Endossimbionte muito famosa e bem sucedida, a bactéria Wolbachia pipentis vive dentro de células de artrópodes e nematoides, e é conhecida por causar manipulações reprodutivas sobre seus hospedeiros, com o objetivo de aumentar sua própria frequência nas populações. Entretanto, apesar de ser conhecida classicamente como uma parasita reprodutiva, muitas evidências recentes demonstram que ela pode desenvolver relacionamentos mais amigáveis e estáveis com seus hospedeiros, mediante alguns acordos genéticos realizados com eles. Uma das características mais importantes de qualquer relação simbiótica é a densidade de infecção, já que a replicação do simbionte dentro do hospedeiro tem consequências diretas sobre, por exemplo, o nível de manipulação reprodutiva, o grau de virulência e as principais características da relação endossimbiótica. Dentre sua vasta gama de hospedeiros, Wolbachia desenvolve relações bastante interessantes com moscas do subgrupo willistoni de Drosophila. Foram registradas infecções em populações de D. willistoni com diferenças bem acentuadas no nível de infecção, com algumas linhagens apresentando titulação muito alta, enquanto outras possuem níveis apenas detectáveis por técnicas de hibridização. Tendo em vista a importância da densidade intracelular para o desfecho da relação com o hospedeiro, a manutenção de níveis tão desiguais de infecção em populações simpátricas se torna um problema biológico bastante interessante para ser investigado. Desta forma, o objetivo desta Dissertação de Mestrado foi averiguar mais aprofundadamente algumas características deste sistema simbiótico, para tentar entender como ele está sendo mantido durante o tempo evolutivo. Os principais achados deste trabalho são que, primeiramente, as infecções em alta titulação por Wolbachia são todas causadas pela linhagem wWil, enquanto que as infecções em baixa titulação são mantidas também por esta linhagem em alguns casos, porém em sua maioria por uma outra linhagem próxima, wAu-like. Como baixas e altas infecções são mantidas segregando aproximadamente em uma proporção 1:1 em populações de moscas de D. willistoni desde a Amazônia até os Pampas, nós investigamos se existiria uma associação entre os padrões de densidade de infecção e haplótipos mitocondriais das moscas hospedeiras, o que poderia explicar o padrão observado pelo efeito de uma varredura seletiva conduzida por Wolbachia. Nossos dados contradisseram tal hipótese, porém demonstraram que o padrão de variação mitocondrial das isolinhagens avaliadas poderia ser explicada por uma expansão demográfica. Ainda, nós desenvolvemos uma série de ensaios de avaliação de caracteres adaptativos das moscas, objetivando verificar se algum dos padrões de infecção observados poderia causar algum aumento de valor adaptativo em seus hospedeiros, assim explicando sua manutenção na população. Nós verificamos que a baixa infecção pela linhagem wAu-like está associada a uma maior fecundidade das fêmeas hospedeiras, enquanto que moscas infectadas com altas e baixas infecções pela linhagem wWil mostraram uma fecundidade menor. Unindo este dado com uma série de quantificações deste endossimbionte realizadas em estágios ontogenéticos de isolinhagens infectadas com diferentes modelos de infecção, nós propusemos que os dois tipos principais de infecção (wWil em alta densidade e wAu-like em baixa densidade) estão sendo mantidos em populações através de um equilíbrio entre o a maior fecundidade das fêmeas infectadas por wAu-like a maior eficiência de transmissão materna da infecção por wWil. / A quite famous and successful endossimbiont, the bacterium Wolbachia pipientis lives inside the cells from its arthropod and nematode hosts, and it is known to cause reproductive manipulations upon them in order to increase its own frequency in host populations. However, even though it is classically known as a reproductive parasite, recent evidences have demonstrated that it may develop more friendly relationships with its hosts by genetic agreements established between them. One of the most important characteristics of any symbiotic relationship is infection density, since the within-host symbiont replication has direct consequences upon the level of reproductive manipulation, the virulence degree and the endosymbiotic relationship’s main characteristics. Among its wide range of hosts, Wolbachia establishes quite interesting relationships with flies from the willistoni subgroup of Drosophila. It was recorded outstanding differences concerning the infection density among D. willistoni populations, with some isofemale lines presenting a very high density, while others are infected with Wolbachia in such low densities that are only rescued by hybridization techniques. Considering the importance of intracelular density to the symbiosis outcome, the maintenance of such unequal levels of infection in sympatric populations establishes an interesting biological issue that should be investigated. Therefore, this Masters Thesis aimed to more deeply ascertain some characteristics of such symbiotic system, in order to understand how it has been maintained throughout the evolutionary time. The main findings from this work are, first, that high-titer infections are all held by the wWil strain, whereas low-titer infectins are, in a few cases, also maintained by this same strain, although the majority of them are maintained by a closely-related strain, wAu-like. Since low and high-titer infections are segregating in an approximately 1:1 ratio in D. willistoni populations from the Amazonian Rainforest until the Pampas, we investigated if there is an association between the infection densities and mitochondrial haplotypes from the host flies, which would explain the observed pattern by a Wolbachia-conducted selective sweep. Our data contradicted such hypothesis, although it demonstrated that the mitochondrial variation could be explained by a demographic expansion of the species. Furthermore, we developed a series of fitness experiments with the flies, aiming to verify if any of the Wolbachia infection patterns could be associated to an increased adaptative value from their hosts, which would in turn explain their maintenance in host populations. We verified that the wAu-like low-titer infection is associated with an increased fecundity in its female hosts, while flies infected with either low or high-titer wWil showed a lower fecundity. Gathering this data with a series of qPCR Wolbachia quantifications among ontogenetic estages from flies of all infection types, we proposed that the two main infection types (high-titer wWil and low-titer wAu-like) are being maintained in the host populations by an equilbrium between the higher fecundity by females infected with wAu-like and a higher efficiency of transmission by wWil-infected flies.

Os elementos de transposição (TEs) são elementos repetitivos ubíquos dos genomas. São capazes de transpor-se e multiplicar-se, podendo atingir um número de milhares de cópias. A quantidade de TEs nos genomas varia imensamente mas podem atingir até mais de 50% de todo o DNA das espécies. Os TEs comportam-se como parasitas genômicos e eventualmente são domesticados adquirindo alguma função no hospedeiro. Os TEs têm um ciclo de vida nos genomas que começa no momento de sua entrada (invasão), seguido pela amplificação e decaimento (degeneração). O único meio de sobrevivência dos TEs é uma “fuga” para outra espécie. Esse processo é denominado transferência horizontal (HTT, do inglês Horizontal Transposon Transfer). Inúmeros casos de HTT já foram descritos, inclusive entre espécies de níveis taxonômicos muito distantes como ordens, classes e até mesmo filos. Neste trabalho utilizamos diferentes abordagens na compreensão dos TEs e do processo da HTT. Na primeira parte parte desse trabalho tratamos acerca da história evolutiva de elementos P de Drosophila. O grupo foi reclassificado e inúmeros potenciais eventos de HTT foram detectados. Os resultados também confirmam a monofilia dos elementos P em Drosophila e mostram a existência de 11 subfamílias. Em seguida, testamos possíveis vetores para HTT entre Drosophila e vespas parasitóides. Não encontramos evidência de que estes parasitóides sejam vetores de HTT, mas foram detectados eventos de HTT entre diferentes espécies de Drosophila. E por fim, analisamos 82 genomas de mamíferos para caracterização do padrão de HTT recentes nestas espécies. Detectamos um grande viés na distribuição das HTT em mamíferos e grupos de morcegos apresentaram uma alta incidência de invasões de TEs nos últimos 50 milhões de anos. / The transposable elements (TEs) are repetitive elements ubiquitous of the genome. They are capable to transpose and multiply in the genomes and may reach a number thousands of copies. The amount of TEs in the genomes varies tremendously but can reach up to more than 50% of all DNA from species. The TEs behave as genomic parasites and eventually they are domesticated and acquired some function in the host. The TEs have a life cycle that begins in the genomes invasion, followed by amplification and decay (degeneration). The only way to the TEs survive is to escape to other species. This process is called horizontal transposon transfer (HTT). A lot of cases of HTT have been described, including among very distant species as from different orders, classes and even phyla. In this work we use different approaches in understanding the TEs and the process of HTT. Initially we work on evolutionary history of P elements in the Drosophila species. The group was reclassified and a lot of potential events HTT were detected. The results also confirm the monophyly of P elements in the Drosophila species and the existence of 11 subfamilies. Then we tested for potential vectors to HTT between Drosophila and parasitoid wasps. We not found evidence that these parasites are vectors of HTT but some HTT events between different Drosophila species were detected. Finally, we analyzed 82 mammalian genomes for characterization of the recent HTT pattern in this group. We detected a large bias in the distribution of HTT in mammals and some bats showed a high incidence of TE invasions in the last 50 million years.

Made available in DSpace on 2016-03-01T13:55:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 lilha_santos_ioc_mest_2015.pdf: 2513314 bytes, checksum: 68510ffea5f70a295d9cf3358fe43197 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O principal vetor do vírus da dengue no mundo e único comprovado nas Américas é o mosquito Aedes aegypti. Atualmente, este mosquito encontra-se distribuído por todos os Estados do Brasil e diversas populações naturais apresentam elevada competência vetorial aos vírus dengue. Anualmente, estima-se que ocorram 50-100 milhões de infecções pelo dengue, com cerca de 2,5 bilhões de pessoas vivendo em países endêmicos. Um dos mecanismos mais recentes, e promissores, para minimizar a transmissão de dengue reside na utilização da bactéria Wolbachia. Esta bactéria é um simbionte intracelular obrigatório transmitido verticalmente da fêmea adulta para a sua prole. Seu uso se baseia no fato de que mosquitos Ae. aegypti com essa bactéria são capazes de bloquear o vírus dengue em comparação com mosquitos livres de Wolbachia. Para se avançar até a liberação dos mosquitos com Wolbachia em campo, é recomendável que muitos passos anteriores sejam executados. Dentre eles, avaliar aspectos de populações naturais de Aedes aegypti, ou seja, sem a bactéria, são de elevada relevância para propor uma liberação racional de insetos com Wolbachia em campo. Assim, propusemos estimar a densidade populacional relativa de mosquitos, a duração do ciclo gonotrófico e a probabilidade de sobrevivência diária (PDS) nas áreas selecionadas pelo projeto que ainda não possuem estas informações conhecidas pelo nosso grupo Foi coletado um total de 180.728 mosquitos selvagens nas quatro áreas de estudo, sendo que 82.316 destes foram Ae. aegypti, 2.867 eram Ae. albopictus, e 96.754 foram Culex quinquefasciatus pela armadilha BGS-Trap. A média semanal de Ae. aegypti foi mais alta em Vila Valqueire (256 ± 74,3, média ± desvio-padrão), um valor próximo ao dobro do observado na Urca (144,1 ± 40,6, média ± desvio-padrão). Para a duração do ciclo gonotrofico e sobrevivência liberamos em Vila Valqueire 1730 fêmeas, sendo 530 delas alimentadas (coorte A) e 1200 nãoalimentadas (coorte B); em Jurujuba, por sua vez, foram liberadas 900 fêmeas (coorte A) e 2100 (coorte B). Em Vila Valqueire foram coletados 573 indivíduos, sendo 98 fêmeas marcadas correspondendo a uma taxa de recaptura de 5,66% A média da expectativa de vida nesta área variou de 2,8 a 3,9 dias para as duas coortes, 3,83 a 6,63 dias somente para a A e 2,69 a 4,46 dias para a B. A sobrevivência pelo modelo exponencial foi de 0,8 para A, 0,72 para B e 0,73 para A e B juntas. Em Jurujuba foram capturados 174 Ae. aegypti, sendo que 45,4% deles eram nativos. Com 95 mosquitos marcados, observamos uma taxa de recaptura de 3,17%. A média da expectativa de vida nesta área variou de 4,07 a 6,11 dias para as duas coortes, 2,59 a 4,95 somente para a A e 7,43 a 10,6 para a B. A sobrevivência pelo modelo exponencial foi de 0,73 para A, 0,84 para B e 0,81 para A e B juntas. Nossos dados mostram que há condição de invasão da Wolcachia em todas as localidades, mesmo naquela que precisaremos liberar maior quantidade de mosquitos com a bactéria para substituir a população local, neste caso o bairro de Vila Valqueire / he main dengue vector in the world and only proven in the Americas is the mosquito Aedes aegypti . Currently, this mosquito is found distributed in all states of Brazil and several natural populations have highly vector competent for dengue virus. Annuall y, it is estimated 50 to 100 million infections by dengue, with about 2.5 billion people living in endemic countries. One of the newest and promising mechanisms to minimize dengue transmission relies in the use of Wolbachia bacterium. This bacterium is an obligate intracellular symbiont transmitted vertically from adult female to its offspring. Its use is based on the fact that Ae. aegypti with these bacteria are capable to block the dengue virus in comparison with mosquitoes without Wolbachia . To advance t o the release of mosquitoes with Wolbachia in the field, many previous steps must be performed. Among them, evaluating aspects of natural populations of Aedes aegypti , ie without the bacteria are highly relevant to propose a rational release of insects wit h Wolbachia in field. Therefore, we propose to estimate the relative population density of mosquitoes, the duration of gonotrophic cycle and the probability of daily survival (PDS) in the areas selected for the project in which these information are not kn own by our group. A total of 180,728 wild mosquitoes w as collected with BGS - Trap in the four study areas, 82,316 of these were Ae. aegypti, 2,867 were Ae. albopictus and 96,754 Culex quinquefasciatus . The weekly average of Ae. aegypti was higher in Vila Va lqueire (256 ± 74.3, mean ± standard deviation), a value close to twice that observed in Urca (144.1 ± 40.6, mean ± standard deviation). For the duration of the gonotrophic cycle and PDS we released in Valqueire Vila 1730 females, 530 of them being fed (co hort A) and 1200 non - fed (cohort B); Jurujuba in turn, we released 900 (Cohort A) and 2100 (Cohort B) females. In Vila Valqueire were collected 573 individuals, 98 females marked corresponding to a recapture rate of 5.66%. The average life expectancy in t he area ranging from 2.8 to 3.9 days for the two cohorts, 3.83 to 6.63 days only for Cohort A and from 2.69 to 4.46 days for Cohort B. The survival by the exponential model was 0.8 to Cohort A, 0.72 to B and 0.73 summing data from both cohorts. In Jurujub a were captured 174 Ae. aegypti , wherein 45.4% were native. With 95 marked mosquitoes, we observed a recapture rate of 3.17%. The average life expectancy in this area ranging from 4.07 to 6,11 dias for the two cohorts: cohort A varied from 2.59 to 4.95 an d B from 7.43 to 10.6. Survival by the exponential model was 0,73 for A, 0.84 for B and 0.81 to the summing data from both cohorts. Our data show that Wolcachia invasion is expected in all locations, even in those we need to release greater of mosquitoes w ith bacteria to replace the local population, in this case the district of Vila Valqueire

Endossimbionte muito famosa e bem sucedida, a bactéria Wolbachia pipentis vive dentro de células de artrópodes e nematoides, e é conhecida por causar manipulações reprodutivas sobre seus hospedeiros, com o objetivo de aumentar sua própria frequência nas populações. Entretanto, apesar de ser conhecida classicamente como uma parasita reprodutiva, muitas evidências recentes demonstram que ela pode desenvolver relacionamentos mais amigáveis e estáveis com seus hospedeiros, mediante alguns acordos genéticos realizados com eles. Uma das características mais importantes de qualquer relação simbiótica é a densidade de infecção, já que a replicação do simbionte dentro do hospedeiro tem consequências diretas sobre, por exemplo, o nível de manipulação reprodutiva, o grau de virulência e as principais características da relação endossimbiótica. Dentre sua vasta gama de hospedeiros, Wolbachia desenvolve relações bastante interessantes com moscas do subgrupo willistoni de Drosophila. Foram registradas infecções em populações de D. willistoni com diferenças bem acentuadas no nível de infecção, com algumas linhagens apresentando titulação muito alta, enquanto outras possuem níveis apenas detectáveis por técnicas de hibridização. Tendo em vista a importância da densidade intracelular para o desfecho da relação com o hospedeiro, a manutenção de níveis tão desiguais de infecção em populações simpátricas se torna um problema biológico bastante interessante para ser investigado. Desta forma, o objetivo desta Dissertação de Mestrado foi averiguar mais aprofundadamente algumas características deste sistema simbiótico, para tentar entender como ele está sendo mantido durante o tempo evolutivo. Os principais achados deste trabalho são que, primeiramente, as infecções em alta titulação por Wolbachia são todas causadas pela linhagem wWil, enquanto que as infecções em baixa titulação são mantidas também por esta linhagem em alguns casos, porém em sua maioria por uma outra linhagem próxima, wAu-like. Como baixas e altas infecções são mantidas segregando aproximadamente em uma proporção 1:1 em populações de moscas de D. willistoni desde a Amazônia até os Pampas, nós investigamos se existiria uma associação entre os padrões de densidade de infecção e haplótipos mitocondriais das moscas hospedeiras, o que poderia explicar o padrão observado pelo efeito de uma varredura seletiva conduzida por Wolbachia. Nossos dados contradisseram tal hipótese, porém demonstraram que o padrão de variação mitocondrial das isolinhagens avaliadas poderia ser explicada por uma expansão demográfica. Ainda, nós desenvolvemos uma série de ensaios de avaliação de caracteres adaptativos das moscas, objetivando verificar se algum dos padrões de infecção observados poderia causar algum aumento de valor adaptativo em seus hospedeiros, assim explicando sua manutenção na população. Nós verificamos que a baixa infecção pela linhagem wAu-like está associada a uma maior fecundidade das fêmeas hospedeiras, enquanto que moscas infectadas com altas e baixas infecções pela linhagem wWil mostraram uma fecundidade menor. Unindo este dado com uma série de quantificações deste endossimbionte realizadas em estágios ontogenéticos de isolinhagens infectadas com diferentes modelos de infecção, nós propusemos que os dois tipos principais de infecção (wWil em alta densidade e wAu-like em baixa densidade) estão sendo mantidos em populações através de um equilíbrio entre o a maior fecundidade das fêmeas infectadas por wAu-like a maior eficiência de transmissão materna da infecção por wWil. / A quite famous and successful endossimbiont, the bacterium Wolbachia pipientis lives inside the cells from its arthropod and nematode hosts, and it is known to cause reproductive manipulations upon them in order to increase its own frequency in host populations. However, even though it is classically known as a reproductive parasite, recent evidences have demonstrated that it may develop more friendly relationships with its hosts by genetic agreements established between them. One of the most important characteristics of any symbiotic relationship is infection density, since the within-host symbiont replication has direct consequences upon the level of reproductive manipulation, the virulence degree and the endosymbiotic relationship’s main characteristics. Among its wide range of hosts, Wolbachia establishes quite interesting relationships with flies from the willistoni subgroup of Drosophila. It was recorded outstanding differences concerning the infection density among D. willistoni populations, with some isofemale lines presenting a very high density, while others are infected with Wolbachia in such low densities that are only rescued by hybridization techniques. Considering the importance of intracelular density to the symbiosis outcome, the maintenance of such unequal levels of infection in sympatric populations establishes an interesting biological issue that should be investigated. Therefore, this Masters Thesis aimed to more deeply ascertain some characteristics of such symbiotic system, in order to understand how it has been maintained throughout the evolutionary time. The main findings from this work are, first, that high-titer infections are all held by the wWil strain, whereas low-titer infectins are, in a few cases, also maintained by this same strain, although the majority of them are maintained by a closely-related strain, wAu-like. Since low and high-titer infections are segregating in an approximately 1:1 ratio in D. willistoni populations from the Amazonian Rainforest until the Pampas, we investigated if there is an association between the infection densities and mitochondrial haplotypes from the host flies, which would explain the observed pattern by a Wolbachia-conducted selective sweep. Our data contradicted such hypothesis, although it demonstrated that the mitochondrial variation could be explained by a demographic expansion of the species. Furthermore, we developed a series of fitness experiments with the flies, aiming to verify if any of the Wolbachia infection patterns could be associated to an increased adaptative value from their hosts, which would in turn explain their maintenance in host populations. We verified that the wAu-like low-titer infection is associated with an increased fecundity in its female hosts, while flies infected with either low or high-titer wWil showed a lower fecundity. Gathering this data with a series of qPCR Wolbachia quantifications among ontogenetic estages from flies of all infection types, we proposed that the two main infection types (high-titer wWil and low-titer wAu-like) are being maintained in the host populations by an equilbrium between the higher fecundity by females infected with wAu-like and a higher efficiency of transmission by wWil-infected flies.

Os elementos de transposição (TEs) são elementos repetitivos ubíquos dos genomas. São capazes de transpor-se e multiplicar-se, podendo atingir um número de milhares de cópias. A quantidade de TEs nos genomas varia imensamente mas podem atingir até mais de 50% de todo o DNA das espécies. Os TEs comportam-se como parasitas genômicos e eventualmente são domesticados adquirindo alguma função no hospedeiro. Os TEs têm um ciclo de vida nos genomas que começa no momento de sua entrada (invasão), seguido pela amplificação e decaimento (degeneração). O único meio de sobrevivência dos TEs é uma “fuga” para outra espécie. Esse processo é denominado transferência horizontal (HTT, do inglês Horizontal Transposon Transfer). Inúmeros casos de HTT já foram descritos, inclusive entre espécies de níveis taxonômicos muito distantes como ordens, classes e até mesmo filos. Neste trabalho utilizamos diferentes abordagens na compreensão dos TEs e do processo da HTT. Na primeira parte parte desse trabalho tratamos acerca da história evolutiva de elementos P de Drosophila. O grupo foi reclassificado e inúmeros potenciais eventos de HTT foram detectados. Os resultados também confirmam a monofilia dos elementos P em Drosophila e mostram a existência de 11 subfamílias. Em seguida, testamos possíveis vetores para HTT entre Drosophila e vespas parasitóides. Não encontramos evidência de que estes parasitóides sejam vetores de HTT, mas foram detectados eventos de HTT entre diferentes espécies de Drosophila. E por fim, analisamos 82 genomas de mamíferos para caracterização do padrão de HTT recentes nestas espécies. Detectamos um grande viés na distribuição das HTT em mamíferos e grupos de morcegos apresentaram uma alta incidência de invasões de TEs nos últimos 50 milhões de anos. / The transposable elements (TEs) are repetitive elements ubiquitous of the genome. They are capable to transpose and multiply in the genomes and may reach a number thousands of copies. The amount of TEs in the genomes varies tremendously but can reach up to more than 50% of all DNA from species. The TEs behave as genomic parasites and eventually they are domesticated and acquired some function in the host. The TEs have a life cycle that begins in the genomes invasion, followed by amplification and decay (degeneration). The only way to the TEs survive is to escape to other species. This process is called horizontal transposon transfer (HTT). A lot of cases of HTT have been described, including among very distant species as from different orders, classes and even phyla. In this work we use different approaches in understanding the TEs and the process of HTT. Initially we work on evolutionary history of P elements in the Drosophila species. The group was reclassified and a lot of potential events HTT were detected. The results also confirm the monophyly of P elements in the Drosophila species and the existence of 11 subfamilies. Then we tested for potential vectors to HTT between Drosophila and parasitoid wasps. We not found evidence that these parasites are vectors of HTT but some HTT events between different Drosophila species were detected. Finally, we analyzed 82 mammalian genomes for characterization of the recent HTT pattern in this group. We detected a large bias in the distribution of HTT in mammals and some bats showed a high incidence of TE invasions in the last 50 million years.

Endossimbionte muito famosa e bem sucedida, a bactéria Wolbachia pipentis vive dentro de células de artrópodes e nematoides, e é conhecida por causar manipulações reprodutivas sobre seus hospedeiros, com o objetivo de aumentar sua própria frequência nas populações. Entretanto, apesar de ser conhecida classicamente como uma parasita reprodutiva, muitas evidências recentes demonstram que ela pode desenvolver relacionamentos mais amigáveis e estáveis com seus hospedeiros, mediante alguns acordos genéticos realizados com eles. Uma das características mais importantes de qualquer relação simbiótica é a densidade de infecção, já que a replicação do simbionte dentro do hospedeiro tem consequências diretas sobre, por exemplo, o nível de manipulação reprodutiva, o grau de virulência e as principais características da relação endossimbiótica. Dentre sua vasta gama de hospedeiros, Wolbachia desenvolve relações bastante interessantes com moscas do subgrupo willistoni de Drosophila. Foram registradas infecções em populações de D. willistoni com diferenças bem acentuadas no nível de infecção, com algumas linhagens apresentando titulação muito alta, enquanto outras possuem níveis apenas detectáveis por técnicas de hibridização. Tendo em vista a importância da densidade intracelular para o desfecho da relação com o hospedeiro, a manutenção de níveis tão desiguais de infecção em populações simpátricas se torna um problema biológico bastante interessante para ser investigado. Desta forma, o objetivo desta Dissertação de Mestrado foi averiguar mais aprofundadamente algumas características deste sistema simbiótico, para tentar entender como ele está sendo mantido durante o tempo evolutivo. Os principais achados deste trabalho são que, primeiramente, as infecções em alta titulação por Wolbachia são todas causadas pela linhagem wWil, enquanto que as infecções em baixa titulação são mantidas também por esta linhagem em alguns casos, porém em sua maioria por uma outra linhagem próxima, wAu-like. Como baixas e altas infecções são mantidas segregando aproximadamente em uma proporção 1:1 em populações de moscas de D. willistoni desde a Amazônia até os Pampas, nós investigamos se existiria uma associação entre os padrões de densidade de infecção e haplótipos mitocondriais das moscas hospedeiras, o que poderia explicar o padrão observado pelo efeito de uma varredura seletiva conduzida por Wolbachia. Nossos dados contradisseram tal hipótese, porém demonstraram que o padrão de variação mitocondrial das isolinhagens avaliadas poderia ser explicada por uma expansão demográfica. Ainda, nós desenvolvemos uma série de ensaios de avaliação de caracteres adaptativos das moscas, objetivando verificar se algum dos padrões de infecção observados poderia causar algum aumento de valor adaptativo em seus hospedeiros, assim explicando sua manutenção na população. Nós verificamos que a baixa infecção pela linhagem wAu-like está associada a uma maior fecundidade das fêmeas hospedeiras, enquanto que moscas infectadas com altas e baixas infecções pela linhagem wWil mostraram uma fecundidade menor. Unindo este dado com uma série de quantificações deste endossimbionte realizadas em estágios ontogenéticos de isolinhagens infectadas com diferentes modelos de infecção, nós propusemos que os dois tipos principais de infecção (wWil em alta densidade e wAu-like em baixa densidade) estão sendo mantidos em populações através de um equilíbrio entre o a maior fecundidade das fêmeas infectadas por wAu-like a maior eficiência de transmissão materna da infecção por wWil. / A quite famous and successful endossimbiont, the bacterium Wolbachia pipientis lives inside the cells from its arthropod and nematode hosts, and it is known to cause reproductive manipulations upon them in order to increase its own frequency in host populations. However, even though it is classically known as a reproductive parasite, recent evidences have demonstrated that it may develop more friendly relationships with its hosts by genetic agreements established between them. One of the most important characteristics of any symbiotic relationship is infection density, since the within-host symbiont replication has direct consequences upon the level of reproductive manipulation, the virulence degree and the endosymbiotic relationship’s main characteristics. Among its wide range of hosts, Wolbachia establishes quite interesting relationships with flies from the willistoni subgroup of Drosophila. It was recorded outstanding differences concerning the infection density among D. willistoni populations, with some isofemale lines presenting a very high density, while others are infected with Wolbachia in such low densities that are only rescued by hybridization techniques. Considering the importance of intracelular density to the symbiosis outcome, the maintenance of such unequal levels of infection in sympatric populations establishes an interesting biological issue that should be investigated. Therefore, this Masters Thesis aimed to more deeply ascertain some characteristics of such symbiotic system, in order to understand how it has been maintained throughout the evolutionary time. The main findings from this work are, first, that high-titer infections are all held by the wWil strain, whereas low-titer infectins are, in a few cases, also maintained by this same strain, although the majority of them are maintained by a closely-related strain, wAu-like. Since low and high-titer infections are segregating in an approximately 1:1 ratio in D. willistoni populations from the Amazonian Rainforest until the Pampas, we investigated if there is an association between the infection densities and mitochondrial haplotypes from the host flies, which would explain the observed pattern by a Wolbachia-conducted selective sweep. Our data contradicted such hypothesis, although it demonstrated that the mitochondrial variation could be explained by a demographic expansion of the species. Furthermore, we developed a series of fitness experiments with the flies, aiming to verify if any of the Wolbachia infection patterns could be associated to an increased adaptative value from their hosts, which would in turn explain their maintenance in host populations. We verified that the wAu-like low-titer infection is associated with an increased fecundity in its female hosts, while flies infected with either low or high-titer wWil showed a lower fecundity. Gathering this data with a series of qPCR Wolbachia quantifications among ontogenetic estages from flies of all infection types, we proposed that the two main infection types (high-titer wWil and low-titer wAu-like) are being maintained in the host populations by an equilbrium between the higher fecundity by females infected with wAu-like and a higher efficiency of transmission by wWil-infected flies.

Os elementos de transposição (TEs) são elementos repetitivos ubíquos dos genomas. São capazes de transpor-se e multiplicar-se, podendo atingir um número de milhares de cópias. A quantidade de TEs nos genomas varia imensamente mas podem atingir até mais de 50% de todo o DNA das espécies. Os TEs comportam-se como parasitas genômicos e eventualmente são domesticados adquirindo alguma função no hospedeiro. Os TEs têm um ciclo de vida nos genomas que começa no momento de sua entrada (invasão), seguido pela amplificação e decaimento (degeneração). O único meio de sobrevivência dos TEs é uma “fuga” para outra espécie. Esse processo é denominado transferência horizontal (HTT, do inglês Horizontal Transposon Transfer). Inúmeros casos de HTT já foram descritos, inclusive entre espécies de níveis taxonômicos muito distantes como ordens, classes e até mesmo filos. Neste trabalho utilizamos diferentes abordagens na compreensão dos TEs e do processo da HTT. Na primeira parte parte desse trabalho tratamos acerca da história evolutiva de elementos P de Drosophila. O grupo foi reclassificado e inúmeros potenciais eventos de HTT foram detectados. Os resultados também confirmam a monofilia dos elementos P em Drosophila e mostram a existência de 11 subfamílias. Em seguida, testamos possíveis vetores para HTT entre Drosophila e vespas parasitóides. Não encontramos evidência de que estes parasitóides sejam vetores de HTT, mas foram detectados eventos de HTT entre diferentes espécies de Drosophila. E por fim, analisamos 82 genomas de mamíferos para caracterização do padrão de HTT recentes nestas espécies. Detectamos um grande viés na distribuição das HTT em mamíferos e grupos de morcegos apresentaram uma alta incidência de invasões de TEs nos últimos 50 milhões de anos. / The transposable elements (TEs) are repetitive elements ubiquitous of the genome. They are capable to transpose and multiply in the genomes and may reach a number thousands of copies. The amount of TEs in the genomes varies tremendously but can reach up to more than 50% of all DNA from species. The TEs behave as genomic parasites and eventually they are domesticated and acquired some function in the host. The TEs have a life cycle that begins in the genomes invasion, followed by amplification and decay (degeneration). The only way to the TEs survive is to escape to other species. This process is called horizontal transposon transfer (HTT). A lot of cases of HTT have been described, including among very distant species as from different orders, classes and even phyla. In this work we use different approaches in understanding the TEs and the process of HTT. Initially we work on evolutionary history of P elements in the Drosophila species. The group was reclassified and a lot of potential events HTT were detected. The results also confirm the monophyly of P elements in the Drosophila species and the existence of 11 subfamilies. Then we tested for potential vectors to HTT between Drosophila and parasitoid wasps. We not found evidence that these parasites are vectors of HTT but some HTT events between different Drosophila species were detected. Finally, we analyzed 82 mammalian genomes for characterization of the recent HTT pattern in this group. We detected a large bias in the distribution of HTT in mammals and some bats showed a high incidence of TE invasions in the last 50 million years.

Wolbachia é uma bactéria intracelular obrigatória, de transmissão vertical, encontrada em tecidos reprodutivos de muitos artrópodes e nematóides. Ela manipula o ciclo reprodutivo de seus hospedeiros, induzindo partenogênese, feminização, morte de machos e incompatibilidade citoplasmática. No intuito de verificar a existência de alterações reprodutivas em mosquitos Culex quinquefasciatus infectados por Wolbachia (cepa B), tratamos com antibiótico uma colônia infectada e obtivemos uma colônia livre da infecção. Os mosquitos de nossas colônias apresentam o fenômeno de incompatibilidade citoplasmática. Paralelamente, a infecção causa redução do número de ovos e diminui a mortalidade de larvas e pupas, fazendo com que o número de adultos emergidos seja estatisticamente igual entre os animais infectados e não infectados. Além disso, observamos que mosquitos coletados na natureza, na cidade de São Paulo, Brasil, estão infectados pela mesma cepa da bactéria. / Wolbachia is an obligatory intracellular bacterium, maternally inherited, found in reproductive tissues of many arthropods and nematodes. It manipulates the reproductive behavior of their hosts, inducing parthenogenesis, feminization, male-killing and cytoplasmic incompatibility. In order to verify the existence of reproductive manipulation in Culex quinquefasciatus mosquitoes infected with Wolbachia (B strain), an infected population was treated with antibiotic to obtain a Wolbachia free colony. The mosquitoes of our colonies present the cytoplasmic incompatibility phenomenon. In parallel, infection causes reduction in the number of eggs and decreases the mortality of larvae and pupae, making the number of emerged adults statistically equal between the infected and uninfected animals. Furthermore, we observed that wild mosquitoes collected in Sao Paulo city, Brazil, are infected by the same strain of bacteria.

Les bactéries intracellulaires Wolbachia ont développé une vaste gamme d’interactions symbiotiques, du parasitisme reproductif au mutualisme chez les arthropodes terrestres et les nématodes filaires, devenant ainsi les endosymbiotes les plus répandus sur terre. Bien qu’elles se développent lentement dans les cultures cellulaires d’insectes pour lesquelles les marqueurs sont limités et qu’elles ne sont génétiquement pas manipulables, il existe un intéret croissant de déchiffrer leur mode de vie intracellulaire pour 2 raisons. Premièrement, Wolbachia intervient dans le développement et la transmission des arbovirus et deuxièmement, les filarioses lymphatiques sont traitables grâce à la susceptibilité des Wolbachia qui infectent les nématodes filaires aux antibiotiques. Au début de ce projet, j’ai infecté 2 lignées cellulaires de Drosophila melanogaster qui sont transcriptomiquement divergentes par une même souche de Wolbachia pouvant naturellement infecter Drosophila melanogaster. J’ai utilisé ces 2 lignées cellulaires qui sont différentiellement permissive à l’infection pour explorer l’interaction de Wolbachia avec le réticulum endoplasmique. Les observations par microscopie à fluorescence en temps réel et par microscopie électronique prouvent que cet organite est une source de membranes pour Wolbachia et possiblement, une source de nutriments. Pourtant, les analyses d’expression génique et les approches d’immunofluorescence démontrent que Wolbachia n’induit ni un stress au niveau du réticulum endoplasmique ni une protéolyse via la voie de signalisation ERAD suggérant dès lors, que Wolbachia subvertissent d’autres mécanismes pour assurer leur besoin en acides aminés. Au cours de ce projet, j’ai commencé à mettre en place une technique pour transformer Wolbachia par biolistique. La validation de cette technique de transformation a ouvert la voie vers l’optimisation de la procédure de sélection des transformants pour enfin pouvoir génétiquement manipuler Wolbachia. / The intracellular bacteria Wolbachia have developed a wide range of symbiotic interactions, from being opportunistic reproductive parasites to mutualists with terrestrial arthropods and filarial nematode species, making them the most common endosymbionts on earth. The discovery that they interfere with arboviruses development and transmission by mosquito vectors and that filarial diseases can be cured by targeting Wolbachia, have created a strong interest in deciphering the mechanisms underlying their intracellular lifestyle. However, being obligate intracellular endosymbionts, Wolbachia remain genetically intractable. They grow slowly in insect cell cultures, for which markers are limited. Despite these obstacles, and to limit cell line-specific phenotypes, I chose to infect 2 Drosophila melanogaster cell lines presenting different sets of expressed genes, with a unique Wolbachia strain, naturally hosted by Drosophila melanogaster. Using these 2 cell lines that are differently permissive to the infection, I explored the interaction of Wolbachia with the endoplasmic reticulum (ER). Through fluorescence time-lapse confocal and electron microscopy observations, I provide strong evidence that this organelle is the source of membrane for Wolbachia, and possibly a source of nutrients. However, gene expression analyses and immunofluorescence approaches demonstrate that Wolbachia do not induce ER stress nor an increased ERAD- induced proteolysis, suggesting; unlike previously reported, that Wolbachia salvage amino acids by other subversion mechanisms. Additionally, I pioneered biolistic bombardement of Wolbachia-infected cells and the validation of this transformation technique has paved the way towards optimization of transformant selection steps and ultimately to the genetic engineering of Wolbachia.

Wolbachia é uma bactéria intracelular obrigatória, de transmissão vertical, encontrada em tecidos reprodutivos de muitos artrópodes e nematóides. Ela manipula o ciclo reprodutivo de seus hospedeiros, induzindo partenogênese, feminização, morte de machos e incompatibilidade citoplasmática. No intuito de verificar a existência de alterações reprodutivas em mosquitos Culex quinquefasciatus infectados por Wolbachia (cepa B), tratamos com antibiótico uma colônia infectada e obtivemos uma colônia livre da infecção. Os mosquitos de nossas colônias apresentam o fenômeno de incompatibilidade citoplasmática. Paralelamente, a infecção causa redução do número de ovos e diminui a mortalidade de larvas e pupas, fazendo com que o número de adultos emergidos seja estatisticamente igual entre os animais infectados e não infectados. Além disso, observamos que mosquitos coletados na natureza, na cidade de São Paulo, Brasil, estão infectados pela mesma cepa da bactéria. / Wolbachia is an obligatory intracellular bacterium, maternally inherited, found in reproductive tissues of many arthropods and nematodes. It manipulates the reproductive behavior of their hosts, inducing parthenogenesis, feminization, male-killing and cytoplasmic incompatibility. In order to verify the existence of reproductive manipulation in Culex quinquefasciatus mosquitoes infected with Wolbachia (B strain), an infected population was treated with antibiotic to obtain a Wolbachia free colony. The mosquitoes of our colonies present the cytoplasmic incompatibility phenomenon. In parallel, infection causes reduction in the number of eggs and decreases the mortality of larvae and pupae, making the number of emerged adults statistically equal between the infected and uninfected animals. Furthermore, we observed that wild mosquitoes collected in Sao Paulo city, Brazil, are infected by the same strain of bacteria.