Les domaines de la génomique et de la métagénomique ont apporté un support incommensurable à l'avancement de nos connaissances sur la génétique des bactéries. Les bactéries pathogènes sont maintenant séquencées et analysées pour identifier les facteurs causant leur virulence et/ou leur résistance aux antibiotiques ainsi que leur capacité à transmettre ces éléments génétiques qui sont d'un intérêt clinique. Les bactéries commensales, quant à elles, sont de plus en plus associées à la santé humaine et sont étudiées à l'aide de la métagénomique pour contrer les difficultés liées à leur culture étant donné leur grande diversité en matière de besoins métaboliques. Les nouvelles technologies de séquençages permettent donc de produire en masse ces séquences d'ADN à des fins de caractérisation et de comparaison dans le but d'élucider des questions souvent reliées à la santé humaine. Les avancées en génomique et en métagénomique requièrent des logiciels bio-informatiques capables de gérer et de s'adapter à la quantité massive et croissante des données biologiques. Les deux premières hypothèses de ce doctorat concernaient le développement de méthodes efficaces et flexibles pour l'analyse de génomes et de métagénomes bactériens. Plusieurs méthodes d'analyses bio-informatiques ont été explorées et ont mené à l'implémentation de deux logiciels pour supporter les hypothèses de recherche : Ray Surveyor et kAAmer. La première hypothèse de recherche consistait à vérifier s'il était possible d'obtenir une comparaison de génomes, depuis leur simple contenu en k-mers de séquences d'ADN, avec des résultats analogues aux comparaisons génomiques standards comme le pourcentage moyen d'identités ou les arbres phylogénétiques, mais sans nécessiter d'alignements de séquences. Nous avons démontré avec le logiciel Ray Surveyor et plusieurs analyses de génomique et de métagénomique bactérienne, qu'il était possible d'obtenir de tels comparaisons à l'aide de séquences d'ADN découpées en k-mer. Dans l'étude qui présenta les résultats de l'hypothèse de recherche, nous avons aussi estimé la propension génotypique de plusieurs espèces bactériennes à des phénotypes d'intérêt clinique à l'aide de bases de données de gènes spécialisées. La deuxième hypothèse était de tester s'il était possible de développer un logiciel pour l'identification de séquences protéiques, basé sur des k-mers d'acides aminés, qui serait plus performant que les logiciels existants, spécifiquement pour l'identification de protéines avec un haut degré d'homologie. Les travaux menèrent à l'implémentation de kAAmer, un logiciel permettant de créer des bases de données de protéines où la recherche de séquence se fait par association exacte de k-mers tout en supportant l'alignement de séquences. KAAmer s'est avéré très efficace pour la recherche de séquences de protéines avec des performances surpassant même, dans la majorité des scénarios, les aligneurs de séquences les plus rapides. D'autres fonctionnalités intéressantes sont aussi offertes par kAAmer, tel que la possibilité d'héberger une base de données en tant que service de manière permanente. Enfin, la troisième et dernière hypothèse de recherche visait à valider si les deux logiciels développés durant le projet de doctorat (Ray Surveyor et kAAmer) produiraient des résultats viables dans une analyse métagénomique du microbiote intestinal en lien avec l'obésité. Les profilages taxonomique et fonctionnel furent donc réalisés avec kAAmer et la comparaison de novo des métagénomes investiguée avec Ray Surveyor. Les résultats obtenus se sont avérés significatifs et ont démontrés, entre autres, une tendance vers une abondance relative plus élevée pour le phylum Bacteroidetes et moins élevée pour les phyla Firmicutes et Acinetobacteria chez les sujets obèses. Une multitude de fonctions métaboliques se sont aussi avérées significativement différentes dans les conditions normales et d'obésités des métagénomes, avec une mention particulière à celles reliées au métabolisme des acides gras à chaîne courte qui sont reconnues pour être associées à l'obésité. / The fields of genomics and metagenomics have provided immeasurable support to the advancement of our knowledge of bacterial genetics. Pathogenic bacteria are now routinely sequenced and analyzed to identify the factors causing their virulence or antibiotic resistance as well as their ability to transmit genetic elements. Commensal bacteria are increasingly associated with human health and are being studied using metagenomics to counter the issues associated with their culture due to their wide range of metabolic needs. Next generation sequencing enabled us to mass-produce these DNA sequences for characterization and comparison purposes in order to elucidate questions related to human health. Improvement in genomics and metagenomics studies required bio-informatics software that are able to manage and adapt to an increasing availability of biological sequences data. The first two hypotheses of this thesis include the development of efficient and flexible methods for the analysis of bacterial genomes and metagenomes. Several bio-informatics analysis methods were explored and led to the implementation of two software to support the research hypotheses: Ray Surveyor and kAAmer. The first research hypothesis was to test the possibility of obtaining a comparison of genomes, from their simple DNA k-mers content, with results analogous to standard genomic comparisons such as average nucleotide identity or phylogenetic trees, but without the need for sequence alignments. Using Ray Surveyor software and several bacterial genomic and metagenomic analyses, we have demonstrated that it is possible to obtain such comparisons using k-mers from DNA sequences. In the study that presented the results of the research hypothesis, we also estimated the genotypic propensity of several bacterial species to clinically relevant phenotypes using specialized gene databases. The second hypothesis was to test the possibility of developing a software for protein sequence identification, based on amino acid k-mers, which would be more efficient than existing software, specifically for the identification of proteins with a high degree of homology. The work led to the implementation of kAAmer, a software solution that allows the creation of protein databases where the sequence search is done by exact match of k-mers, while supporting sequence alignment. KAAmer has proven to be very efficient for protein sequence search with performances surpassing even the fastest sequence aligners in most scenarios. Other interesting features are also offered by kAAmer, such as the possibility to host a database as a service on a permanent basis. Finally, the third and last research hypothesis aimed to test the capacity the two software developed during the PhD project (Ray Surveyor and kAAmer) to produce viable results in a metagenomic analysis of the gut microbiota in relation to obesity. Taxonomic and functional profiling was performed with kAAmer as the de novo comparison of metagenomes with Ray Surveyor. The results obtained were significant and showed, among others, a trend towards higher relative abundance of the Bacteroidetes phylum and lower relative abundance of the Firmicutes and Acinetobacteria phyla in obese subjects. Several metabolic functions were also found to be significantly different in the normal and obese conditions, with a particular mention to the metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) that are known to be associated with obesity.

Streptococcus pneumoniae est le pathogène bactérien le plus important des voies respiratoires (pneumonie, bronchite et otite moyenne) chez les adultes et les enfants. Cette bactérie est responsable d’une morbidité et une mortalité importantes. Bien que la pénicilline présente une activité contre de nombreux isolats de S. pneumoniae, la résistance à cet antibiotique est aujourd'hui, fréquemment rencontrés à la fois à l'hôpital et dans la communauté. La résistance à la pénicilline chez Streptococcus pneumoniae est causée par un bloc de gènes codant pour des versions altérées de protéines liant la pénicilline (PLP). Néanmoins, S. pneumoniae a également développé des mécanismes de résistance à la pénicilline indépendants des PLPs altérées. L'objectif principal de cette thèse était d’utiliser des approches génomiques pour comprendre le génotype et le phénotype de résistance aux ß-lactamines chez S. pneumoniae. Le travail présenté dans cette thèse a indiqué que des mutations dans les PLPs ne sont pas suffisantes pour obtenir une résistance de haut niveau à la pénicilline et au céfotaxime. Cette étude a indiqué également que la sélection de la résistance à la pénicilline chez S. pneumoniae peut impliquer l’acquisition de mutations conférant une tolérance à l’accumulation d’oxydants causée par les antibiotiques. Cette tolérance peut se traduire par une augmentation de la survie qui permet possiblement la sélection des déterminants majeurs de résistance tels que des mutations dans les PLPs. Dans le cas des souches cliniques résistantes à la pénicilline, nous présentons également un nouveau rôle pour une alpha-amylase cytoplasmique conférant une résistance modérée à la pénicilline en présence d'altération des PLPs. Par ailleurs, nos travaux sur la résistance au céfotaxime chez S. pneumoniae a permis la découverte de nouveaux gènes impliquées dans la résistance au céfotaxime, y compris les gènes spr1333, spr0981, spr1704 et spr1098 qui codent respectivement pour un peptidoglycan GlcNAc déacetylase, une glycosyltransférase, un transporteur ABC et une sortase. Nos travaux génomiques ont permis de découvrir de nouveaux gènes de résistance aux β-lactamines chez S. pneumoniae. / Streptococcus pneumoniae is the most important bacterial pathogen of the respiratory tract (pneumonitis, bronchitis and otitis media) in adults and children resulting in significant morbidity and mortality. Although penicillin shows activity against many isolates of S. pneumoniae, resistance to this antibiotic is now frequently encountered, both at the hospital and in the community. Penicillin resistance in Streptococcus pneumoniae is mediated by a mosaic of genes encoding altered penicillin-binding proteins (PBPs). Nonetheless, S. pneumoniae has also developed non-PBP mechanisms implicated in penicillin resistance. The principal objective of this thesis was to use global sequencing approaches to understand ß-lactam resistance genotype and phenotype in S. pneumoniae. The work presented in this thesis indicated that mutations in PBPs are not sufficient to achieve high level resistance to penicillin and cefotaxime. This study also indicates that the selection of resistance to penicillin in S. pneumoniae involves the acquisition of mutations conferring tolerance to the antibiotic-induced accumulation of oxidants. This tolerance can translate into an increased survival that putatively enables the selection of major resistance determinants such as mutations in PBPs. In the case of clinical isolates, we also report a new role for a cytoplasmic alpha amylase in conferring moderate resistance to penicillin in the presence of altered PBPs. Furthermore, our works on cefotaxime resistance has allowed the discovery of novel cefotaxime resistance genes in S. pneumoniae including spr1333, spr0981, spr1704 and spr1098 coding respectively for a peptidoglycan GlcNAc deacetylase, a glycosyltransferase, an ABC transporter, and a sortase were implicated in resistance to cefotaxime. Our genomic approaches were useful to discover novel β-lactam resistance genes in S. pneumoniae.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 février 2024) / La cellulose d'origine bactérienne est un matériau unique, dont les propriétés la rendent intéressante pour plusieurs domaines. En effet, la finesse de ses fibres, leur degré d'organisation cristalline, ainsi que l'absence de lignine, pectine, et d'hémicellulose en font une substance plus absorbante, résistante et biocompatible que le la cellulose végétale, ce qui la rend plus appropriée pour des applications médicales et optoélectroniques. Cependant, la production de cellulose bactérienne à échelle industrielle rencontre plusieurs obstacles, tels que la perte spontanée de la production de cellulose au cours de la culture des bactéries productrices, ainsi qu'un rendement qui est économiquement non rentable. De plus, les outils de biologie moléculaire adaptés aux souches productrices de cellulose sont limités ce qui restreint les essais de manipulation génétique ayant pour but d'augmenter leurs productivités de cellulose. Dans cette étude, nous démontrons que l'insertion de l'élément transposable IS*1032* dans un site spécifique situé à la base 502 dans le gène *bcsA* chez *Komagataeibacter rhaeticus* iGEM entraîne l'interruption de la production de cellulose dans au moins 12% des mutants cellulose négatif (Celˉ). Une analyse par qPCR a permis d'estimer le nombre de copies de cet élément par cellule à 16 ± 2 copies. Nous proposons une stratégie pour bloquer l'insertion de l'élément transposable IS*1032* en modifiant le site d'insertion de cet élément sur BcsA. Cela était effectué en se basant sur une analyse *in silico* des effets d'une substitution de l'acide aminé présent sur le site d'insertion tout en vérifiant que la structure 3D de la protéine BcsA ne soit pas déformée. Des essais préliminaires suggèrent que l'expression de la protéine modifiée chez un mutant Celˉ pourrait entraîner la réversion à un phénotype Cel⁺ stable. Nous démontrons donc l'efficacité de deux marqueurs de sélection chez *K. rhaeticus*, soit la tétracycline (*tetA*) et la streptomycine (*aadA*). Nous constatons aussi que le glycérol est une source de carbone efficace en milieu minimal pour une surproduction de cellulose chez cette souche bactérienne. / Bacterial cellulose, or BC, is a unique material, whose properties make it interesting for several fields. Indeed, the fineness of its fibers, their degree of organization, as well as the absence of lignin, pectin, and hemicellulose make it a more absorbent, tough and biocompatible substance than plant-based cellulose making it more appropriate for applications in medicine and optoelectronics. However, the industrial production of bacterial cellulose encounters several obstacles, such as the spontaneous loss of cellulose production during cultivation of these bacteria as well as its low yields making the whole production process economically nonviable. In addition, molecular biology tools adapted to cellulose-producing strains are limited, which restricts genetic manipulation trials aiming at increasing their cellulose productivity. In this study, we demonstrate that the insertion of the IS*1032* transposable element into a specific site located at base 502 in the *bcsA* gene in *Komagataeibacter rhaeticus* leads to the interruption of cellulose production in at least 12% of cellulose-negative (Celˉ) mutants. A qPCR analysis allowed us to estimate the number of copies of this element per cell at 16 ± 2 copies. We then propose a strategy to block the insertion of the transposable element IS*1032* by modifying the insertion site of this element on BcsA. This was conducted based on an *in-silico* analysis of the effects of a substitution of the amino acid present in the insertion site while verifying that the 3D structure of the BcsA is not affected. Preliminary experiments suggest that the expression of the mutant BcsA protein in a Celˉ mutant can cause a stable reversion to the Cel⁺ phenotype. We propose new and useful tools for genetic manipulation of *Komagataeibacter rhaeticus*. We also demonstrate the efficiency of two selection markers in *K. rhaeticus*, namely tetracycline (*tetA*) and streptomycin (*aadA*). We report that glycerol is an efficient carbon source to be used in minimal medium for high cellulose production in this bacterial strain.

RÉSUMÉCsrA est un régulateur post-transcriptionnel contrôlant l’expression et/ou la stabilité des ARNm auxquels il se lie. Il appartient à la famille des régulateurs globaux et contrôle une grande variété de fonctions apparemment non liées. Dans le cas de CsrA, il s’agit principalement de fonctions métaboliques et de fonctions liées aux comportements sociaux des bactéries. Cependant, les limites de la régulation exercée par CsrA sur la physiologie cellulaire sont floues car ses cibles directes semblent abondantes mais difficiles à identifier et, parmi celles-ci, d’autres régulateurs important étendent indirectement l’influence de CsrA.Au cours de cette thèse, nous avons étudié les effets de la délétion du gène csrA à l’échelle de la population bactérienne (1), de la cellule bactérienne (2) et au niveau génétique (3) dans une souche d’Escherichia coli uropathogène. Les infections urinaires font parties des infections bactériennes les plus courantes, présentent un mécanisme de chronicité faisant intervenir la formation de biofilms et E. coli est le principal agent responsable de ces infections. (1) Nous avons montré que l’architecture des biofilms formés par la souche uropathogène d’E. coli était différente de celle décrite pour la souche de laboratoire et que la délétion de csrA affectait fortement cette architecture. (2) Nous avons également montré que le gène csrA n’était pas essentiel mais que sa délétion entraînait un défaut de croissance ainsi qu’une perte d’homéostasie de l’enveloppe. (3) Finalement, nous avons étudié des mutants compensatoires obtenus au travers d’une expérience d’évolution expérimentale partant du mutant ΔcsrA et montré que les différents phénotypes testés étaient restaurés dans ces mutants compensatoires sans qu’aucun changement génétique ne soit identifié.SUMMARYCsrA is a global post-transcriptional regulator controlling the expression/stability of its mRNA targets. It regulates a wide variety of apparently unrelated functions mainly related to metabolism and social behaviors. However, the limits of the regulation mediated by CsrA are not clear as its regulon is large and contains many other regulators extending indirectly its influence.In this thesis, we study the consequences of the deletion of csrA at the population level (1), cellular level (2) and genetic level (3) in an uropathogenic strain of Escherichia coli. Urinary tract infections are among the most frequent bacterial infections, present chronicity mechanism involving biofilms formation and are most of the time caused by E. coli. (1) We showed that the architecture of biofilms formed by the uropathogenic strain is different from that of the lab-strain of E. coli and that CsrA is necessary to generate this particular architecture. (2) We also showed that csrA gene is not essential and that its deletion provokes a growth defect and a loss of the envelope homeostasis. (3) Finally, we studied compensatory mutants selected through experimental evolution and showed that tested phenotypes are restored in these mutants without any genetic change being identified. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La biologie systémique cherche à comprendre la dynamique cellulaire qui émerge des interactions des constituantes cellulaires au cours du temps. La modélisation et la simulation sont des méthodes fondamentales de ce domaine. Nous nous inspirons de la proposition de Regev et Shapiro (2002) consistant à appliquer le pi-calcul stochastique comme langage formel de représentation de connaissances biomoléculaires. Nos études portent sur la modélisation à l´échelle moléculaire de l'expression génétique bactérienne et s'avèrent pertinentes pour des organismes supérieurs. Nos points de départs sont des études de cas concrets de la régulation de la bascule génétique du phage lambda, de la transcription et de la traduction. Ces études révèlent l'utilité de concepts de programmation tels que les objets concurrents et motivent une extension du pi-calcul stochastique avec des motifs de réception. Nous présentons une sémantique pour ce langage qui attribue des chaînes Markoviennes en temps continu aux programmes. Nous validons nos modèles par des simulations stochastiques.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le domaine médical a évolué drastiquement au cours des derniers siècles et la découverte du premier antibiotique, c'est-à-dire une substance qui est capable de détruire ou d'inactiver certains microorganismes, y a grandement contribué. Cette découverte a mené à une diminution du taux de mortalité causé par certaines bactéries pathogènes. Cependant, la commercialisation des antibiotiques a mené à une diversification des mécanismes de résistance par les bactéries. L'utilisation à large échelle des antibiotiques a favorisé l'émergence et le transfert de gènes de résistance aux antibiotiques (antibiotic resistance genes, ARGs) chez les bactéries. Cette résistance représente l'un des principaux enjeux de santé publique à l'échelle mondiale, en raison d'une recrudescence de maladies bactériennes qui ne répondent plus à ce traitement de première ligne. Cependant, on en sait très peu sur la dispersion des ARGs dans l'environnement et encore moins lorsqu'il s'agit de la distribution de ces gènes dans le Haut-Arctique, où les pressions climatiques risquent d'apporter plusieurs changements. L'objectif principal de ce projet est de caractériser, à l'aide d'approches métagénomiques, les ARGs des communautés microbiennes dans différents réservoirs environnementaux faisant partie d'un gradient d'influence anthropique en Arctique canadien, sur l'île de Cornwallis. Les objectifs spécifiques sont de caractériser les ARGs le long d'un continuum d'environnements influencés par l'humain (incluant un site impacté par des eaux usées) et de comparer leur distribution le long de ce gradient d'influence. Nous avons identifié des ARGs dans les tapis microbiens, l'eau du lac et les aérosols dans l'ensemble du bassin versant de Resolute Bay. Nous avons également constaté que les tapis microbiens de la région contaminée présentaient la plus grande diversité d'ARGs par rapport aux sites non contaminés. Bien que nous ayons identifiés les ARGs principalement dans les génomes bactériens, nos données suggèrent, pour la première fois, que certains virus géants sont capables d'héberger des ARGs. / The medical field has evolved dramatically over the last few centuries, and the discovery of the first antibiotic, a substance that can destroy or inactivate certain microorganisms, in 1928 was a major contributor. This discovery led to a decrease in the mortality rate caused by certain pathogenic bacteria. However, the commercialization of antibiotics has led to a diversification of various resistance mechanisms by bacteria. The widespread use of antibiotics has favored the emergence and transfer of antibiotic resistance genes (ARGs) in bacteria. Antibiotic resistance now represents one of the major global health crises due to an upsurge in bacterial-based diseases that no longer respond to this firstline treatment. However, very little is known about the dispersal of antibiotic resistance genes across different environments, and even less when it comes to the distribution of these genes in the High Arctic, where climate pressures are likely to increase the average temperature and disrupt existing microbial communities. The main objective of this project was to characterize, using metagenomic approaches, the ARGs of microbial communities in different environmental reservoirs along a gradient of anthropogenic influence in the Canadian Arctic on Cornwallis Island. The specific objectives were to characterize ARGs along a continuum of human-influenced environments (including sites impacted by sewage) and to compare their distribution along this gradient of anthropogenic influence. We identified ARGs in microbial mats, lake water and aerosols throughout the Resolute Bay watershed. We also found that microbial mats in the contaminated region had the highest diversity of ARGs relative to uncontaminated sites, and that this may be a remnant signal of the introduction of waste water. Although we identified ARGs predominantly in the genomes of bacteria, our data suggests, for the first time, that some giant viruses are capable of harbouring ARGs.

La souche arctique Mesorhizobium sp. N33 est une bactérie psychrotrophe reconnue comme l'un des rhizobiums fixateurs d'azote le mieux adapté au froid. Le profil transcriptomique et métabolomique de la souche arctique N33 a été déterminé en identifiant les patrons d'expression génétique et les changements des metabolites sous différents stress hypothermiques. Des études utilisant des macropuces et des micropuces d'ADN et la PCR quantitative en temps réel ont montré que différentes fonctions cellulaires sont significativement affectées à basse température. Les chaperonnes, les protéines de choc au froid, la transcription, la traduction, les fonctions membranaires, les métabolismes, les systèmes de transport des éléments nutritifs, la génération d'énergie, l'accumulation de cryoprotectants (polyamines et mannitol), la detoxification des espèces réactives à oxygène (ROS), l'activité xylukinase, des facteurs de transcription et des protéines ayant des fonctions inconnues sont significativement régulés à la hausse à basse température. Beaucoup moins de gènes sont régulés à la baisse à basse température et appartiennent à diverses classes dont le métabolisme général, la motilité cellulaire, les systèmes de transport et de sécrétion, qui indiquent dans leur ensemble une baisse du métabolisme et de la dépense énergétique à basse température. Des études métabolomiques, utilisant la Chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse et la résonance magnétique nucléaire, indiquent que la souche arctique N33 régule les niveaux de plusieurs composés. L'acide linoléique polyinsaturé (18:2(9, 12)) et l'acide gras polyinsaturé 18:2 (6, 9) sont les acides gras les plus abondants pour les conditions de cultures à basse température (4 et 10°C). L'acide gras phospho/neutre mono-insaturé 14:1(11) était le plus induit (45 fois plus élevé) lh de choc au froid. Cet acide gras rend la membrane cellulaire plus fluide, permet la detoxification des cellules des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et agit comme source d'énergie pour les cellules. L'isobutyrate était hautement (19.4 fois plus élevé) augmenté à 4°C ce qui suggère que ce composé agit comme précurseur de la modification des acides gras à basses temperatures. Les analyses des voies métaboliques des composées hydrosolubles indiquent la présence de niveaux élevés des metabolites sarcosine et glycine à faible température suggérant que ces composés agissent comme cryoprotectants, ce qui pourrait avoir un impact substantiel sur l'adaptation au froid. La souche N33 démontre plusieurs changements moléculaires reliés à sa capacité de tolérance au froid. Les résultats préliminaires sur le séquençage de la souche N33 et son assemblage en 46 segments (7.13Mbps) sont aussi rapportés dans cette thèse.

Together with the current antibiotic resistance crisis, bacterial persistence appears to play an increasingly important role in the frequent failure of antibiotic treatments. Persister cells are rare bacteria that transiently become drug tolerant, allowing them to survive lethal concentrations of bactericidal antibiotics. Upon antibiotic removal, persister cells are able to resume growth and give rise to a new bacterial population as sensitive to the antibiotic as the original population. Interest in persister cells seriously increased in the past few years as these phenotypic variants were shown to be involved in the recalcitrance of chronic infections, such as tuberculosis and pneumonia and in the well-known biofilm tolerance to antibiotics. Persistence has therefore been extensively studied throughout the last decade, which led to the discovery of large variety of different molecular mechanisms involved in persisters formation. However, the specific physiology of bacterial persisters remains elusive up to now, mainly because of the transient nature and the low frequencies of persister cells in growing bacterial cultures. This work aims to gain a better understanding of the physiology of Escherichia coli persisters by combining population analyses with single-cell observations.In the first part of this thesis, we developed an experimental method allowing for measuring persistence with increased reproducibility. The method was further refined, which allowed us to observe four distinct phases in the ofloxacin time-kill curve, suggesting the existence of a tolerance continuum at the population level at treatment time. Characterization of these four phases notably revealed that the growth rate and the intrinsic antibiotic susceptibility of the strain define the number of surviving cells at the onset of the persistence phase, while persister cells survival mainly relies on active stress responses (SOS and stringent responses in particular).We next investigated the molecular mechanisms underlying the well-known correlation between persistence and the growth rate. Interestingly, we showed that the growth rate determines the number of survival cells at the onset of the persistent phase, whereas it does not affect the death rate of persister cells during antibiotic treatment. Furthermore, slow growth was shown to influence survival to ofloxacin independently of the replication rate, thereby suggesting that target inactivation solely cannot explain this correlation. However, our preliminary data indicate that ppGpp induction upon ofloxacin exposure substantially increases in slow growing bacterial populations, supporting a model in which slow growth would allow bacteria to respond faster to the antibiotic treatment, thereby generating more persisters than fast growing bacterial populations.Finally, both population and single-cell analyses were performed to assess the influence of the SOS response on persistence to ofloxacin. Firstly, population analyses revealed that the SOS response is required for survival of both sensitive and persister cells, but only during recovery, after ofloxacin removal, presumably allowing cells to induce SOS-dependent DNA repair pathways, required to deal with the accumulated ofloxacin-induced DNA lesions. The SOS response therefore appears as a good target for anti-persisters strategies, as shown by the 100-fold decrease in persistence upon co-treatment of a bacterial population with an SOS-inhibitor and ofloxacin. Secondly, single-cell analyses revealed that persister cells sustain similar DNA damages than sensitive cells upon ofloxacin treatment and induce SulA- and SOS-independent filamentation upon antibiotic removal, probably reflecting the presence of remaining cleaved complexes, formed during ofloxacin exposure. Importantly, we showed filamentation to occur in persister cells upon ampicillin treatment as well, thereby suggesting these filaments to be part of a more general survival pathway, which molecular basis remains unknown. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'objet de cette thèse de bioinformatique est de mieux comprendre l’ensemble des systèmes de régulation génique chez les bactéries. La disponibilité de centaines de génomes complets chez les bactéries ouvre la voie aux approches de génomique comparative et donc à l’étude de l’évolution des réseaux transcriptionnels bactériens. Dans un premier temps, nous avons implémenté et validé plusieurs méthodes de prédiction d’opérons sur base des génomes bactériens séquencés. Suite à cette étude, nous avons décidé d’utiliser un algorithme qui se base simplement sur un seuil sur la distance intergénique, à savoir la distance en paires de bases entre deux gènes adjacents. Notre évaluation sur base d’opérons annotés chez Escherichia coli et Bacillus subtilis nous permet de définir un seuil optimal de 55pb pour lequel nous obtenons respectivement 78 et 79% de précision. Deuxièmement, l’identification des motifs de régulation transcriptionnelle, tels les sites de liaison des facteurs de transcription, donne des indications de l’organisation de la régulation. Nous avons développé une méthode de recherche d’empreintes phylogénétiques qui consiste à découvrir des paires de mots espacés (dyades) statistiquement sur-représentées en amont de gènes orthologues bactériens. Notre méthode est particulièrement adaptée à la recherche de motifs chez les bactéries puisqu’elle profite d’une part des centaines de génomes bactériens séquencés et d’autre part les facteurs de transcription bactériens présentent des domaines Hélice-Tour-Hélice qui reconnaissent spécifiquement des dyades. Une évaluation systématique sur 368 gènes de E.coli a permis d’évaluer les performances de notre méthode et de tester l’influence de plus de 40 combinaisons de paramètres concernant le niveau taxonomique, l’inférence d’opérons, le filtrage des dyades spécifiques de E.coli, le choix des modèles de fond pour le calcul du score de significativité, et enfin un seuil sur ce score. L’analyse détaillée pour un cas d’étude, l’autorégulation du facteur de transcription LexA, a montré que notre approche permet d’étudier l’évolution des sites d’auto-régulation dans plusieurs branches taxonomiques des bactéries. Nous avons ensuite appliqué la détection d’empreintes phylogénétiques à chaque gène de E.coli, et utilisé les motifs détectés comme significatifs afin de prédire les gènes co-régulés. Au centre de cette dernière stratégie, est définie une matrice de scores de significativité pour chaque mot détecté par gène chez l’organisme de référence. Plusieurs métriques ont été définies pour la comparaison de paires de profils de scores de sorte que des paires de gènes ayant des motifs détectés significativement en commun peuvent être regroupées. Ainsi, l’ensemble des nos méthodes nous permet de reconstruire des réseaux de co-régulation uniquement à partir de séquences génomiques, et nous ouvre la voie à l’étude de l’organisation et de l’évolution de la régulation transcriptionnelle pour des génomes dont on ne connaît rien.<p><p>The purpose of my thesis is to study the evolution of regulation within bacterial genomes by using a cross-genomic comparative approach. Nowadays, numerous genomes have been sequenced facilitating in silico analysis in order to detect groups of functionally related genes and to predict the mechanism of their relative regulation. In this project, we combined prediction of operons and regulons in order to reconstruct the transcriptional regulatory network for a bacterial genome. We have implemented three methods in order to predict operons from a bacterial genome and evaluated them on hundreds of annotated operons of Escherichia coli and Bacillus subtilis. It turns out that a simple distance-based threshold method gives good results with about 80% of accuracy. The principle of this method is to classify pairs of adjacent genes as “within operon” or “transcription unit border”, respectively, by using a threshold on their intergenic distance: two adjacent genes are predicted to be within an operon if their intergenic distance is smaller than 55bp. In the second part of my thesis, I evaluated the performances of a phylogenetic footprinting approach based on the detection of over-represented spaced motifs. This method is particularly suitable for (but not restricted to) Bacteria, since such motifs are typically bound by factors containing a Helix-Turn-Helix domain. We evaluated footprint discovery in 368 E.coli K12 genes with annotated sites, under 40 different combinations of parameters (taxonomical level, background model, organism-specific filtering, operon inference, significance threshold). Motifs are assessed both at the level of correctness and significance. The footprint discovery method proposed here shows excellent results with E. coli and can readily be extended to predict cis-acting regulatory signals and propose testable hypotheses in bacterial genomes for which nothing is known about regulation. Moreover, the predictive power of the strategy, and its capability to track the evolutionary divergence of cis-regulatory motifs was illustrated with the example of LexA auto-regulation, for which our predictions are remarkably consistent with the binding sites characterized in different taxonomical groups. A next challenge was to identify groups of co-regulated genes (regulons), by regrouping genes with similar motifs, in order to address the challenging domain of the evolution of transcriptional regulatory networks. We tested different metrics to detect putative pairs of co-regulated genes. The comparison between predicted and annotated co-regulation networks shows a high positive predictive value, since a good fraction of the predicted associations correspond to annotated co-regulations, and a low sensitivity, which may be due to the consequence of highly connected transcription factors (global regulator). A regulon-per-regulon analysis indeed shows that the sensitivity is very weak for these transcription factors, but can be quite good for specific transcription factors. The originality of this global strategy is to be able to infer a potential network from the sole analysis of genome sequences, and without any prior knowledge about the regulation in the considered organism. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished