La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative caractérisée par plusieurs symptômes moteurs, cognitifs et psychiatriques, causés par une expansion du trinucléotide CAG présent dans le gène huntingtine. L’expression de la protéine correspondante mène éventuellement à un dysfonctionnement et une mort cellulaire. OBJECTIFS: À ce jour, il n’existe pas de thérapies efficaces afin de traiter ou ralentir la MH, mais les essais actuels suggèrent qu’une réduction de la quantité de protéines mutantes pourrait être bénéfique. Dans cette étude, il a été question d’utiliser le système CRISPR/Cas9. Grâce à l’utilisation de l’enzyme Cas9, cette technologie d’édition du génome bien précise permet de cibler et corriger une mutation génétique; ce qui permettrait dans le cas de la MH de réduire le gène causant la pathologie. MÉTHODE : Un modèle de souris MH et un modèle contrôle sauvage, âgés de 12 mois, ont reçu des injections stéréotaxiques intracérébrales de virus AAV9 contenant la Cas9D10A et/ou l’ARN guide (SgCTG/eGFP). Des tests cognitifs et moteurs ont été effectués pendant 3 mois après les injections virales. Des tissus et du sang ont été récoltés lors du sacrifice des animaux. Les échantillons de cerveaux ont été analysés par immunofluorescence et par western blot pour déterminer le degré de contraction ainsi que le niveau d’expression et de colocalisation de la Cas9D10A et de l’ARN guide. RÉSULTATS: Une amélioration de certains comportements est notable après 3 mois post-injection chez les souris MH traitées avec les deux constructions. Les analyses biochimiques ont permis de détecter l’expression des deux vecteurs et une réduction de la quantité de protéines mutées. CONCLUSION : CRISPR/Cas9 pourrait potentiellement être utilisé pour réduire la quantité de protéines mutées et améliorer certains comportements cognitifs et moteurs. Une optimisation de l’utilisation de cette technologie pourrait mener à une thérapie intéressante pour la MH / Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative disorder characterized by a triad of motor, cognitive and psychiatric symptoms which results from an expansion of the CAG tract in the huntingtin gene. This mutation encodes for a longer polyglutamine stretch in the mutant huntingtin protein. Expression of the mutant protein eventually leads to cell dysfunction and death. OBJECTIVE: To this day, there is no disease-modifying therapy available for HD, but ongoing trials suggest that reducing the amount of the mutant protein could be beneficial. In this study we used the CRISPR/Cas9 system, a precise gene editing technology which can be directly employed with its partner enzyme, Cas9, to specifically target and correct genetic mutations, to shrink the causative mutation associated with HD. METHODS: A mice model of HD and littermate controls were aged to 12 months prior to undergoing stereotaxic intracerebral injections of AAV9 viruses containing either Cas9 D10A nickase and/or guide RNA (SgCTG/eGFP) targeted to the CAG expansion. Cognitive and motor testing were performed for 3 months after viral infection. Tissues and blood were collected at the completion of the protocol. Brain samples were analysed using immunofluorescence and western blotting to determine the degree of contraction achieved and the degree of expression and colocalization of GFP (guide RNA) and HA tags (Cas9D10A). RESULTS: Mild behavioural improvements were detected 3 months after co-administration of the two viral constructs to HD mice. Importantly, biochemical studies detected expression of both the guide RNA and the Cas9 in addition to a reduction in the amount of mHTT detected in HD mice receiving both viruses. CONCLUSION: CRISPR/Cas9 can be used to reduce the amount of mHTT and this is associated with improvements in cognitive and fine motor deficits. Further optimization of this technology could lead to a clinically relevant therapy.

Les bactériophages sont des maîtres manipulateurs, prenant le contrôle complet d'une cellule bactérienne, contournant les systèmes de défense et détournant la machinerie de transcription et de traduction du génome bactérien pour la réplication virale. Les grandes étapes de la multiplication des phages sont connues, pourtant les mécanismes intrinsèques de cette prise de contrôle restent un mystère bien préservé. Malgré la petite taille et la simplicité relative des génomes de phages, seuls les gènes associés à la structure des virions sont amplement caractérisés. Toutefois, les protéines non structurales qui sont susceptibles d'être responsables de la prise de contrôle sont rarement étudiées. C'est effectivement le cas pour le phage modèle 2972, infectant la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 largement utilisée en industrie laitière. Son génome code pour 44 protéines putatives, dont 14 protéines sont classées comme étant non structurales et dont aucune fonction n'est encore associée. Lors de ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de type II-A, naturellement présent chez S. thermophilus, a été utilisé à des fins d'édition du génome de ce phage pour étudier le rôle des protéines non structurales. Ce système est idéal pour les manipulations génétiques des phages virulents généralement complexes à modifier. Ainsi, une connaissance approfondie des interactions entre le phage et son hôte sera un outil indispensable pour développer de meilleures méthodes de contrôle des phages en industrie laitière. / Bacterial viruses are master manipulators of bacterial cells. They are able to take complete control of a bacterium, bypassing bacterial immune systems, hijacking core transcription and translation machinery, and typically resulting in lysis of the host. Although the major steps of phage replication are well understood, very little is known about the mechanisms of the host-cell takeover. Despite phages having relatively small and 'simple' genomes, generally only the structural proteins have been well characterized. In contrast, non-structural proteins, which include those involved in host cell takeover, tend to be completely uncharacterized. This is certainly the case for the model of Streptococcus thermophilus phages, 2972, which infects the strain DGCC7710 widely used by the dairy industry. Its genome encodes for 44 putative proteins, 14 of which are non-structural and have no known function. In this master thesis, the type II-A CRISPR-Cas system naturally present in S. thermophilus was used for genome engineering purposes to investigate the role of non-structural proteins of phage 2972. This natural bacterial immune system provides an ideal means for genetic manipulation of virulent phages, which are otherwise intractable. This could lead to potentially valuable discoveries allowing us to further fine-tune the bacteria used in various biological processes.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / Les techniques d'édition du génome telles que CRISPR-Cas9, permettant l'introduction ciblée de modifications génétiques, offrent de nombreuses possibilités de développement d'outils de recherche ainsi que d'applications thérapeutiques. Dans le cadre de mes travaux effectués en co-direction à Héma-Québec, je me suis intéressée au potentiel de CRISPR-Cas9 en lien avec le système hématopoïétique et plus particulièrement en lien avec les globules rouges. Premièrement, j'ai exploré dans le chapitre 1 la modification spécifique de groupe sanguins qui est d'intérêt pour augmenter les possibilités transfusionnelles. Des globules rouges (GRs) de groupe sanguin rare Rhnull ont été créés en supprimant le gène RHAG des cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec CRISPR-Cas9, suivi d'une différentiation érythrocytaire in vitro. Ce groupe sanguin pourrait théoriquement être utilisé pour transfuser des individus ayant n'importe quel variant Rh, en plus d'être utile en tant que réactif de sérologie. Le gène ABO a aussi été supprimé des CSH de groupe A, pour produire des GRs de groupe O. L'absence d'expression résiduelle des antigènes de type A obtenue à partir des CSH hétérozygotes A/O pourrait permettre de futures applications transfusionnelles comme des cas de donneur/receveur compatibles pour des phénotypes rares mais incompatibles pour le système ABO. Ensuite, un aspect prometteur du système CRISPR-Cas9 étant la correction thérapeutique de maladies génétiques, les greffes autologues de CSH génétiquement modifiées par cette technologie font l'objet de plus en plus d'études cliniques. Dans ce contexte, j'ai travaillé sur la modélisation in vitro de variants génétiques avec comme preuve de concept l'anémie falciforme puisque cela pourrait contribuer à l'étude des répercussions potentielles de l'édition du génome sur les CSH et les GRs, et complémenter les études cliniques. Une récapitulation complète de l'érythropoïèse in vitro jusqu'à la production de GRs matures a été considérée pertinente pour une caractérisation plus fidèle à la réalité de phénotypes érythrocytaires, pour étudier l'impact de divers variants sur les GRs, en plus d'être avantageuse dans l'optique de futures transfusions. La production de GRs in vitro est un objectif important en médecine transfusionnelle depuis plusieurs années et il est possible de reproduire l'érythropoïèse in vitro à partir de plusieurs sources cellulaires, dont les CSH. Cependant, les protocoles publiés à ce jour mettent peu l'accent sur l'étape de maturation finale des réticulocytes en GRs matures, analogues à ceux retrouvés en circulation, ou requièrent l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières. Or, l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières pourrait restreindre de potentielles applications pertinentes du modèle comme les transfusions et l'édition génétique ex vivo. Dans un premier temps, j'ai développé dans le chapitre 2 un protocole de culture cellulaire permettant une maturation accrue des réticulocytes en GRs in vitro ainsi qu'une maximisation de leur survie en culture durant cette étape, dans un milieu ne contenant aucun composé animal, cellules accessoires ou cellules nourricières. Les GRs obtenus ont un phénotype similaire à celui des GRs produits par le corps humain et ils peuvent être conservés en solution nutritive pendant 42 jours comme pour les GRs récoltés de dons de sang. Dans un second temps, j'ai optimisé dans le chapitre 3 un protocole d'édition avec CRISPR-Cas9 compatible avec la clinique, sans vecteur viral et sans sélection, dans le but d'être combiné à la production de GRs. L'introduction à une fréquence élevée de la mutation causant l'anémie falciforme, notamment de manière bi-allélique, dans des CSH suivie de la différenciation complète en GRs a permis de générer des GRs adoptant la forme caractéristique en faucille après exposition à des niveaux d'oxygène physiologiques, récapitulant ainsi l'anémie falciforme in vitro. De plus, un sous-produit d'édition produisant un variant de globine beta qui semble exprimé à des niveaux significatifs dans les GRs est présent à la suite du ciblage de la mutation dans le gène de la globine beta. La présence de ce variant mérite attention dans l'optique du développement thérapeutique pour l'anémie falciforme. En conclusion, les procédures optimisées de culture de GRs et de modifications génétiques avec CRISPR-Cas9 présentées dans cette thèse peuvent être combinées de différentes façons afin de fournir une plateforme d'étude de variants érythrocytaires in vitro, en plus de contribuer aux efforts vers la transfusion de GRs produits in vitro et d'accompagner les thérapies d'édition génétique arrivant en clinique. / Genome editing techniques, such as CRISPR-Cas9, allowing the introduction of targeted genetic modifications, offer numerous research tool possibilities and potential cellular therapies. As part of my work done in co-direction at Héma-Québec, I became interested in the potential of CRISPR-Cas9 in relation to the hematopoietic system and more particularly in relation to red blood cells. First, I explored in chapter 1 specific blood type modifications that are of interest in increasing transfusion opportunities. Rhnull cultured red blood cells (cRBCs) were produced by deleting RHAG gene in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with CRISPR-Cas9, followed by in vitro erythroid differentiation. These red blood cells (RBCs) could theoretically be used to transfuse all Rh types, in addition to their relevance as RBC reagents for serology laboratories. ABO gene was also deleted in type A HSPCs to produce type O RBCs. The absence of residual A antigen expression when starting with heterozygotes A/O donors could allow future transfusion applications like cases of individuals compatible for rare phenotypes but frustratingly not for ABO. Then, a promising aspect of the CRISPR-Cas9 system being the therapeutic correction of genetic diseases, autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplants genetically modified by this technology are the subject of more and more clinical studies. In this context, I worked on the in vitro modeling of genetic variants with sickle cell anemia (SCA) as proof of concept since it could contribute to the efforts aiming at studying and understanding potential side effects of genome editing on HSCs and RBCs, and complement clinical studies. The complete recapitulation of erythropoiesis in vitro, including terminal RBC maturation, was considered essential for the faithful characterization of erythroid phenotypes, for studying the impact of genetic variants on RBCs, in addition to being beneficial for future transfusion purposes. Production of cRBCs has been a major objective in the field of transfusion medicine for several years and erythropoiesis can be reproduced in vitro starting with several cell sources, one of which being HSPCs. However, current protocols do not focus on the process of reticulocyte maturation into RBCs, analogous to those found in the circulation, or they require accessory or feeder cells. Of note, accessory or feeder cells could restrict potentially relevant applications of the model like transfusions or ex vivo genome editing. First, I developed in chapter 2 a cell culture protocol allowing an increased maturation of reticulocytes into RBCs in vitro as well as a maximization of their survival in culture, using an animal component-free, accessory-free, and feeder-free medium. The resulting cRBCs had a similar phenotype as native RBCs and they could be stored for 42 days like RBCs collected from blood donations. Second, I optimized a virus-free and selection-free CRISPR-Cas9 strategy compatible with the clinic to use it in combination with cRBCs production. High efficiency introduction of the SCA-causing mutation, notably bi-allelic introduction, followed by mature cRBCs production yielded cells acquiring the characteristic sickled shape after exposition to physiological oxygen levels, thereby recapitulating SCA in vitro. Furthermore, an editing by-product giving rise to a beta globin variant seemingly expressed at significant levels in RBCs was present following the targeting of the mutation in the beta globin gene. The presence of this beta globin variant thus deserves further attention in the context of therapeutic development for SCA. To conclude, optimized procedures of RBCs' culture and CRISPR-Cas9-mediated genome editing presented in this thesis can be combined in several ways to provide a platform for the study of erythroid variants in vitro, in addition to contributing to the efforts towards future cRBCs transfusion and accompanying the coming gene editing therapies.

Le large éventail d'applications du système CRISPR-Cas a conduit à des innovations biotechnologiques qui sont sur le point de transformer l'industrie pharmaceutique actuelle. Néanmoins, l'atteinte d'un haut niveau d'efficacité à un gène cible reste encore aujourd'hui un défi pour l'édition du génome. Ceci est dû principalement à la capacité encore limitée de modifier tous les sites du génome humain, tout comme le faible taux de recombinaison homologue obtenu chez les cellules de mammifères. Ainsi, l'optimisation des processus de modification génique s'avère indispensable pour favoriser les diverses utilisations de l'édition du génome. Dans cette thèse, il a été question de (i) développer une méthode d'enrichissement de cellules génétiquement modifiées et (ii) augmenter la polyvalence de l'édition du génome en augmentant la plage de ciblage du système CRISPR-Cas9 dans le génome humain. L'objectif de la première partie de cette thèse visait à étudier la fonctionnalité du gène ATP1A1, codant pour la pompe sodium/potassium (Na⁺/K⁺ ATPase), comme marqueur endogène de l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons modifié la sensibilité de cette pompe pour l'ouabaïne en insérant des mutations dominantes dans le locus ATP1A1, ce qui a permis de générer des cellules résistantes à l'ouabaïne. La capacité de multiplexage du système CRISPR-Cas permet de co-cibler simultanément ATP1A1 et le locus d'intérêt, où il est possible d'enrichir des évènements de réparation par NHEJ ou par RH dans les deux locus à la suite de l'ajout d'ouabaïne. Ainsi, nous avons démontré que cette approche peut être appliquée non seulement aux lignées cellulaires, mais aussi aux cellules primaires ce qui permet d'envisager une possible utilisation pour le développement thérapeutique ex vivo. Dans le deuxième objectif de cette thèse, il était question d'optimiser le système CRISPR1-Cas9 de Streptococcus thermophilus dans le but d'élargir le répertoire de nucléases pour l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons optimisé l'expression de l'ARN guide et nous avons caractérisé diverses variantes de St1Cas9 permettant de cibler des régions riches en A/T. Autant sous forme de nucléase que d'éditeur de base, l'application de nos variantes de St1Cas9 in vitro a permis d'obtenir des hauts taux d'édition du génome humain. Ainsi, la taille de St1Cas9 est idéale pour sa vectorisation avec son ARN guide dans un seul vecteur adéno-associés (AAV). Dans ce sens, nous avons démontré que l'administration du vecteur AAV-St1Cas9 permet de sauver la létalité et les anomalies métaboliques dans un modèle murin de tyrosinémie héréditaire de type I. En tout, ces travaux illustrent des outils permettant d'augmenter le rendement d'édition et l'ouverture de nouvelles régions géniques pouvant être ciblées à l'intérieur du génome humain à l'aide du système CRISPR-Cas9. Ainsi, nous avons démontré la fonctionnalité des outils développés au cours de ce projet de thèse pour diverses applications ex vivo et in vivo, permettant ainsi d'élargir le potentiel thérapeutique de l'édition du génome.

La thérapie génique, appelée aussi génothérapie, est une stratégie thérapeutique utilisable en principe pour traiter de nombreuses maladies génétiques. Une variation récente de cette approche thérapeutique utilise le système bactérien CRISPR/Cas9 (The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)) pour modifier les gènes défectueux des patients atteints d'une maladie héréditaire. Ce système a déjà démontré sa grande capacité à modifier l'ADN chromosomique in vitro ainsi que in vivo mais le problème majeur réside au niveau de la livraison des composantes du système CRISPR, soit la Cas9 et un ARN guide (ARNg). Malgré l'existence de plusieurs vecteurs de livraison viraux ou non viraux, les Adeno-associated virus (AAV) sont les virus les plus utilisés pour livrer des gènes thérapeutiques aux cellules in vitro et aux animaux et aux humains in vivo. Malheureusement, cet outil de livraison commence à démontrer ses limites à cause de sa capacité d'empaquetage très limitée (environ 4.8 kb) par rapport à d'autres outils de livraison et à cause de son immunogénicité. Ces limitations nous amènent à développer une nouvelle approche qui pourrait être plus puissante et beaucoup moins immunogène soit l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par toutes les cellules de l'organisme et qui constituent un outil de communication cellulaire. Les travaux de ce mémoire démontrent qu'il est possible d'introduire la protéine Cas9 et plus spécifiquement la Cas9 du Streptococcus pyogène (SpCas9) dans les vésicules extracellulaires. L'utilisation de ces vésicules nous a permis de livrer la SpCas9 à des cellules in vitro et d'induire une édition génique. / Gene therapy, also called genotherapy, is a therapeutic strategy used to treat many genetic diseases. A recent variation of this technology uses the bacterial CRISPR/Cas9 system, The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) to modify the defective genes of affected patients. This system has already demonstrated its great capacity to modify chromosomal DNA in vitro as well as in vivo, but the major problem lies in the delivery of the CRISPR components (i.e., the Cas9 gene or protein and its guide RNA (gRNA)). Despite the existence of several viral and non-viral delivery vectors, Adeno-associated viruses (AAV) are the most used vector to deliver therapeutic genes to cells in vitro and to animals and humans in vivo. Unfortunately, this delivery vector is starting to demonstrate its limitations due to its very limited packaging capacity (about 4.8 kb) compared to other delivery vectors and due also to its immunogenicity. These limitations lead us to develop a new approach that could be more powerful and much less immunogenic such as extracellular vesicles, which are produced by all cell types in the body, and which constitute an inter-cellular communication tool. Our work demonstrates that we are able to introduce the Cas9 protein, more specifically the Streptococcus pyogene Cas9 (SpCas9) into extracellular vesicles. These vesicles allowed us to deliver the SpCas9 to cells in vitro and to induce genetic editing.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire héréditaire causée par des mutations dans le gène DMD codant pour la dystrophine, une protéine importante dans le maintien de l'intégrité de la membrane des fibres musculaires. L'absence de la dystrophine se manifeste par la dégénérescence progressive des fibres musculaires à l'effort. La DMD représente un fardeau pour les patients et leurs familles. Elle affecte environ 20 000 nouveaux nés de sexe masculin dans le monde chaque année. Il existe plusieurs approches thérapeutiques allant du ciblage de l'ARNm au remplacement ou substitution de la dystrophine. Cependant, ces traitements sont transitoires et induisent des améliorations phénotypiques limitées. La découverte il y a une dizaine d'années du système CRISPR-Cas a ouvert des possibilités presque illimitées en biologie. Ce système a été modifié et adapté en 2019 pour développer le Prime editing, une technologie dynamique de modification du génome. Cette technologie permet de faire une interconversion de tout nucléotide du génome, des insertions ou des délétions de nucléotides. Le système d'édition est constitué d'un plasmide éditeur (PE2) fait d'une Cas9 nickase fusionnée à une transcriptase inverse et d'un plasmide contenant un ARN guide pour le Prime editing (pegRNA) contenant une séquence espaceur, une séquence d'amorçage et une matrice pour la transcriptase inverse (RTT). Notre étude visait donc à utiliser cette technologie CRISPR-Cas9 Prime editing pour développer une approche de traitement permanent de la DMD. Les deux premiers chapitres de cette thèse présentent de façon approfondie l'état de la littérature actuelle sur les différentes approches thérapeutiques de la DMD. Le premier chapitre décrit les stratégies moléculaires médiant la restauration de la dystrophine. Ces approches incluent la lecture à travers les codons, les sauts d'exons, la modification de l'ADN par la technique CRISPR, la modulation des progéniteurs, le remplacement et la substitution du gène DMD ainsi que la transplantation cellulaire. Le deuxième chapitre apporte plus de détails et de précisions sur les approches CRISPR en développement pour la DMD permettant ainsi de mieux comprendre la pertinence de notre choix technologique (CRISPR-Cas9 Prime editing) pour l'approche que nous avons développé dans cette thèse. Le troisième chapitre de cette thèse vise à démontrer la capacité du Prime editing à introduire ou corriger des mutations ponctuelles dans le gène DMD et permettre l'expression de la protéine dystrophine complète. Initialement, nous avons conçu plusieurs pegRNAs pour introduire les mutations nonsenses présentes dans la population canadienne dans les exons 6, 9, 20, 35, 43, 55 et 61 du gène DMD. Suite à des taux d'édition très faibles variant entre 2 et 10%, plusieurs optimisations dont, les traitements répétés consécutifs, l'usage d'un guide supplémentaire pour induire une autre coupure de l'autre brin d'ADN à distance du site de coupure initial, et l'ajout d'une mutation simultanée dans la séquence adjacente au protoespaceur (PAM) pour préserver la mutation induite, ont permis d'augmenter jusqu'à 5,8 fois le taux d'édition. Ces stratégies ont permis par la suite de corriger la mutation c.428 G>A dans l'exon 6 des myoblastes d'un patient suivi par l'expression de la dystrophine détectée par western blot à partir des protéines provenant de la fusion des myoblastes en myotubes. Le séquençage haut débit analysé par CRISPResso2 a montré un taux d'INDEL inférieur à 1%. Le quatrième chapitre de cette thèse vise à démontrer la capacité du Prime editing à corriger efficacement la mutation c.8713C>T dans l'exon 59 du gène DMD dont la position à +13 nucléotides du site de coupure la rend défavorable pour la correction par Prime editing. Plusieurs variants de PE2 ont été testés et le meilleur variant (SpCas9-NGG) a été choisi pour la suite des expériences. Ajoutées aux optimisations du chapitre 3 précédent, la variation de la longueur du RTT et des mutations synonymes supplémentaires à différentes positions de la cible ont permis d'augmenter jusqu'à 7 fois le taux d'édition. Cette autre stratégie a été utilisée pour la correction de la mutation c.8713C>T dans l'exon 59 des myoblastes d'un patient à un taux de 22% suivi par l'expression de la dystrophine (42%). Le cinquième chapitre de cette thèse a permis de démontrer la capacité du Prime editing à effectuer en plus des substitutions, des délétions et des insertions de nucléotides dans les sites d'épissages afin de médier un saut d'exon et restaurer l'expression de la dystrophine. La stratégie consistait à corriger dans les myoblastes de patients, les mutations causées par les délétions de l'exon 52 et des exons 45-52 en modifiant respectivement les sites donneurs d'épissage des exons 51 et 53 pour les éliminer. Cela a permis la jonction respective de l'exon 50 à l'exon 53 et de l'exon 44 à l'exon 54 pour les délétions 52 et 45-52 respectivement. Ces modifications des sites d'épissage ont permis l'expression de la protéine dystrophine. Ces résultats sont une preuve de principe et démontrent le potentiel de notre approche à modifier efficacement le gène DMD pour médier la restauration de l'expression de la dystrophine chez les patients DMD. Cependant, il sera important de développer un système de livraison efficace en utilisant par exemple un vecteur Dual-AAV ou des particules virales VLPs ayant respectivement des capsides ou des glycoprotéines spécifiques des muscles squelettiques et cardiaques pour un essai in vivo de ces stratégies. Il sera également pertinent de développer une approche Prime editing multiplexe afin de cibler simultanément plusieurs mutations du gène DMD et examiner les effets hors cibles et immunologiques de cette dernière. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an inherited neuromuscular disease caused by mutations in the DMD gene encoding dystrophin, a protein involved in maintaining muscle fibers membrane integrity. The absence of dystrophin leads to a progressive muscle wasting due to muscle contractions. DMD represents a burden for patients and their families. It affects approximately 20,000 newborn males worldwide each year. There are several therapeutic approaches ranging from mRNA targeting to dystrophin replacement or substitution. However, these treatments are transient and induce limited phenotypic improvements. The discovery a decade ago of CRISPR-Cas system opened almost unlimited possibilities in biology. This system was modified and adapted in 2019 to develop the Prime editing, a dynamic genome editing technology. That technology makes possible the interconversion of any nucleotide of the genome, and the insertions or deletions of nucleotides. The editing system consists of a prime editor plasmid (PE2) made of a Cas9 nickase fused to a reverse transcriptase and a plasmid encoding a Prime editing guide RNA (pegRNA) containing a spacer sequence, a primer binding site (PBS) sequence and a reverse transcriptase template (RTT). Our study therefore aimed to use this CRISPR-Cas9 Prime editing technology to develop a permanent treatment approach for DMD. The first and second chapters of this thesis present in depth the state of the current literature on the different DMD therapeutic approaches. The first chapter describes the molecular strategies involved in the dystrophin restoration. These approaches include read through codon, exon skipping, CRISPR DNA editing, progenitor modulation, DMD gene replacement or substitution, and cell transplantation. The second chapter provides more details and precisions on the CRISPR approaches in development for DMD, thus allowing a better understanding of the relevance of our technological choice for the approach that we have developed in this thesis. The third chapter of this thesis aims to demonstrate the ability of Prime editing to introduce or correct point mutations in the DMD gene and restore the expression of the dystrophin protein. We initially designed several pegRNAs to induce the nonsense mutations present in the Canadian population in exons 6, 9, 20, 35, 43, 55 and 61 of the DMD gene. Following very low editing rates varying from 2 to 10%, several optimizations including consecutive repeated treatments, the use of an additional sgRNA to induce a second nick at a distance from the initial nick site, and the simultaneous mutation in the protospacer adjacent motif (PAM) to preserve the induced mutation, permitted to increase by 5.8-fold the editing rate. These strategies subsequently made possible to correct the c.428 G>A mutation in exon 6 of a patient's myoblasts. That was followed by dystrophin expression detected by western blot from proteins coming from the fusion of the myoblasts in myotubes. High-throughput sequencing analyzed by CRISPResso2 showed an INDEL rate less than 1%. The fourth chapter of this thesis aims to demonstrate the ability of Prime editing to efficiently correct the c.8713C>T mutation in exon 59 of the DMD gene whose position at +13 makes it unfavorable to the correction by Prime editing. Several PE2 variants were tested, and the best variant (SpCas9-NGG) was chosen for further experiments. Added to the optimizations of the previous chapter 3, varying the RTT length and additional synonymous mutations at different positions beside the target increased the editing rate by 7-folds. This other strategy was used for the correction of the c.8713C>T mutation in exon 59 of a patient's myoblasts at the editing rate of 22% followed by the dystrophin expression (42%). The fifth chapter of this thesis has demonstrated the ability of Prime editing to perform in addition to substitutions, deletions, and insertions of nucleotides in the splice sites to mediate exon skipping and restore the dystrophin expression. The strategy consisted of correcting in patient myoblasts, the mutations caused by the deletions of exon 52 (Del52) and exons 45-52 (Del45-52) respectively by modifying the splice donor sites of exons 51 and 53 for their skipping. This allowed the binding of exon 50 to exon 53 and exon 44 to exon 54 respectively for Del52 and Del45-52 permitting the expression of the dystrophin protein. These results are a proof of concept and demonstrate the potential of our approach to effectively modify the DMD gene to mediate the dystrophin restoration in DMD patients. However, it will be important to develop an efficient delivery system using for example a Dual-AAV vector or virus like particles (VLPs) with skeletal and cardiac muscle-specific capsids or glycoproteins, respectively, for in vivo experimentation of these strategies. It will also be relevant to develop a multiplex Prime-editing approach to simultaneously target multiple DMD gene mutations and examine the off-target and immunological effects.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 février 2024) / La cellulose d'origine bactérienne est un matériau unique, dont les propriétés la rendent intéressante pour plusieurs domaines. En effet, la finesse de ses fibres, leur degré d'organisation cristalline, ainsi que l'absence de lignine, pectine, et d'hémicellulose en font une substance plus absorbante, résistante et biocompatible que le la cellulose végétale, ce qui la rend plus appropriée pour des applications médicales et optoélectroniques. Cependant, la production de cellulose bactérienne à échelle industrielle rencontre plusieurs obstacles, tels que la perte spontanée de la production de cellulose au cours de la culture des bactéries productrices, ainsi qu'un rendement qui est économiquement non rentable. De plus, les outils de biologie moléculaire adaptés aux souches productrices de cellulose sont limités ce qui restreint les essais de manipulation génétique ayant pour but d'augmenter leurs productivités de cellulose. Dans cette étude, nous démontrons que l'insertion de l'élément transposable IS*1032* dans un site spécifique situé à la base 502 dans le gène *bcsA* chez *Komagataeibacter rhaeticus* iGEM entraîne l'interruption de la production de cellulose dans au moins 12% des mutants cellulose négatif (Celˉ). Une analyse par qPCR a permis d'estimer le nombre de copies de cet élément par cellule à 16 ± 2 copies. Nous proposons une stratégie pour bloquer l'insertion de l'élément transposable IS*1032* en modifiant le site d'insertion de cet élément sur BcsA. Cela était effectué en se basant sur une analyse *in silico* des effets d'une substitution de l'acide aminé présent sur le site d'insertion tout en vérifiant que la structure 3D de la protéine BcsA ne soit pas déformée. Des essais préliminaires suggèrent que l'expression de la protéine modifiée chez un mutant Celˉ pourrait entraîner la réversion à un phénotype Cel⁺ stable. Nous démontrons donc l'efficacité de deux marqueurs de sélection chez *K. rhaeticus*, soit la tétracycline (*tetA*) et la streptomycine (*aadA*). Nous constatons aussi que le glycérol est une source de carbone efficace en milieu minimal pour une surproduction de cellulose chez cette souche bactérienne. / Bacterial cellulose, or BC, is a unique material, whose properties make it interesting for several fields. Indeed, the fineness of its fibers, their degree of organization, as well as the absence of lignin, pectin, and hemicellulose make it a more absorbent, tough and biocompatible substance than plant-based cellulose making it more appropriate for applications in medicine and optoelectronics. However, the industrial production of bacterial cellulose encounters several obstacles, such as the spontaneous loss of cellulose production during cultivation of these bacteria as well as its low yields making the whole production process economically nonviable. In addition, molecular biology tools adapted to cellulose-producing strains are limited, which restricts genetic manipulation trials aiming at increasing their cellulose productivity. In this study, we demonstrate that the insertion of the IS*1032* transposable element into a specific site located at base 502 in the *bcsA* gene in *Komagataeibacter rhaeticus* leads to the interruption of cellulose production in at least 12% of cellulose-negative (Celˉ) mutants. A qPCR analysis allowed us to estimate the number of copies of this element per cell at 16 ± 2 copies. We then propose a strategy to block the insertion of the transposable element IS*1032* by modifying the insertion site of this element on BcsA. This was conducted based on an *in-silico* analysis of the effects of a substitution of the amino acid present in the insertion site while verifying that the 3D structure of the BcsA is not affected. Preliminary experiments suggest that the expression of the mutant BcsA protein in a Celˉ mutant can cause a stable reversion to the Cel⁺ phenotype. We propose new and useful tools for genetic manipulation of *Komagataeibacter rhaeticus*. We also demonstrate the efficiency of two selection markers in *K. rhaeticus*, namely tetracycline (*tetA*) and streptomycin (*aadA*). We report that glycerol is an efficient carbon source to be used in minimal medium for high cellulose production in this bacterial strain.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique qui résulte de diverses mutations dans le gène DMD, codant pour la protéine dystrophine. 70% des patients ont une délétion d'exons ou de parties d'exons provoquant un changement dans le cadre de lecture, résultant en l'apparition d'un codon stop et en l'absence de la protéine dystrophine. Plusieurs traitements potentiels ont été explorés dans les dernières années pour cette maladie, dont le système CRISPR-Cas9, un outil génétique permettant d'éliminer un segment d'ADN à l'aide de la protéine nucléase Cas9 et de deux guides d'ARN ciblant des séquences précises d'ADN. Le plus grand défi avec l'utilisation de cette technologie est sa livraison in vivo. Les vésicules extracellulaires sont des particules membranaires lipidiques qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire et sont retrouvées dans tous les biofluides chez les mammifères. Elles pourraient donc être une alternative intéressante pour la livraison du système CRISPR-Cas9. J'ai participé à des travaux de purification de vésicules extracellulaires de sérum par chromatographie par exclusion de taille. Ces vésicules extracellulaires ont été chargées avec la protéine Cas9 et des guides ARN, puis, des injections intramusculaires ont été effectuées dans le Tibialis anterior de trois lignées de souris (Ai9, RAG-mdx et mdx/hDMD) pour établir l'efficacité du traitement. Les résultats ont montré que les vésicules extracellulaires chargées avec la Cas9 et des guides d'ARN provoquent une édition de l'ADN efficace dans le Tibialis anterior des trois lignées de souris utilisées et la restauration de l'expression de la protéine dystrophine dans les fibres musculaires du Tibialis anterior des souris RAG-mdx, modèle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le traitement a ensuite été modifié pour permettre le ciblage des vésicules extracellulaires aux organes affectés par la dystrophie musculaire de Duchenne, soit le cœur et les muscles squelettiques. Des peptides de ciblage ont été sélectionnés dans la littérature et insérés dans la membrane des vésicules extracellulaires marquées de façon fluorescente à l'aide d'un segment lipidique stéaryl. Les résultats de l'expérience effectuée avec les vésicules extracellulaires ciblées n'ont pas été concluants en raison d'un marquage mal adapté des vésicules injectées, mais de futures expériences permettront d'élucider leur efficacité. L'ajustement du traitement pour permettre une injection systémique rejoignant le cœur et les muscles squelettiques est indispensable à l'application de celui-ci à la clinique. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease that affects one in 3500 boys and results from mutations in the DMD gene, which codes for dystrophin protein. 70% of patients have an exon deletion, which results in a shift in the reading frame, the apparition of a stop codon, and the absence of the dystrophin protein. Many different potential treatments have been explored for Duchenne muscular dystrophy, including the CRISPRCas9 system. This technology allows for the modification of genomic DNA through a Cas9 nuclease and two guide RNAs designed to target a specific DNA sequence. The biggest challenge with using the CRISPR system is delivery. The classic vectors for CRISPR, such as AAV, can cause many adverse effects like immunological responses. Extracellular vesicles are membranous particles that play a role in intercellular communication and are found in all mammalian biofluids. They are thus an interesting alternative for the delivery of the Cas9 protein and its guide RNAs. I have participated in a research project aiming to purify serum extracellular vesicles by size-exclusion chromatography and to load them with Cas9 and two guide RNAs. These extracellular vesicles were then injected intramuscularly into the Tibialis anterior muscles of three mouse strains (Ai9, RAG-mdx and mdx/hDMD) to assess treatment efficiency. The injection of Cas9 and guide RNA-loaded extracellular vesicles produced efficient gene editing as well as dystrophin expression restauration. To modify the treatment for systemic injection, targeting peptides were added to EV membrane through a lipid stearyl segment. This was done to target the extracellular vesicles to Duchenne muscular dystrophy-affected organs: heart and skeletal muscles. Results of the targeted-extracellular vesicle experiment were inconclusive, however, with more experiments, the efficacy of the targeting peptides should be determinable. It is essential to adjust this treatment to allow for targeted systemic delivery for it to be applicable to the clinic.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique qui résulte de diverses mutations dans le gène DMD, codant pour la protéine dystrophine. 70% des patients ont une délétion d'exons ou de parties d'exons provoquant un changement dans le cadre de lecture, résultant en l'apparition d'un codon stop et en l'absence de la protéine dystrophine. Plusieurs traitements potentiels ont été explorés dans les dernières années pour cette maladie, dont le système CRISPR-Cas9, un outil génétique permettant d'éliminer un segment d'ADN à l'aide de la protéine nucléase Cas9 et de deux guides d'ARN ciblant des séquences précises d'ADN. Le plus grand défi avec l'utilisation de cette technologie est sa livraison in vivo. Les vésicules extracellulaires sont des particules membranaires lipidiques qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire et sont retrouvées dans tous les biofluides chez les mammifères. Elles pourraient donc être une alternative intéressante pour la livraison du système CRISPR-Cas9. J'ai participé à des travaux de purification de vésicules extracellulaires de sérum par chromatographie par exclusion de taille. Ces vésicules extracellulaires ont été chargées avec la protéine Cas9 et des guides ARN, puis, des injections intramusculaires ont été effectuées dans le Tibialis anterior de trois lignées de souris (Ai9, RAG-mdx et mdx/hDMD) pour établir l'efficacité du traitement. Les résultats ont montré que les vésicules extracellulaires chargées avec la Cas9 et des guides d'ARN provoquent une édition de l'ADN efficace dans le Tibialis anterior des trois lignées de souris utilisées et la restauration de l'expression de la protéine dystrophine dans les fibres musculaires du Tibialis anterior des souris RAG-mdx, modèle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le traitement a ensuite été modifié pour permettre le ciblage des vésicules extracellulaires aux organes affectés par la dystrophie musculaire de Duchenne, soit le cœur et les muscles squelettiques. Des peptides de ciblage ont été sélectionnés dans la littérature et insérés dans la membrane des vésicules extracellulaires marquées de façon fluorescente à l'aide d'un segment lipidique stéaryl. Les résultats de l'expérience effectuée avec les vésicules extracellulaires ciblées n'ont pas été concluants en raison d'un marquage mal adapté des vésicules injectées, mais de futures expériences permettront d'élucider leur efficacité. L'ajustement du traitement pour permettre une injection systémique rejoignant le cœur et les muscles squelettiques est indispensable à l'application de celui-ci à la clinique. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease that affects one in 3500 boys and results from mutations in the DMD gene, which codes for dystrophin protein. 70% of patients have an exon deletion, which results in a shift in the reading frame, the apparition of a stop codon, and the absence of the dystrophin protein. Many different potential treatments have been explored for Duchenne muscular dystrophy, including the CRISPRCas9 system. This technology allows for the modification of genomic DNA through a Cas9 nuclease and two guide RNAs designed to target a specific DNA sequence. The biggest challenge with using the CRISPR system is delivery. The classic vectors for CRISPR, such as AAV, can cause many adverse effects like immunological responses. Extracellular vesicles are membranous particles that play a role in intercellular communication and are found in all mammalian biofluids. They are thus an interesting alternative for the delivery of the Cas9 protein and its guide RNAs. I have participated in a research project aiming to purify serum extracellular vesicles by size-exclusion chromatography and to load them with Cas9 and two guide RNAs. These extracellular vesicles were then injected intramuscularly into the Tibialis anterior muscles of three mouse strains (Ai9, RAG-mdx and mdx/hDMD) to assess treatment efficiency. The injection of Cas9 and guide RNA-loaded extracellular vesicles produced efficient gene editing as well as dystrophin expression restauration. To modify the treatment for systemic injection, targeting peptides were added to EV membrane through a lipid stearyl segment. This was done to target the extracellular vesicles to Duchenne muscular dystrophy-affected organs: heart and skeletal muscles. Results of the targeted-extracellular vesicle experiment were inconclusive, however, with more experiments, the efficacy of the targeting peptides should be determinable. It is essential to adjust this treatment to allow for targeted systemic delivery for it to be applicable to the clinic.

Le microbiote intestinal joue un rôle important dans la santé de son hôte. Les bactéries qui le composent vont agir à différents niveaux, comme celui de la digestion, du métabolisme, de l'immunité ou du cerveau. Ces bactéries vont former un réseau équilibré qui est nécessaire pour le maintien de notre santé. Cependant, des facteurs externes tels que la diète, la prise de médicaments, l'environnement et le stress peuvent grandement influencer cet équilibre et altérer la composition du microbiote intestinal. De plus, ces perturbations peuvent engendrer un stress oxydatif et provoquer encore plus de dommages, notamment à notre cerveau. Afin d'étudier ces variations, deux outils génétiques ont été développés pour le modèle du poisson-zèbre. Le premier outil consiste en un système CRISPR-dCas9 photoactivable à la lumière bleue ayant pour but de contrôler les populations microbiennes de l'intestin d'une larve (transparente) de poisson-zèbre à l'aide de la lumière. La preuve de concept a été réalisée avec Escherichia coli. Le deuxième outil consiste en un senseur de peroxyde d'hydrogène ciblé aux mitochondries des cellules épithéliales de l'intestin. Cet outil vise à mesurer les niveaux de peroxyde d'hydrogène, un dérivé réactif de l'oxygène menant à la production de stress oxydatif. Ultérieurement, cet outil sera exploité afin de générer une lignée transgénique de poisson-zèbre exprimant ce senseur. Il sera également possible d'utiliser en parallèle le système CRISPR-dCas9 photoactivable afin de faire des liens entre les perturbations du microbiote intestinal et le stress oxydatif produit par le peroxyde d'hydrogène dans l'intestin de la larve de poisson-zèbre. Finalement, des liens entre ces effets et le développement du cerveau pourront être établis. / The intestinal microbiota plays an important role in the health of its host. The bacteria that compose it will act at different levels, such as digestion, metabolism, immunity, or the brain. These bacteria will form a balanced network that is key for the maintenance of our health. However, external factors such as diet, drugs, environment, and stress can greatly influence this balance and alter the composition of the intestinal microbiota. Moreover, these disturbances can lead to oxidative stress and cause further damage, especially to our brain. To study these variations, two genetic tools were developed to use in the zebrafish larva model. The first tool is a blue-light photoactivatable CRISPR-dCas9 system to control the gut microbiota using light. The proof of concept has been realized with Escherichia coli. The second tool consists of a hydrogen peroxide sensor targeted to the mitochondria of intestinal epithelial cells. This tool aims to measure the levels of hydrogen peroxide, a reactive oxygen derivative leading to the production of oxidative stress. Later, this tool will be used to generate a transgenic line of zebrafish expressing this sensor. It will also be possible to use in parallel the photoactivatable CRISPR-dCas9 system to make links between the disturbances of the intestinal microbiota and the oxidative stress produced by hydrogen peroxide in the larval zebrafish gut. Finally, links between these effects and the brain development will be further studied.