thesis mainly aims to demonstrate that Prime editing is an interesting therapeutic avenue for Duchenne muscular dystrophy by directly modifying the dystrophin gene. The experiments were carried on HEK293T cells and then on mouse models. We have determined that the dystrophin gene was efficiently editable on HEK293T cells with the optimized Prime editing. The second part of this thesis consists of an article about the introduction of a protective mutation of Alzheimer's (A673T) with Prime editing. The experiments were carried on HEK293T cells. Several techniques for optimizing the CRISPR-Cas9-derived system were compared in order to obtain efficient gene editing with a low indel rate. The results obtained on Duchenne muscular dystrophy and Alzheimer's disease will be important elements in the development of a unique, effective and reproducible approach to correct various point mutations responsible for thousands of genetic diseases.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire héréditaire causée par des mutations dans le gène DMD codant pour la dystrophine, une protéine importante dans le maintien de l'intégrité de la membrane des fibres musculaires. L'absence de la dystrophine se manifeste par la dégénérescence progressive des fibres musculaires à l'effort. La DMD représente un fardeau pour les patients et leurs familles. Elle affecte environ 20 000 nouveaux nés de sexe masculin dans le monde chaque année. Il existe plusieurs approches thérapeutiques allant du ciblage de l'ARNm au remplacement ou substitution de la dystrophine. Cependant, ces traitements sont transitoires et induisent des améliorations phénotypiques limitées. La découverte il y a une dizaine d'années du système CRISPR-Cas a ouvert des possibilités presque illimitées en biologie. Ce système a été modifié et adapté en 2019 pour développer le Prime editing, une technologie dynamique de modification du génome. Cette technologie permet de faire une interconversion de tout nucléotide du génome, des insertions ou des délétions de nucléotides. Le système d'édition est constitué d'un plasmide éditeur (PE2) fait d'une Cas9 nickase fusionnée à une transcriptase inverse et d'un plasmide contenant un ARN guide pour le Prime editing (pegRNA) contenant une séquence espaceur, une séquence d'amorçage et une matrice pour la transcriptase inverse (RTT). Notre étude visait donc à utiliser cette technologie CRISPR-Cas9 Prime editing pour développer une approche de traitement permanent de la DMD. Les deux premiers chapitres de cette thèse présentent de façon approfondie l'état de la littérature actuelle sur les différentes approches thérapeutiques de la DMD. Le premier chapitre décrit les stratégies moléculaires médiant la restauration de la dystrophine. Ces approches incluent la lecture à travers les codons, les sauts d'exons, la modification de l'ADN par la technique CRISPR, la modulation des progéniteurs, le remplacement et la substitution du gène DMD ainsi que la transplantation cellulaire. Le deuxième chapitre apporte plus de détails et de précisions sur les approches CRISPR en développement pour la DMD permettant ainsi de mieux comprendre la pertinence de notre choix technologique (CRISPR-Cas9 Prime editing) pour l'approche que nous avons développé dans cette thèse. Le troisième chapitre de cette thèse vise à démontrer la capacité du Prime editing à introduire ou corriger des mutations ponctuelles dans le gène DMD et permettre l'expression de la protéine dystrophine complète. Initialement, nous avons conçu plusieurs pegRNAs pour introduire les mutations nonsenses présentes dans la population canadienne dans les exons 6, 9, 20, 35, 43, 55 et 61 du gène DMD. Suite à des taux d'édition très faibles variant entre 2 et 10%, plusieurs optimisations dont, les traitements répétés consécutifs, l'usage d'un guide supplémentaire pour induire une autre coupure de l'autre brin d'ADN à distance du site de coupure initial, et l'ajout d'une mutation simultanée dans la séquence adjacente au protoespaceur (PAM) pour préserver la mutation induite, ont permis d'augmenter jusqu'à 5,8 fois le taux d'édition. Ces stratégies ont permis par la suite de corriger la mutation c.428 G>A dans l'exon 6 des myoblastes d'un patient suivi par l'expression de la dystrophine détectée par western blot à partir des protéines provenant de la fusion des myoblastes en myotubes. Le séquençage haut débit analysé par CRISPResso2 a montré un taux d'INDEL inférieur à 1%. Le quatrième chapitre de cette thèse vise à démontrer la capacité du Prime editing à corriger efficacement la mutation c.8713C>T dans l'exon 59 du gène DMD dont la position à +13 nucléotides du site de coupure la rend défavorable pour la correction par Prime editing. Plusieurs variants de PE2 ont été testés et le meilleur variant (SpCas9-NGG) a été choisi pour la suite des expériences. Ajoutées aux optimisations du chapitre 3 précédent, la variation de la longueur du RTT et des mutations synonymes supplémentaires à différentes positions de la cible ont permis d'augmenter jusqu'à 7 fois le taux d'édition. Cette autre stratégie a été utilisée pour la correction de la mutation c.8713C>T dans l'exon 59 des myoblastes d'un patient à un taux de 22% suivi par l'expression de la dystrophine (42%). Le cinquième chapitre de cette thèse a permis de démontrer la capacité du Prime editing à effectuer en plus des substitutions, des délétions et des insertions de nucléotides dans les sites d'épissages afin de médier un saut d'exon et restaurer l'expression de la dystrophine. La stratégie consistait à corriger dans les myoblastes de patients, les mutations causées par les délétions de l'exon 52 et des exons 45-52 en modifiant respectivement les sites donneurs d'épissage des exons 51 et 53 pour les éliminer. Cela a permis la jonction respective de l'exon 50 à l'exon 53 et de l'exon 44 à l'exon 54 pour les délétions 52 et 45-52 respectivement. Ces modifications des sites d'épissage ont permis l'expression de la protéine dystrophine. Ces résultats sont une preuve de principe et démontrent le potentiel de notre approche à modifier efficacement le gène DMD pour médier la restauration de l'expression de la dystrophine chez les patients DMD. Cependant, il sera important de développer un système de livraison efficace en utilisant par exemple un vecteur Dual-AAV ou des particules virales VLPs ayant respectivement des capsides ou des glycoprotéines spécifiques des muscles squelettiques et cardiaques pour un essai in vivo de ces stratégies. Il sera également pertinent de développer une approche Prime editing multiplexe afin de cibler simultanément plusieurs mutations du gène DMD et examiner les effets hors cibles et immunologiques de cette dernière. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an inherited neuromuscular disease caused by mutations in the DMD gene encoding dystrophin, a protein involved in maintaining muscle fibers membrane integrity. The absence of dystrophin leads to a progressive muscle wasting due to muscle contractions. DMD represents a burden for patients and their families. It affects approximately 20,000 newborn males worldwide each year. There are several therapeutic approaches ranging from mRNA targeting to dystrophin replacement or substitution. However, these treatments are transient and induce limited phenotypic improvements. The discovery a decade ago of CRISPR-Cas system opened almost unlimited possibilities in biology. This system was modified and adapted in 2019 to develop the Prime editing, a dynamic genome editing technology. That technology makes possible the interconversion of any nucleotide of the genome, and the insertions or deletions of nucleotides. The editing system consists of a prime editor plasmid (PE2) made of a Cas9 nickase fused to a reverse transcriptase and a plasmid encoding a Prime editing guide RNA (pegRNA) containing a spacer sequence, a primer binding site (PBS) sequence and a reverse transcriptase template (RTT). Our study therefore aimed to use this CRISPR-Cas9 Prime editing technology to develop a permanent treatment approach for DMD. The first and second chapters of this thesis present in depth the state of the current literature on the different DMD therapeutic approaches. The first chapter describes the molecular strategies involved in the dystrophin restoration. These approaches include read through codon, exon skipping, CRISPR DNA editing, progenitor modulation, DMD gene replacement or substitution, and cell transplantation. The second chapter provides more details and precisions on the CRISPR approaches in development for DMD, thus allowing a better understanding of the relevance of our technological choice for the approach that we have developed in this thesis. The third chapter of this thesis aims to demonstrate the ability of Prime editing to introduce or correct point mutations in the DMD gene and restore the expression of the dystrophin protein. We initially designed several pegRNAs to induce the nonsense mutations present in the Canadian population in exons 6, 9, 20, 35, 43, 55 and 61 of the DMD gene. Following very low editing rates varying from 2 to 10%, several optimizations including consecutive repeated treatments, the use of an additional sgRNA to induce a second nick at a distance from the initial nick site, and the simultaneous mutation in the protospacer adjacent motif (PAM) to preserve the induced mutation, permitted to increase by 5.8-fold the editing rate. These strategies subsequently made possible to correct the c.428 G>A mutation in exon 6 of a patient's myoblasts. That was followed by dystrophin expression detected by western blot from proteins coming from the fusion of the myoblasts in myotubes. High-throughput sequencing analyzed by CRISPResso2 showed an INDEL rate less than 1%. The fourth chapter of this thesis aims to demonstrate the ability of Prime editing to efficiently correct the c.8713C>T mutation in exon 59 of the DMD gene whose position at +13 makes it unfavorable to the correction by Prime editing. Several PE2 variants were tested, and the best variant (SpCas9-NGG) was chosen for further experiments. Added to the optimizations of the previous chapter 3, varying the RTT length and additional synonymous mutations at different positions beside the target increased the editing rate by 7-folds. This other strategy was used for the correction of the c.8713C>T mutation in exon 59 of a patient's myoblasts at the editing rate of 22% followed by the dystrophin expression (42%). The fifth chapter of this thesis has demonstrated the ability of Prime editing to perform in addition to substitutions, deletions, and insertions of nucleotides in the splice sites to mediate exon skipping and restore the dystrophin expression. The strategy consisted of correcting in patient myoblasts, the mutations caused by the deletions of exon 52 (Del52) and exons 45-52 (Del45-52) respectively by modifying the splice donor sites of exons 51 and 53 for their skipping. This allowed the binding of exon 50 to exon 53 and exon 44 to exon 54 respectively for Del52 and Del45-52 permitting the expression of the dystrophin protein. These results are a proof of concept and demonstrate the potential of our approach to effectively modify the DMD gene to mediate the dystrophin restoration in DMD patients. However, it will be important to develop an efficient delivery system using for example a Dual-AAV vector or virus like particles (VLPs) with skeletal and cardiac muscle-specific capsids or glycoproteins, respectively, for in vivo experimentation of these strategies. It will also be relevant to develop a multiplex Prime-editing approach to simultaneously target multiple DMD gene mutations and examine the off-target and immunological effects.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie récessive causée par l'absence d'une protéine, la dystrophine. Notre laboratoire travaille sur un traitement potentiel qui consiste à remplacer la protéine manquante en transplantant des myoblastes normaux ou génétiquement modifiés dans le muscle du patient atteint. Par contre, cette technique comporte des limitations; la mort cellulaire précoce, la faible dispersion ainsi que le rejet immunitaire nuisent à son succès. Ce projet de maîtrise vise à améliorer la greffe de myoblastes grâce à l'utilisation de l'epigallocatechin-gallate (EGCG), une composante majeure du thé vert. Récemment, il a été rapporté que l'inhibition de RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products) mène à une augmentation de la prolifération et de la migration et à une diminution de la différenciation et de la mort par apoptose des myoblastes [3]. L'EGCG, reconnu pour ces propriétés anti-oxydantes, pourrait en plus d'aider à réduire le stress oxydatif et l'inflammation causés lors de la transplantation, permettre une amélioration de la survie des myoblastes transplantés puisqu'elle pourrait avoir un effet sur l'expression du récepteur RAGE [4]. Nous nous sommes donc intéressés à l'effet de l'EGCG sur RAGE dans le contexte de la greffe de myoblastes. Notre hypothèse est donc que l'EGCG pourrait inhiber transitoirement l'expression de RAGE et augmenter la prolifération et la migration et diminuer la fusion et la mort par apoptose des myoblastes transplantés pour ainsi améliorer le succès de greffe. Nous avons confirmé que l'EGCG pouvait diminuer le niveau d'expression de RAGE dans les myoblastes et dans les muscles de souris. Nous avons obtenu une augmentation de la survie des myoblastes lorsque confrontés à un stress tel que la glucose oxydase. Nous avons aussi remarqué une diminution de la fusion des myoblastes in vitro mais malheureusement, nous ne pouvons confirmer l'augmentation du succès de greffe. Un test de migration pourrait être effectué pour vérifier l'effet de l'EGCG sur la migration des myoblastes ainsi qu'une autre expérience pour confirmer le succès de greffe.

La dystrophie musculaire de Duchenne est caractérisée par une dégénérescence musculaire progressive accompagnée d’une fragilité osseuse exacerbée par la norme de soins actuelle. Au-delà de la relation mécanique qui unit leur croissance, maintenance ou dégénérescence, les muscles et les os interagiraient à l’échelle moléculaire via des sentiers signalétiques communs. La voie RANK/RANKL/OPG, un gouverneur du remodelage osseux, est au nombre de ces voies suite à la découverte de la triade en contexte musculaire, de la capacité des cellules musculaires à sécréter de l’OPG, de la localisation du récepteur RANK au sarcolemme et de l’effet inotropique de la délétionmusculaire de RANK sur l’atrophie induite par dénervation. Élément déterminant, le bénéfice musculaire d’un traitement au FL-OPG-Fc, protagoniste de la triade fusionnée à un fragment Fc, est supérieur aux stratégies pharmacologiques ou génétiques d’inhibitionde RANK/RANKL pour la souris dystrophique et suggère un effet biologique hors-triade. Malgré ces évidences morcelées et compte tenu de la structure du FL-OPG-Fc, un potentiel mécanisme d’action musculaire est inconnu. Ce mécanisme constitue l’idée originale de cette thèse et nécessite investigation à l’aide d’un modèle pré-clinique prédictif et fidèle au déroulement de la pathologie. Le but de cette thèse est 1) caractériser à différents stades de vie les propriétés fonctionnelles et contractiles d’un nouveau modèle dystrophique pré-clinique murin ainsi que les paramètres discriminants par rapport à la souris sauvage, 2) mettre à jour les connaissances sur la cohésion signalétique ainsi que le dialogue moléculaire bidirectionnel muscle-os en contexte de dystrophie musculaire et 3) investiguer la capacité du FL-OPG-Fc à interagir directement avec les cellulesmusculaires, en explorer la signalisation cellulaire puis vérifier la présence d’un effet bénéfique aigu sur la contractilité de muscles dystrophiques. Premièrement, nos recherches sur le nouveau modèle ont démontré que l’haploinsuffisance en utrophine dans la souris délétée en dystrophine n’a pas d’impact sur sa performance fonctionnelle et contractile à 1, 2 et 5 mois d’âge. Ces données ont permis d’établir que la souris déficiente en dystrophine était pertinente pour nos études,moyennant l’utilisation préférentielle de variables expérimentales discriminantes par rapport à la souris sauvage telles que la force maximale spécifique et la résistance aux contractions excentriques. Deuxièmement, en ce qui a trait aux voies communes et aux dialogues muscle-os en contexte de dystrophie musculaire, nos travaux de synthèse ont répertorié des interactions basées sur des myokines, ostéokines et cytokines de double origine déclenchant des sentiers signalétiques menant entre autres à l’inflammation, la fibrose, la synthèse ou la dégradation protéique. Collectivement, les sources citées par notre ouvrage soulignent l’importance de considérer les muscles et les os en tant qu’unité pour orienter les recherches précliniques vers le développement d’approches multifonctionnelles efficaces à traiter ces affections musculaires et osseuses de manière simultanée. Troisièmement, nos travaux de recherche ont montré que le FL-OPG-Fc peut directement associer et influencer le muscle squelettique grâce à son domaine de liaison à l’héparine tant pour les fibres saines que celles déficientes en dystrophine, et ce, au moins en partie de manière indépendante du récepteur RANK. Puis, cette liaison musculaire peut engendrer une cascade de signalisation cellulaire incluant les protéines FAK/Akt/CaMKII/PLN. Concrètement, nos résultats ont indiqué que le FL-OPG-Fc peut avoir un effet protecteur dans les cellules musculaires contre les dommages causés par une surcharge calcique. Finalement, le FL-OPG-Fc peut avoir un effet potentiateur sur les contractions tétaniques des muscles dystrophiques de phénotype rapide, effet nécessitant la présence du domaine de liaison à l’héparine pour s’opérer. Globalement, cette thèse apporte une contribution à l’avancement des connaissances sur le développement scientifique de modèles précliniques de DMD, sur les sentiers communs aux muscles et aux os, sur l’existence ainsi que le domaine de l’interaction du FL-OPG-Fc directement sur les cellules musculaires et sur une des voies de signalisation potentielles par laquelle le FL-OPG-Fc peut les influencer. Ces avancées biologiques repoussent les connaissances au sujet de la voie RANK/RANKL/OPG au sein de la communication muscle-os. Ces résultats peuvent également être mis en perspective de situations physiologiques comme la croissance, la maintenance et l’homéostasie, où ce dialogue pourrait s’exprimer dans la régulation réciproque du muscle et de l’os. Finalement, les connaissances générées au sujet de la protéine OPG pourront contribuer à la compréhension des rôles hors-triade de l’OPG répertoriés pour de multiples types cellulaires non-osseux.

Les myopathies inflammatoires sont des maladies acquises caractérisées par un déficit moteur impliquant une atteinte musculaire auto-immune. Elles sont responsables d'un handicap invalidant et peuvent s'accompagner de complications engageant le pronostic vital. Les traitements, quand ils existent, reposent sur l'utilisation de corticoïdes à fortes doses et au long cours. Cependant, 60% des patients rechutent et 20 à 30 % sont d'emblée corticorésistants. D'autres traitements immunosuppresseurs sont alors nécessaires. Les effets secondaires de ces traitements sont inévitables et parfois sévères. Afin de tester des nouvelles approches, le laboratoire a développé un modèle de Myosite Auto-immune Expérimentale dont les caractéristiques sont similaires à celles de la polymyosite. Dans ce modèle nous avons testé l'effet d'une sous population lymphocytaire T, appelée les lymphocytes T régulateurs, joue un rôle déterminant dans la tolérance périphérique aux antigènes du soi. Afin de contrôler les manifestations auto-immunes, nous avons cherché à les amplifier les Tregs in vivo, pharmacologiquement. D'abord, nous avons observé l'effet bénéfique de la rapamycine sur la sévérité de notre modèle en permettant en particulier d'augmenter le pourcentage de Tregs. Dans un second temps, nous avons montré le rôle bénéfique des immunoglobulines en intraveineux dans ce même modèle en traitement curatif. Enfin, nous nous sommes intéressés à l'effet de l'arsenic trioxyde (Trisenox) dans ce modèle animal.Ainsi, l'ensemble ces données permettent de mieux comprendre la physiopathologie des myosites et de mettre au point un essai clinique avec la rapamycine. / Inflammatory myopathies are acquired diseases characterized by motor deficit involving an autoimmune myopathy.They are responsible for impairing disability and may be associated with life-threatening complications.Treatment, when they exist, based on the use of corticosteroids in high doses and for long periods.However, 60 % of patients relapse and 20-30 % are readily corticosteroid.Other immunosuppressive treatments are then required (methotrexate , azathioprime , cyclosporine).The side effects of these treatments are inevitable and sometimes severe, which is why the development of new approaches treatment is essential. To test these new approaches, the laboratory developed a mouse model of Experimental Autoimmune Myositis with same Clinical and histological characteristics to polymyositis.In this model we tested the effect of a sub-population of T lymphocyte, nammed regulatory T cells, plays a crucial role in peripheral tolerance self-antigens. In order to control autoimmune manifestations that can replicate the mechanisms of action of Tregs , we sought to amplify in vivo, pharmacologically.At first, we observed the beneficial effect of rapamycin on our model, notably with increase of Tregs.In a second step, we have shown the beneficial role IVIg in the same model in curative.Finally, we investigated the effect of arsenic trioxide ( Trisenox ) in this animal model.Thus, all these data provide insight into the pathophysiology of myositis and to develop a clinical trial with rapamycin .

Le couplage excitation-contraction (EC) du muscle squelettique correspond à l’efflux de Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique (RS) suite à une dépolarisation sarcolemmale. Des mutations dans les gènes MTM1 et DNM2 sont responsables respectivement de la forme sévère et modérée de la myopathie centronucléaire (CNM). Chez la souris Mtm1 KO, l’absence de la (PtdInsP) 3-phosphatase MTM1 est associée à une altération du couplage EC, propablement la cause majeure de la faiblesse musculaire. Le rôle du PdtIns(4,5)P2 dans la régulation du couplage EC a été étudié dans des fibres musculaires exprimant une PtdInsP phosphatase sensible au potentiel. Grâce à une combinaison d’électrophysiologie et d’imagerie confocale, nous avons montré une altération de l’efflux calcique en réponse à de fortes dépolarisations déplétant les stocks de PdtIns(4,5)P2 à la membrane.Dans un deuxième temps, une caractérisation complète des défauts de signalisation calcique et du couplage EC a été réalisée dans les fibres musculaires isolées de souris Mtm1 KO. Nos résultats indiquent que l’efflux calcique est d’amplitude réduite, est retardé et est spatialement hétérogène. L’inhibition pharmacologique de l’activité PtdInsP 3-kinase améliore ces défauts in vitro et la survie des souris in vivo, suggérant que l’accumulation des substrats de MTM1 participe au défaut du couplage EC. Ces résultats montrent le bénéfice thérapeutique d’une approche pharmacologique aux inhibiteurs d’activité PtdInsP 3-kinase.Enfin, nous avons montré que les fibres musculaires d’un modèle murin de la forme modérée de CNM (KI-Dnm2R465W) partagent certaines altérations du couplage EC avec le modèle Mtm1 KO (retard de l’efflux calcique) pouvant contribuer à la faiblesse musculaire. Cependant, d’autres défauts (altérations structurales, réduction de l’efflux calcique) affectent plus sévèrement le modèle Mtm1 KO, et pourraient être déterminants dans la différence de sévérité entre les deux formes de CNM / Excitation-contraction (EC) coupling is the process whereby a membrane depolarization leads to an increased cytosolic Ca2+ content, allowing contraction. Mutations in the genes MTM1 and DNM2 are responsible respectively for severe and moderate forms of centronuclear myopathy (CNM). In Mtm1 KO mouse model, MTM deficiency is associated with defective EC coupling, which makes probably the major contribution to muscle meakness.PdtIns(4,5)P2 involvement in regulating EC coupling has been investigated in muscle fibers expressing a voltage sensing PtdInsP phosphatase. Thanks to a combination of electrophysiology and confocal imaging techniques, we showed a reduction of SR Ca2+ release amplitude in response to strong depolarizations activating PdtIns(4,5)P2 depletion at plasma membrane.Secondly, we made a complete characterization of calcium signaling and EC coupling properties in isolated muscle fibers from Mtm1 KO mice. Our results demonstrate that SR Ca2+ release is depressed, delayed and spatially heterogeneous in diseased fibers. Moreover, we showed that pharmacological inhibition of PtdInsP 3-kinase activity improves these defects in vitro and mice survival in vivo, suggesting that accumulation of MTM1 substrates may participate to defective EC coupling. Overall, these results provide proof of concept for the use of PtdIns 3-kinase inhibitors in severe form of CNM.Finally, we showed that muscle fibers from murine model of moderate CNM form (KI-Dnm2R465W) share some of EC coupling defects with Mtm1 KO model (delayed SR Ca2+ release) that may contribute to muscle weakness. However, other defects (structural alterations, depressed SR Ca2+ release) affect more severely Mtm1 KO model, and may be critical in determining the severity of CNM