Reproduction de : Thèse de doctorat : Génétique et biotechnologie végetale : Toulouse, INPT : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 200 réf.

La maladie d’Alzheimer est la plus commune des formes de démence qui touche presque cinquante millions de personnes dans le monde. Les symptômes les plus fréquents sont la perte de mémoire, la difficulté à planifier des tâches et des confusions temporelles et spatiales. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour cette maladie. La protéine précurseur de l’amyloïde (APP) est habituellement coupée par l’enzyme alpha-sécrétase, cependant une coupure anormale par la bêta-sécrétase conduit à la formation de peptides bêta-amyloïdes, qui forment des agrégats s’accumulant sous forme de plaques dans le cerveau des patients Alzheimer. De nombreuses mutations du gène APP sont à l’origine de changements dans la séquence d’acides aminés de la protéine, responsable d’une accumulation accrue de plaques. Ces mutations sont appelées formes familiales de la maladie d’Alzheimer ou FAD (Familial Alzheimer’s disease). Cependant il a été découvert qu’une forme de FAD d’APP (mutation islandaise A673T) présente dans une population d’Europe nordique, différant d’une seule paire de bases du gène normal dans l’exon 16, modifiant une alanine de la protéine en thréonine qui réduit de 40% sa coupure par la bêta-sécrétase. La découverte de la technologie CRISPR/Cas9 ouvre de nouvelles perspectives pour le développement de traitements préventifs ou curatifs des maladies génétiques et dans notre cas Alzheimer. L’endonucléase Cas9 peut couper l’ADN double brin du génome en étant guidée par un ARNg et en reconnaissant une séquence cible « protospacer » suivie d’un PAM (protospacer adjacent motif). Depuis 2016, une optimisation du système CRISPR appelée édition de base permet maintenant de modifier de façon très précise la base cytidine enthymine et les guanines en adénines sur le brin opposé de l’ADN. Le premier article de cette thèse vise à démontrer que l’ajout de la forme FAD A673Ten codominance avec une autre forme pathologique provoque ou non des répercussions bénéfiques sur la sécrétion de peptides amyloïde-beta. Les expériences ont été réalisées avec des plasmides, permettant de visualiser un effet maximum de la mutation A673T. Il était important de déterminer si cette mutation était protectrice en codominance pour assurer une approche thérapeutique la plus polyvalente possible. Nous avons confirmé cet effet bénéfique sur une majorité de formes FAD et en particulier sur la mutation London V717I.Le deuxième article de cette thèse traite de l’introduction de la mutation A673T par un système dérivé de CRISPR/Cas9, l’édition de base. Plusieurs modèles d’éditeurs de base ont été comparés et optimisés dans le but d’obtenir une modification du génome aussi efficace et précise que possible. Un candidat a été sélectionné après des tests sur cellules modèles HEK 293T et neuroblastomes SH-SY5Y.La troisième partie de ce manuscrit présente les résultats obtenus lors de l’insertion de cet éditeur de base dans des vecteurs viraux dans le but d’infecter des modèles de neurones humains et murins présentant des formes FAD. L’ensemble de cette démarche a permis d’ouvrir une nouvelle avenue à une potentielle thérapie pour la maladie d’Alzheimer. / Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia in the world, withnearly fifty million people affected currently. The most common symptoms of this diseaseare memory loss, difficulties in task management, and temporal and spatial confusions. There is currently no treatment for this disease. The amyloid precursor protein (APP) is usually cut by the alpha-secretase enzyme; however, abnormal cleavage by the beta-site APP cleaving enzyme 1 (BACE1) leads to the formation of beta-amyloid peptides. These peptides in turn forms aggregates, which accumulate as plaques in the brains of Alzheimer patients. Many non-silent APP mutationscause changes to the amino acid composition of the protein and result in increased plaque accumulation. These mutations are called familial forms of Alzheimer’s disease (FAD).However, one of these mutations (Icelandic A673T mutation) has been shown to confer aprotection against the on set and development of AD. This mutation of a single mutation inexon 16 changes an alanine into a threonine and has been shown to reduce the cleavage ofthe APP protein by BACE1 by 40%.This kind of single point mutation is the perfect target for the newly discoveredCRISPR/Cas9 technology, which opens new perspectives for the development of preventiveor curative treatments for genetic diseases and in our case Alzheimer’s. The Cas9endonuclease is a powerful tool for the modification of genetic data. The protein has been shown to cut double-stranded DNA with the help of a guide RNA (gRNA) to target a specified sequence adjacent to a PAM (protospacer adjacent motif). The base CRISPRsystem has been coopted by many different research teams; one of which used the technology to develop a technique they called base editing. This technique allows researchers toexchange cytidine bases for thymine and guanine bases for adenine with a strong accuracy. The first article of this thesis aims to demonstrate that the addition of the A673Tmutation in codominance with another pathological form of AD may have beneficial effectson the reduction of beta-amyloid peptides in patients’ brains. To determine if the mutationwas protective, plasmids carrying the A673T mutation along with another random FADmutation were used. Ultimately, we confirmed the beneficial effect for many forms of FAD,in particular the London V717I mutation demonstrated the greatest reduction in beta amyloidproteins. The second article of this thesis deals with the insertion of the A673T mutation by theCRISPR/Cas9 derived system, base editing. Several base editor complexes were compared and optimized to achieve the most effective and accurate genome modification possible. A candidate was selected after testing on HEK293T cells and SH-SY5Y neuroblastoma. The third part of this manuscript presents the results obtained when using lentiviraland AAV vectors to infect induced human and mouse neurons with a base editor complex and harvested mouse neurons with FAD forms. This whole approach has opened up an avenue for a potential therapy for Alzheimer’sdisease.

Le système de correction des mésappariements (MMR) des eucaryotes est responsable de la correction des erreurs de réplication de l'ADN et intervient dans la recombinaison méiotique. AtPMS1, un gène du MMR chez Arabidopsis thaliana, est impliqué dans la correction des mésappariements, mais son rôle méiotique n’a pas encore été déterminé. Nous avons caractérisé deux lignées mutantes pour le gène AtPMS1. Une lignée présente une morphologie florale aberrante qui est probablement indépendante de l’inactivation d’AtPMS1 mais serait plutôt attribuable à un phénomène de cosuppression. La seconde lignée présente plusieurs phénotypes vraisemblablement causés par l'inactivation d’AtPMS1 : une baisse de fécondité de 65 à 80 %, une ségrégation biaisée de l'allèle mutant et des anomalies cytogénétiques chez 16 % des microsporocytes (fragmentation et ségrégation anormale des chromosomes). Le biais de ségrégation n’a encore jamais été observé chez les autres eucaryotes et semble particulier aux homologues de MutL chez A. thaliana ou chez les plantes. / The eukaryotic DNA mismatch repair system (MMR) is responsible for the repair of replication errors, and plays a role in genetic recombination. AtPMS1, a MMR gene from Arabidopsis thaliana, has already been shown to play a role in DNA repair but its involvement in meiosis has yet to be examined. We characterised two lines of insertional mutants at AtPMS1. A first mutant line has abnormal flowers, which is probably a phenotype unrelated to the loss of AtPMS1 activity but rather caused by cosuppression. The second mutant line shows many phenotypes, likely linked to AtPMS1 inactivation: a 65 to 80% reduction in seed production, an abnormal segregation of the mutant allele and cytogenetic abnormalities in 16% of the microsporocytes (chromosome fragmentation and missegregation). The observed bias in segregation as not been observed in other eukaryotes, and seems to be a particularity of MutL homologues in Arabidopsis or plants as a whole.

Le champignon Pseudozyma flocculosa a été particulièrement étudié pour son activité de lutte biologique contre le blanc. Par génie génétique, une molécule à activité antifongique, la flocculosine, a été isolée et caractérisée. Suite à ces travaux, l'utilisation des champignons du genre Pseudozyma pour la production de protéines recombinantes a présenté un nouvel axe de recherche. Toutefois, la variété des outils moléculaires disponibles pour l'étude des Pseudozyma spp. est limitée aux séquences régulatrices (promoteur, terminateur) du gène HSP70 d'un champignon voisin, Ustilago maydis. Les objectifs de notre recherche étaient donc les suivants : 1) obtenir des séquences promotrices de P. flocculosa; 2) comparer l'activité de ces séquences promotrices avec le promoteur HSP70; et 3) démontrer l'utilité de ces outils moléculaires dans le contexte d'une nouvelle approche d'étude de l'écologie de P. flocculosa. Dans un premier temps, un promoteur spécifique a été ciblé, soit le promoteur du gène d'actine car celui-ci est reconnu comme étant fort et constitutif chez d'autres champignons. En parallèle, un promoteur dont les transcrits étaient parmi les plus abondants dans des conditions de cultures déterminées a été identifié et cloné. Le gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate-déshydrogénase (GPD), une enzyme importante du métabolisme carboné de la cellule, a donc pu être cloné et séquencé. Nous avons ainsi obtenu 1133 pb de la séquence promotrice du gène d'actine et 1139 pb du gène GPD de P. flocculosa. Dans un deuxième temps, la comparaison de la force de ces deux promoteurs avec celle du promoteur HSP70 a permis d'établir que les promoteurs d'actine et de GPD présentaient une activité forte chez P. flocculosa et comparable à celle de HSP70 chez P. antarctica. Enfin, le développement d'une souche de P. flocculosa (Act4) exprimant de façon constitutive la GFP a permis son observation in situ pendant l'interaction tritrophique plante-agent pathogène-agent de lutte biologique. Il a ainsi été possible de montrer que P. flocculosa ne présentait pas de croissance remarquable en absence du blanc sur la feuille et ce, quelle que soit la plante-hôte utilisée. Néanmoins, en présence des structures du champignon pathogène, le développement de la souche Act4 était clairement stimulé.

Septoria musiva (téléomorphe Mycosphaerella populorum) est un Ascomycète responsable de chancres sur tronc et jeunes branches en peupleraies et de taches foliaires en peupleraies et forêts. S. populicola (M. populicola) est responsable de taches foliaires sur peupliers. L’objectif de mon projet consiste à mettre en place un système de transformation à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens pour ces deux champignons. A. tumefaciens est la bactérie causant la galle du collet, mais qui est utilisée couramment lors de transformation de végétaux et de champignons. Une première expérience a permis d’obtenir des transformants pour S. musiva avec le plasmide pPT1, mais aucun transformant n’a été obtenu pour S. populicola. Par la suite, un autre plasmide a été utilisé : pPL1. Cependant aucune souche transformée n’a pu être obtenue pour S. musiva, et S. populicola, malgré la vérification de différents paramètres. L’absence de transformant chez S. populicola peut être attribuée à un nombre insuffisant de conidies, tandis que pour S. musiva, un nombre insuffisant de bactéries ou un protocole de transformation non optimal pourrait expliquer les échecs successifs. / Seporia musiva (Mycosphaerella populorum) is an Ascomycota which causes canker and leafspot on hybrid poplar. S. populicola (M. populicola) only causes leafspot. The aim of my project was to transform these two fungi with Agrobacterium tumefaciens, a bacterium which causes Crown gall, and is commonly used to transform plant and fungi in laboratory. In a first experiment, transformation using plasmid pPT1 were successful for S. musiva, but not for S. populicola. However, no transformants were obtained from either S. musiva and S. populicola in subsequent experiments in which plasmid pPL1 was used and different parameters were tested. A possible explanation for the inhability to obtain transformants from S. populicola is the low number of conidia available for transformation experiments. In the case of S. musiva, low number of bacterial cells and non optimal protocols might explain negative results observed.