Les inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs) sont une nouvelle classe thérapeutique ayant connu un grand essor ces dix dernières années. Inhibiteurs compétitifs de l’adénosine triphosphate (ATP), ils sont utilisés dans le traitement de nombreux cancers dans lesquels une dérégulation de tyrosine kinases a été mise en évidence. Malgré une efficacité prouvée, des cas de résistance sont rapportés, en particulier avec l’exemple de la leucémie myéloïde chronique (LMC) et le traitement par ITK. Cette variabilité inter-individuelle peut être due à des mécanismes de résistance propre de la cellule tumorale ou à des variations dans les paramètres pharmacocinétiques de la molécule. De nombreuses études ont analysé l’impact de polymorphismes (SNPs) dans des gènes codants pour les déterminants pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des ITKs. Nous avons analysé l’impact de SNPs sur l’obtention de la réponse moléculaire majeure à 1 an dans 2 cohortes de patients atteints de LMC et traités par imatinib. C1236T, G2677T/A et C3435T, 3 SNPs du gène MDR-1 codant pour la glycoprotéine P et les SNPs de la région codante du gène SLC22A1 à l’origine du transporteur d’influx hOCT1. L’impact bénéfique de l’allèle 1236T ou haplotype *4 et l’impact péjoratif de l’allèle 2677G ou haplotype *1, retrouvés dans la 1ère cohorte n’ont pas été retrouvés dans la 2ième cohorte suggérant un impact mineur voire nul de ces derniers sur la réponse à l’imatinib. L’impact des SNPs de SLC22A1 observés dans la 2ième cohorte nécessite d’être confirmé. Des travaux supplémentaires à plus grande échelle, selon des critères nécessitant d’être harmonisés, sont nécessaires avant d’espérer pouvoir aboutir à une «médecine personnalisée» pour l’imatinib mais également de façon générale pour l’ensemble des ITKs. / Tyrosine kinases inhibitors (TKIs) are a new class of drugs having bloomed over the past decade. As competitive inhibitors of the adenosine triphosphate, they are used in the treatment of many cancers in which deregulation of tyrosine kinases has been demonstrated. In spite of dramatic efficacy, cases of resistance have been reported particularly with chronic myeloid leukemia (CML) and TKI treatment. This inter-individual variability may be due to mechanisms of intrinsic resistance of tumor cells or changes in the pharmacokinetic parameters of the molecule. Numerous studies have analyzed the impact of polymorphisms (SNPs) in genes coding for pharmacokinetic and pharmacodynamic determinants. We analyzed the impact of SNPs on major molecular response at 1 year in 2 cohorts of patients with CML treated with imatinib. C1236T, G2677T/A, C3435T, three SNPs in the MDR-1 gene encoding P-glycoprotein and SNPs in the coding region of the SLC22A1 gene encoding hOCT1. The protective impact of the 1236T allele or haplotype*4 and the pejorative impact of the 2677G allele or haplotype*1, found in the 1st cohort, were not replicated in the 2nd cohort, suggesting minor or no impact on the response to imatinib. The impact of SLC22A1 SNPs observed in the 2nd cohort needs to be confirmed. Further works on a larger cohort, according to criteria that need to be harmonized, are necessary before we reach a “personalized medicine” for imatinib but also for all TKIs

L’étude des mécanismes aboutissant à la tumorigénèse a permis de révéler, dans beaucoup de cancers, une amplification ou une mutation de divers oncogènes, avec pour conséquence des capacités de prolifération et de survie accrues pour la cellule tumorale. L’identification des protéines kinases comme étant des éléments centraux de ces processus en ont fait des cibles thérapeutiques prometteuses. Plusieurs inhibiteurs ciblant de façon plus ou moins spécifique les tyrosines kinases oncogéniques ont ainsi été développés. Parmi eux, l’imatinib mesylate (Gleevec®, Novartis) a constitué la première chimiothérapie ciblée. Il correspond aujourd’hui au traitement de première intention contre la LMC. Cependant, malgré sa très grande efficacité, il est apparu que certains mécanismes de résistances pouvaient être mis en place pour diminuer son effet pro-apoptotique. Le travail de cette thèse a consisté à mieux comprendre les mécanismes d’apoptose induits par les inhibiteurs de tyrosine kinases (ITK), et à rechercher quelles voies alternatives de survie devront être bloquées pour leur assurer une meilleure efficacité. Trois modèles ont été utilisés : la leucémie myéloïde chronique (LMC), les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) et les glioblastomes (GBM). La LMC a été utilisé comme modèle et la démarche utilisé pour essayer d’augmenter l’efficacité des ITK, a été transposée aux modèles des LAM et des GBM. L’ensemble des résultats obtenus a démontré qu’une meilleure compréhension de la réponse apoptotique et des mécanismes de résistance permettait l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons pu observer que, tout en favorisant la diminution des doses de molécules administrées, l’inhibition simultanée de plusieurs cibles apportait plusieurs bénéfices. Elle permet d’augmenter l’action pro-apoptotique des ITK, de contrer certains mécanismes de résistances, d’atteindre la cellule souche cancéreuse résistance et par conséquent de cibler simultanément des populations a plusieurs de stades de différenciation. / Protein kinases have been identified as playing fundamental roles in cancer development, suggesting that they could represent a promising therapeutic target. Several kinase inhibitors have been developed and the most successful of them, by far, is Gleevec® (imatinib, STI57; Novartis), a BCR-ABL inhibitor. It is currently used as the treatment of reference for chronic myeloid leukemia. However, despite a huge efficiency, some resistance mechanisms could be used to decrease its pro-apopototic effect. The global aim of my PhD was to understand the apoptotic mechanisms induced by tyrosine kinase inhibitors (TKI) to identify new potential therapeutic targets. I work on three different tumors: Chronic Myeloid Leukemia (CML), Acute Myeloid Leukemia (AML) and Glioblastomas (GBM). CML has been used as a model and the approach followed to increase TKI efficiency has been transposed to AML and GBM models. Altogether, our results showed that a better understanding of apoptotic response and resistance mechanisms could lead to the identification of new therapeutic targets. We observed that combination therapy brings several benefits. It allows to increase the TKI-induced apoptotic response, to counter some resistance mechanism, to reach the resistant cancer stem cells, and thus, to target simultaneously several populations in the tumour.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une transformation maligne d'une cellule souche hématopoïétique, caractérisée par une anomalie génétique acquise : le chromosome Philadelphie (Ph), résultant de la translocation réciproque t(9 ;22)(q34 ;q11), et son équivalent moléculaire, l'oncogène BCR-ABL. La protéine BCR-ABL présente une activité tyrosine kinase constitutive qui agit sur les voies de survie et de prolifération. La progression de la maladie vers la phase accélérée puis blastique s'accompagne d'anomalies génétiques additionnelles marqueurs d'une instabilité génomique croissante. La responsabilité de BCR-ABL dans la genèse de cette instabilité génomique est fortement suspectée. Dérivé de 2-phénylamino-pyrimidines, l'Imatinib inhibe l'activité tyrosine kinase de BCR-ABL ainsi que la prolifération de lignées cellulaires BCR-ABL positives et induit leur apoptose. Les échecs du traitement par l'Imatinib sont dus à des mécanismes de résistance qui ne sont pas tous entièrement caractérisés. Des nouveaux inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs) ou des associations avec l'Imatinib ont été développés afin de la surmonter. Cependant, une résistance croisée et multiple demeure difficile à traiter et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes de résistance afin d'éradiquer la maladie dans un avenir proche. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont montré que la présence de microremaniements génétiques (traduisant une instabilité) au sein de progéniteurs leucémiques CD34+ de patients traités par l'Imatinib corrélait avec la perte de réponse à l'Imatinib chez les patients diagnostiqués en phase chronique, suggérant que la résistance à l'Imatinib pourrait être corrélée aux altérations génétiques survenant précocement dans la physiopathologie de la maladie. 113 gènes affectés ont été détectés dont certains sont localisés dans des régions connues pour être hypervariables (CNV) suggérant un rôle de ces régions dans le développement de la LMC ou la résistance à l'Imatinib. Nous avons mis en évidence la présence d'une anomalie acquise récurrente dans telle région localisée en 8p23.1 qui groupe les gènes de la famille de la Défensine B. Ce microremaniement n'est pas lié à la résistance à l'Imatinib car il est retrouvé dans les populations cellulaires CD34+ Ph+ et Ph-, il peut donc être considéré comme un marqueur de l'instabilité d'une sous-population cellulaire clonale de CD34+ présentant une grande prédisposition à acquérir des altérations génétiques additionnelles, comme la fusion BCR-ABL. Nos études montrent que des altérations secondaires pourraient être le support d'une résistance à l'Imatinib. La résistance à l'Imatinib peut alors être liée à la dérégulation des voies de signalisation en amont ou en aval de BCR-ABL, affectant ainsi la prolifération, la survie, la différenciation et l'intégrité du génome. Il semble donc que le traitement par l'Imatinib seul ne soit pas suffisant pour éradiquer la maladie. Pour cette raison, de nouvelles molécules à associer avec l'Imatinib sont actuellement en cours d'évaluation. Parmi ces associations, les inhibiteurs de la voie Ras ont montré une certaine efficacité dans la restauration de l'activité proapoptotique de l'Imatinib. Il était donc intéressant de chercher une cible thérapeutique régulant négativement cette voie afin de surmonter cette résistance. GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) inhibe la voie Ras/Raf par une interaction directe. Il inhibe également la voie NFκB dont certains antagonistes sont capables de surmonter la résistance à l'Imatinib. Nos résultats montrent, pour la première fois, que l'expression de GILZ est diminuée dans des lignées humaines ou murines exprimant BCR-ABL sensibles ou résistantes aux ITKs ainsi que dans les cellules dormantes résiduelles isolées d'un modèle cellulaire murin développé au laboratoire. L'expression forcée de GILZ dans ces lignées résistantes restaure la sensibilité à l'Imatinib. Nos résultats montrent que le mécanisme passe par une inhibition de la voie mTORC2/Akt Ser473. Elle est due à une interaction directe de GILZ avec mTORC2 permettant l'activation de FoxO3a et l'induction de l'expression de la protéine proapoptotique Bim. Dans ce système, GILZ augmente l'expression de Bim tandis qu'Imatinib, par ses effets "Off-target", diminue celle de Mcl-1 inversant ainsi le rapport des membres antiapoptotiques/proapoptotiques de la famille Bcl-2 et entrainant l'apoptose. Le traitement séquentiel par les glucocorticoïdes puis l'Imatinib induit l'apoptose de cellules souches de patients résistants par le même mécanisme, suggérant que la modulation de l'expression de GILZ pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour cibler les cellules leucémiques résistantes ou résiduelles. La régulation de la voie mTORC2/Akt Ser473 semble être d'une importance cruciale dans la survie des cellules BCR-ABL+, ainsi que dans la résistance aux ITKs. Parmi les gènes méthylés dans notre étude, on retrouve un gène impliqué dans la régulation de cette voie et qui code pour la phosphatase PHLPP (PH domain and Leucine rich repeat Protein Phosphatase) dont l'activité est de déphosphoryler la sérine 473 d'Akt favorisant son inactivation. Nos résultats montrent que la réexpression du variant 1 de cette phosphatase (PHLPP1) dans notre modèle murin de résistance restaure la sensibilité à l'Imatinib et que la répression de celui-ci n'est pas exclusivement due à l'activité tyrosine kinase de BCR-ABL, mais aussi à des modifications épigénétiques. Nos études ont permis d'identifier des gènes impliqués dans la résistance des LMC aux ITKs et de proposer de nouveaux traitements pour surmonter cette résistance en inhibant la voie Akt Ser473

Les protéines kinases représentent le groupe d'enzymes qui servent d'intermédiaire pour la phosphorylation de protéines - le transfert d'un groupe phosphate de l'adénosine triphosphate(ATP) sur des chaînes latérales correspondantes de tyrosine, de serine ou de thréonine des acides aminées. La phosphorylation de protéines est un des outils les plus importants pour la régulation de l'activité cellulaire. La « signalisation » cellulaire par le récepteur de tyrosine kinase VEGFR2 (KDR) appartient aux réactions biochimiques clés influençant la croissance de tumeurs. L'inhibition thérapeutique de cette réaction à l'aide des composés de faible poids moléculaire spécifiques est devenue une stratégie utile dans le cadre des thérapies anticancéreuses. Ce travail a amené à la découverte de 16 substances biologiquement actives sur la base N,5-diaryloxazol-2-amine (IC50, VEGFR2 TK). D'excellents résultats ont été atteints notamment dans le cas des substances 189, 191, 211, 214, 220, 221, 223 et 4 qui montrent une activité inhibitrice inférieure à 500 nM. / Protein kinases represent a group of enzymes responsible for phosphorylation - transfer of aphosphate group from adenosine triphosphate (ATP) to tyrosine or serine/threonine residues. Protein phosphorylation is one of the most important tools regulating a cell activity. A cell "signalization" through an endothelial receptor tyrosine kinase VEGFR2 TK (KDR) is the important pathway influencing growth of a tumor. Small-molecule inhibitors of VEGFR2 TK (VEGFR2 TKls) have become an important tool for the treatment of various types of cancer. This dissertation thesis resulted in a discovery of 16 biologically active N,5-diaryloxazol-2-amines (IC50, VEGFR2 TK). Very good results were achieved especially with compounds 189, 191, 211, 214, 220, 221, 223 and 4 exhibiting the activity under 500 nM.

Les cancers hépatiques, bronchiques et mammaires sont responsables de 35 % de décès par le cancer en 2012. Les études sur des facteurs contribuant à la progression tumorale devraient approfondir nos connaissances sur la biologie de ces cancers et ouvrir de nouvelles voies pour le développement de stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons étudié l'impact de la neurotensine (NTS) et de son récepteur NTSR1 sur la progression tumorale et son rôle potentiel pour de futures applications cliniques. J’ai initié ce projet dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) et participé aux projets dans le cancer du poumon et du sein qui avaient été initiés par les anciens doctorants de l’équipe. Dans le CHC, sur une série de 73 patients, la NTS et le NTSR1 ont été détectés dans respectivement 56 % et 64 % des cas. En utilisant deux modèles cellulaires nous avons montré que l’expression du NTSR1 est une cible de la voie wnt/β-caténine. Le couple NTS/NTSR1 augmente l’expression et l’activation de l’EGFR et favorise la croissance des tumeurs expérimentales et la capacité de migration et d’invasion des cellules. La régulation entre le complexe NTS/NTSR1 et les récepteurs des HERs a également été observée dans les cancers bronchiques et mammaires, la NTS induit l'expression et l'activation constitutive des récepteurs EGFR, HER2 et HER3, par l'intermédiaire de l'activation des métalloprotéinases qui libèrent les ligands “EGF-like” spécifiques d'EGFR et d’HER3. L’activation constitutive des HER par le couple NTS/NTSR1 mime les mutations activatrices des HERs, ainsi la réponse des tumeurs aux inhibiteurs de tyrosine kinase est potentialisée dans le cancer du poumon, du sein et du foie. / In 2012, Liver, lung and breast cancers represented 30% of new cancer cases, and 35% of cancer related deaths. Identification of factors contributing to tumor progression can strengthen our understanding of the cancer biology and suggest new therapeutic strategies. In this context, we studied the impact of neurotensin (NTS) and its receptor NTSR1 on tumor progression and its potential clinical application. I have initiated the project in hepatocellular carcinoma (HCC) and participated in the projects on lung and breast cancers initiated by former PhD students. In HCC, on a series of 73 patients, NTS and NTSR1 were detected in 56% and 64% of the cases, respectively. Meanwhile, I showed that NTSR1 expression is the target of the Wnt/¦Â-catenin pathway. The NTS / NTSR1 complex increases the expression and activation of EGFR and promotes the growth of experimental tumors and the ability of the cell for migration and invasion. The regulation between the NTS/NTSR1 complex and EGF receptors were also thoroughly studied in lung and mammary cancers. Indeed, NTS induced the expression and the constitutive activation of EGFR, HER2, and HER3, through the activation of metalloproteinases which released specific "EGF-like" ligands for EGFR and HER3. Constitutive activation of HERs by the NTS/NTSR1 complex mimics the activating mutations of HERs and therefore potentiates the tumor response to tyrosine kinase inhibitors treatment in liver, lung and breast cancers.

La caractérisation des tumeurs malignes et la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux sont essentielles pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Les criblages génétiques, devenus encore plus puissants avec la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9, le séquençage nouvelle génération et la bioinformatique, sont des outils formidables pour décrypter de nouveaux mécanismes cellulaires, dont la résistance au traitement. La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif qui est caractérisé par l’anomalie génétique t(9;22). Cette aberration chromosomique est à l’origine du gène de fusion BCR-ABL1 qui code l’oncogène du même nom responsable de la prolifération anarchique des cellules. L’imatinib mesylate, un inhibiteur de tyrosine kinase, élimine de manière spécifique les cellules leucémiques en ciblant et en bloquant l’activité kinase de cette protéine. Malheureusement, comme pour tout type de thérapie ciblée, une résistance au traitement survient chez certains patients. Afin de repérer des nouvelles voies de résistance à cet inhibiteur de tyrosine kinase, nous avons effectué un criblage génétique avec la librairie « genome-scale CRISPR knock-out » (GeCKO v2) in vitro dans la lignée cellulaire K562. Nous avons découvert plusieurs gènes qui semblent être essentiels pour la réponse au traitement par imatinib, tels que les facteurs pro-apoptotiques BIM et BAX, ou le répresseur de la voie des MAPK, SPRED2. Le rétablissement spécifique de l’apoptose dans les cellules BIM knock-out (KO) par des BH3-mimétiques, ou l’inhibition ciblée de la voie MAPK dans la lignée SPRED2 KO sensibilise de nouveau les lignées résistantes. Dans ce travail, nous avons découvert des mécanismes de résistance déjà connus (l’apoptose, la voie MAPK…) mais nous avons également démontré l’implication de voies peu connues telles que le complexe Mediator, la maturation de ARNm et l’ubiquitinylation de protéines. Spécifiquement cibler ces lésions génétiques avec des thérapies ciblées combinées peut permettre de surmonter les phénotypes de résistance et ouvre la porte à l’utilisation de l’oncologie de précision. / The characterization of malignant tumour growth and the understanding of resistance mechanisms to treatment in cancer is of utmost importance for the discovery of novel “druggable” targets. Efficient genetic screening, now even more possible with the convergence of CRISPR-Cas9 gene editing technology, next-generation sequencing and bioinformatics, is an important tool for deciphering novel cellular processes, such as resistance to treatment in cancer. Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder characterised by the t(9;22) genetic abnormality, which encodes the driver of CML, the BCR-ABL1 fusion protein. Imatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor, specifically eliminates CML cells by targeting and blocking the kinase activity of this protein, yet, as for all targeted therapies in cancer, resistance to treatment exists. In order to discover alternative BCR-ABL1 independent mechanisms of imatinib resistance, we utilized the genome-scale CRISPR knock-out library GeCKO v2 to screen for imatinib sensitising genes in vitro on K562 cells. We revealed genes that seem essential for imatinib induced cell death, such as pro-apoptotic genes (BIM, BAX) or MAPK inhibitor SPRED2. Specifically re-establishing apoptotic capabilities in BIM knock-out (KO) cells with BH3-mimetics, or inhibiting MAP-kinase signalling in SPRED2 KO cells with MEK inhibitors restores sensitivity to imatinib, overcoming resistance phenotypes. In this work, we discovered previously identified pathways (apoptosis, MAP-kinase signalling) and novel pathways that modulate response to imatinib in CML cell lines, such as the implication of the Mediator complex, mRNA processing and protein ubiquitinylation. Targeting these specific genetic lesions with combinational therapy can overcome resistance phenotypes and paves the road for the use of precision oncology.

Les Inhibiteurs de l'activité Tyrosine Kinase (ITK) de BCR-ABL (Imatinib (IMA), Nilotinib (NIL) et Dasatinib (DAS)) ont révolutionné le traitement de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC), mais la cinétique et l'intensité des réponses thérapeutiques restent variables. Par ailleurs, plusieurs travaux démontrent qu'il persiste chez la majorité des patients des cellules souches leucémiques (CSL) CD34+ résistantes aux ITK et capables de reconstituer la maladie. Partant du principe que la thérapie ciblée (les ITK) devait atteindre le compartiment cellulaire et du constat qu'aucune méthode ne permettait d'évaluer la quantité d'ITK dans les cellules malignes vivantes, nous avons développé un procédé en cytométrie en flux pour quantifier ces molécules dans les cellules de la LMC. Nous avons ainsi démontré que la mort cellulaire des lignées K562 et KCL22 à 24h est étroitement corrélée à la quantité d'IMA accumulée dès la 1ère heure. L'application du procédé aux cellules primaires a montré un taux intracellulaire d'ITK dépendant des caractéristiques des cellules et variable d'un sujet à l'autre (Article 1). Pour l'instant, en raison de l'hétérogénéité de notre cohorte, nous n'avons pas pu mettre en évidence de corrélation entre l'accumulation des ITK et la réponse thérapeutique de la LMC. Notre procédé nous a permis de suivre l'accumulation in vivo du DAS dans les blastes circulants d'un patient LMC en phase d'acutisation, en parallèle de la réactivation de pSyk348 - que nous avons identifié comme marqueur de progression - au moment de l'échappement au DAS (Article 2). Un avantage majeur du procédé est la possibilité d'analyser les différentes sous-populations, dont les cellules CD34+ de LMC. Ces dernières ont un taux d'ITK intracellulaire plus faible que les cellules matures, voire absent chez certains patients. Pour l'instant une corrélation significative avec les tests clonogéniques effectués en parallèle est retrouvée seulement avec le DAS. Enfin, nos résultats préliminaires suggèrent des différences entre les cellules CD34+ du sang et de la moelle. En conclusion, ce procédé permet d'évaluer la quantité d'ITK dans des sous-populations cellulaires précises et viables. Nous envisageons de poursuivre ce projet par l'évaluation de l'intérêt d'un dosage précoce du taux d'ITC intracellulaire in vivo (après la 4ème prise) d'une part et d'autre part par l'étude de l'influence du microenvironnement sur la résistance des CSL de LMC aux ITK et sur certaines dérégulations propres à ce compartiment cellulaire. / The Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) of BCR-ABL (Imatinib (IMA), Nilotinib (NIL) and dasatinib (DAS)) have revolutionized the treatment of Chronic Myeloid Leukemia (CML). However therapeutic responses remain variable. Moreover, several studies showed that most patients have persistent CD34+ leukemic stem cells (LSCs) resistant to TKI and the origin of disease relapse. Given that the targeted therapy (TKI) should reach malignant cells and that no method was able to assess the amount of TKI in viable target cells, we have developed a process by flow cytometry for TKI quantification in target cells. By using K562 and KCL22 cell lines we showed that cell death at 24hrs was closely related to IMA uptake after one hour of incubation. We then applied our method to primary cells and showed an intracellular level of IMA, NIL and DAS dependent on cell characteristics and heterogeneous from one subject to another (Article 1). Probably because of the heterogeneity of our series, we did not find any correlation between the accumulation of TKI and therapeutic response of CML. Moreover, we used our process to observe a decrease in DAS accumulation in vivo in circulating blasts of a CML patient with acute transformation, in spite of significant DAS uptake, we observed a recurrence of Syk phosphorylation in Y348 that we identified as a potential marker of acutisation, at the same time of disease resistance (Article 2). A major advantage of our process is the possibility to analyze the different cell subsets, including CD34+ CML cells. These cells had a lower (even absent in cells from some patients) level of intracellular TKI compared to mature cells. The clonogenic assays performed in parallel showed a significant correlation with DAS only. Finally, our preliminary results suggest differences between CD34+ cells from blood and those from bone marrow. In conclusion, our process allows evaluating the amount of TKI in viable cell subpopulations. This project will be continued with i) the study of the potential interest of the early evaluation of in vivo intracellular level of TKI (after the fourth dose) and ii) the influence of the microenvironment on CSL resistance to TKI and epigenetics deregulations.

Les formes réactives de l'oxygène (FRO) ont un rôle bien établi dans l'oncogénèse et le fonctionnement des cellules tumorales en augmentant les capacités de prolifération et d'invasion cellulaire. Les FRO présentent une moindre toxicité dans les cellules normales où le niveau de stress oxydant est bas et les systèmes d'oxydoréduction opérationnels. Une modulation pharmacologique de l'équilibre d'oxydoréduction permet d'améliorer l'efficacité des molécules cytotoxiques qui agissent sur les FRO. L'activité anti tumorale de la chimiothérapie étant médiée en partie par le stress oxydant, nous nous sommes dans un premier temps intéressé aux variations du stress oxydant lors d'un traitement par le sorafenib (Nexavar©), un inhibiteur de tyrosine kinases. Nous avons mis en évidence une activité anti tumorale du sorafenib liée à l'augmentation de la production d'anion superoxyde par les cellules. Ce phénomène nous a permis d'identifier un marqueur prédictif d'efficacité du sorafenib, le dosage des Produits d'Oxydation Avancée des Protéines (AOPP), dans le sérum des patients cirrhotiques développant un carcinome hépatocellulaire. Sachant que l'efficacité anti tumorale des chimiothérapies conventionnelles passe en partie par l'induction de FRO, nous nous sommes intéressés dans un deuxième temps au mangafodipir, un modulateur du stress oxydant, qui est connu pour augmenter l'index thérapeutique des agents cytotoxiques in vivo. Le mangafodipir diminue les effets toxiques du stress oxydatif dans des cellules non tumorales et potentialise l'activité anti tumorale de l'oxaliplatine. Ces données nous ont conduits à explorer in vivo et in vitro le mécanisme de la neurotoxicité induite par l'oxaliplatine et le rôle protecteur du mangafodipir. Nous avons ainsi observé dans un modèle murin que le mangafodipir prévient la neurotoxicité induite par l'oxaliplatine au niveau de la gaine de myéline. Nous avons confirmé ces résultats chez l'homme lors d'une étude de phase II. Compte tenu des taux plus élevés de FRO dans les cellules tumorales par rapport aux cellules normales, plusieurs stratégies ont été proposées pour cibler sélectivement les tumeurs sans endommager les tissus sains avec des modulateurs du stress oxydant. Notre troisième axe de travail a eu pour objectif d'identifier et de valider de nouvelles molécules liées à la modulation des FRO. Cette étude a été réalisée dans le cadre d'un projet du programme Européen Pierre et Marie Curie (International Training Network 7-FP7-2007-1-1-ITN201114), au sein du réseau REDCAT. Cette collaboration a permis de concevoir et de synthétiser de nouveaux agents thérapeutiques, les organochalcogenes. Nous avons mis en évidence in vitro et in vivo le potentiel anti tumoral de cette nouvelle classe thérapeutique et principalement celui du composé LAB027. Le LAB027 présente une activité anti tumorale seul ou associé à l'oxaliplatine. L'ensemble de ces travaux nous a permis d'envisager l'évaluation précoce de l'efficacité du sorafenib par un marqueur du stress oxydant, les AOPP, de mettre en évidence l'effet anti-neurotoxique d'un mimétique de la superoxyde dismutase, le mangafodipir et d'identifier une nouvelle classe médicamenteuse en oncologie, les organochalcogènes. Ces optimisations thérapeutiques permettent d'envisager une meilleure prise en charge des malades traités par chimiothérapie afin d'optimiser l'efficacité des traitements utilisés en oncologie.

FGFR3 est un récepteur cellulaire impliqué dans de nombreux processus biologiques chez l’homme. La dérégulation de l’activité tyrosine kinase de FGFR3 est à l’origine d’anomalies de croissance osseuse et de certains cancers (myélome multiple, vessie). Le blocage de ce récepteur par des inhibiteurs compétitifs de l’ATP constitue une approche thérapeutique intéressante. La première partie de la thèse a concerné la préparation d’analogues du PD173074, inhibiteur nanomolaire de FGFR3, issu de l’industrie. Basée sur un squelette pyrido[2,3-d]pyrimidine, une chimiothèque de triazoles a été obtenue via une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire catalysée au cuivre (I). Parmi les 27 analogues synthétisés, le meilleur inhibiteur restaure ex vivo la croissance osseuse de fémurs de souris naines. Dans une seconde partie, nous avons développé deux nouvelles séries d’inhibiteurs de type pyrazolooxadiazole et pyrazolo[4,3-d]pyrimidine, à partir d’un précurseur pyrazole commun. Des procédures micro-ondes rapides et efficaces ont été utilisées pour conduire aux composés cibles. L’étude des relations structure-activité, réalisée sur une soixantaine de composés, a été validée par modélisation moléculaire. Le composé le plus actif présente une CI50 submicromolaire / FGFR3 is a cellular receptor involved in many human biological processes. Deregulated tyrosine kinase activity of the FGFR3 is at the origin of abnormal bone growth and some cancers (multiple myeloma, bladder). Blocking this receptor by ATP competitive inhibitors may constitute an interestingtherapeutic approach. The first part of this thesis concerned the preparation of analogues of PD173074, a nanomolar inhibitor of FGFR3, stemming from the industry. Based on pyrido [2,3-d] pyrimidine skeleton, a library of triazoles was obtained via copper (I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition. Among the 27 analogues synthesized, the best inhibitor restores bone growth of dwarf mice femurs ex vivo. In a second part, we have developed two new series of inhibitors based on pyrazolooxadiazole and pyrazolo [4,3-d] pyrimidine skeletons, derived from a common pyrazole precursor. Rapid and efficient microwave procedures were used to yield the target compounds. The study of structure-activity relationships, performed on sixty compounds, was confirmed by molecular modeling. The most active compound has a submicromolar IC50 value.

Les formes réactives de l’oxygène (FRO) ont un rôle bien établi dans l’oncogénèse et le fonctionnement des cellules tumorales en augmentant les capacités de prolifération et d’invasion cellulaire. Les FRO présentent une moindre toxicité dans les cellules normales où le niveau de stress oxydant est bas et les systèmes d’oxydoréduction opérationnels. Une modulation pharmacologique de l’équilibre d’oxydoréduction permet d’améliorer l’efficacité des molécules cytotoxiques qui agissent sur les FRO. L’activité anti tumorale de la chimiothérapie étant médiée en partie par le stress oxydant, nous nous sommes dans un premier temps intéressé aux variations du stress oxydant lors d’un traitement par le sorafenib (Nexavar©), un inhibiteur de tyrosine kinases. Nous avons mis en évidence une activité anti tumorale du sorafenib liée à l’augmentation de la production d’anion superoxyde par les cellules. Ce phénomène nous a permis d’identifier un marqueur prédictif d’efficacité du sorafenib, le dosage des Produits d’Oxydation Avancée des Protéines (AOPP), dans le sérum des patients cirrhotiques développant un carcinome hépatocellulaire. Sachant que l’efficacité anti tumorale des chimiothérapies conventionnelles passe en partie par l’induction de FRO, nous nous sommes intéressés dans un deuxième temps au mangafodipir, un modulateur du stress oxydant, qui est connu pour augmenter l’index thérapeutique des agents cytotoxiques in vivo. Le mangafodipir diminue les effets toxiques du stress oxydatif dans des cellules non tumorales et potentialise l’activité anti tumorale de l’oxaliplatine. Ces données nous ont conduits à explorer in vivo et in vitro le mécanisme de la neurotoxicité induite par l’oxaliplatine et le rôle protecteur du mangafodipir. Nous avons ainsi observé dans un modèle murin que le mangafodipir prévient la neurotoxicité induite par l’oxaliplatine au niveau de la gaine de myéline. Nous avons confirmé ces résultats chez l’homme lors d’une étude de phase II. Compte tenu des taux plus élevés de FRO dans les cellules tumorales par rapport aux cellules normales, plusieurs stratégies ont été proposées pour cibler sélectivement les tumeurs sans endommager les tissus sains avec des modulateurs du stress oxydant. Notre troisième axe de travail a eu pour objectif d’identifier et de valider de nouvelles molécules liées à la modulation des FRO. Cette étude a été réalisée dans le cadre d’un projet du programme Européen Pierre et Marie Curie (International Training Network 7-FP7-2007-1-1-ITN201114), au sein du réseau REDCAT. Cette collaboration a permis de concevoir et de synthétiser de nouveaux agents thérapeutiques, les organochalcogenes. Nous avons mis en évidence in vitro et in vivo le potentiel anti tumoral de cette nouvelle classe thérapeutique et principalement celui du composé LAB027. Le LAB027 présente une activité anti tumorale seul ou associé à l’oxaliplatine. L’ensemble de ces travaux nous a permis d’envisager l’évaluation précoce de l’efficacité du sorafenib par un marqueur du stress oxydant, les AOPP, de mettre en évidence l’effet anti-neurotoxique d’un mimétique de la superoxyde dismutase, le mangafodipir et d’identifier une nouvelle classe médicamenteuse en oncologie, les organochalcogènes. Ces optimisations thérapeutiques permettent d’envisager une meilleure prise en charge des malades traités par chimiothérapie afin d’optimiser l’efficacité des traitements utilisés en oncologie. / Reactive oxygen species (ROS) forms have an established role in oncogenesis and tumor cell function by increasing the capacity of proliferation and cell invasion. ROS have a lower toxicity in normal cells where the level of oxidative stress is low and redox systems operational. Pharmacological modulation of redox balance enhances the effectiveness of cytotoxic molecules that act on the FRO. The anti-tumor activity of chemotherapy is mediated in part by oxidative stress, we initially interested in the changes of oxidative stress during treatment with sorafenib (Nexavar©), an inhibitor of tyrosine kinases. We have demonstrated anti-tumor activity of sorafenib due to increased production of superoxide anion by cells. This allowed us to identify a predictive marker of efficacy of sorafenib dosing Products Advanced Oxidation Protein (AOPP) in the serum of patients with cirrhosis develop hepatocellular carcinoma. Knowing that the antitumor efficacy of conventional chemotherapy is partly through the induction of ROS, we are interested in a second time mangafodipir, a modulator of oxidative stress, which is known to increase the therapeutic index of cytotoxic agents in vivo. Mangafodipir reduces the toxic effects of oxidative stress in non-tumor cells and potentiates the anti-tumor activity of oxaliplatin. These data led us to explore in vivo and in vitro the mechanism of neurotoxicity induced by oxaliplatin and the protective role of mangafodipir. We observed in a mouse model that mangafodipir prevents neurotoxicity induced by oxaliplatin in the myelin sheath. We confirmed these results in humans in a phase II study. Given the higher levels of ROS in tumor cells compared to normal cells, several strategies have been proposed to selectively target tumors without damaging healthy tissue with modulators of oxidative stress. Our third area of work has aimed to identify and validate novel molecules related to the modulation of ROS. This study was conducted as part of a project of the European Pierre et Marie Curie (International Training Network 7-FP7-2007-1-1-ITN201114) within the network REDCAT. This collaboration has led to the design and synthesis of new therapeutic agents, organochalcogenes. We have demonstrated in vitro and in vivo antitumor potential of this new therapeutic class and mainly composed of the LAB027. LAB027 the present anti-tumor activity alone or in combination with oxaliplatin. All of this work has allowed us to consider the early assessment of the effectiveness of sorafenib a marker of oxidative stress, the AOPP, highlight the anti-nerve of a superoxide dismutase mimetic, mangafodipir and identify a new class of drugs in oncology, organochalcogènes. These optimizations allow therapeutic consider better care of patients treated with chemotherapy to enhance the efficacy of treatments used in oncology.