L'immuno-marquage multiple des lymphocytes T par cytométrie en flux permet d'observer plus de phénotypes que les deux isotypes conventionnels T CD4+ et T CD8+. Ces observations sont basées sur la combinaison de marqueurs habituellement utilisés mais rarement tous associés ainsi que sur le niveau d'expression membranaire. Ces données ne peuvent être reproductibles qu'au prix d'une standardisation rigoureuse de la préparation et des réglages du cytomètre et l'élimination de possibles artefacts. Nous décrivons les lymphocytes T CD4+CD8dim, T CD4dimCD8+, T CD3fort (Tgamma/alpha), T CD8alpha/alpha, T CD8dim et T CD8+CD56+. Les trois derniers sont encore peu détaillés. Seules quelques observations ont déjà été rapportées dans la littérature. Certaines combinaisons (doubles positifs CD4+/CD8+) sont observées sur le thymocyte immature mais, classiquement, pas dans le sang périphérique. Il était donc nécessaire de distinguer les isotypes doubles positifs dans le sang périphérique de formes immatures qui auraient pu s'échapper du thymus. L'expression réduite d'un marqueur (" dim ") peut être induite par l'activation du lymphocyte. Il était donc nécessaire d'éliminer une activation récente. Bien que le travail en l'état se limite à des descriptions phénotypiques, nous avons cherché à connaître la pertinence physiologique possible de ces expressions aberrantes en faisant une courte revue de la littérature sur les étapes de la lymphopoïèse, les mécanismes d'orientation vers une lignée particulière et les processus d'activation lymphocytaire spécifique. L'expression d'un marqueur membranaire étant dépendant de son utilité, nous émettons l'hypothèse que ces isotypes non conventionnels ont une activité immunitaire particulière, soit habituellement minoritaire ou restreinte à certains sites soit induite. Des études fonctionnelles devraient éclaircir ce point. Nos résultats ne permettent pas de préciser si leur émergence est un processus actif (éventuellement chronique) ou est séquellaire d'une sollicitation passée. Certaines populations ont une diversité très restreinte. Nous les avons qualifiées d'oligoclonales à défaut de pouvoir confirmer leur monoclonalité. Compte tenu de la grande diversité du système immunitaire T, il est peu probable que cette restriction soit fortuite. Elle peut être réactionnelle mais doit être distinguée des authentiques syndromes lymphoprolifératifs aux phénotypes parfois proches. Nous situant alors dans la situation frontière entre physiologie et pathologie, nous avons proposé de qualifier ces populations de " dysclonotypie oligoclonale de signification indéterminée " par analogie avec le concept de " dysglobulinémie monoclonale de signification indéterminée ". Des études complémentaires devraient permettre de clarifier cette hypothèse et éventuellement de définir des critères pronostiques.

Dès l'ouverture du laboratoire et la création de cette activité sur le CHU en 1995, notre travail a été centré autour de l'analyse cellulaire. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux populations lymphocytaires T et aux adénocarcinomes avec deux aspects particuliers : diversité et dynamique de populations hétérogènes, détection et caractérisation d'éléments minoritaires (évènements rares) au sein de cette population. Notre activité hospitalière a été effectuée dans au laboratoire d'Immunologie qui fait partie du Pôle de Biologie-Pathologie du CHU de Saint-Etienne. La partie plus expérimentale ou biotechnologique de nos recherches a été conduite dans le cadre du Groupe d'études sur l'Immunité des Muqueuses et les Agents Pathogènes (GIMAP, EA 3064) et, depuis 2004, dans celui du Centre d'Ingénierie et Santé de l'Ecole Nationale Supérieure des Mines de Saint Etienne (où nous sommes détaché pour 20% de notre temps hospitalier).

Les microARN constituent une classe de petits ARN non codants d'une vingtaine de nucléotides, issus de transcrits cellulaires, qui inhibent l'expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel. Chez les mammifères, bien qu'ils puissent agir sur une cible parfaitement complémentaire (mode parfait), les microARN ont presqu'exclusivement des cibles partiellement complémentaires (mode imparfait). Puisqu'en mode imparfait une coupure endonucléolytique de la cible est impossible, il est généralement proposé que le mode imparfait soit moins efficace que le mode parfait : conduisant à un silencing moins efficace, nécessitant plus de complexes effecteurs (miRISC) et facilement saturable par une augmentation du nombre de cible. Dans ce travail j'ai développé une approche expérimentale reposant sur l'expression de protéines fluorescentes pour mesurer précisément le silencing au niveau de chaque cellule. J'ai fait trois observations inattendues sur l'efficacité de la régulation par les microARN : i) le silencing en mode parfait et imparfait nécessite des quantités similaires de petit ARN, ii) une augmentation, même très importante, de l'expression du gène cible ne lui permet pas d'échapper à la régulation, iii) le silencing n'est pas intrinsèquement plus faible en mode imparfait (qu'en mode parfait) mais n'est pas actif dans toutes les cellules. Si les deux premiers points sont facilement explicables dans le cadre de l'induction de la dégradation de l'ARNm cible sur un mode catalytique via la déadénylation de l'ARNm, le troisième indique l'existence d'une régulation forte du silencing qui est spécifique du mode imparfait. De plus, comme dans les deux modes le silencing dépend principalement du même partenaire, Ago2, cette régulation intervient après l'assemblage du complexe minimal (Ago2/petit ARN). Ainsi, les différences entre les modes parfait et imparfait ne se situent pas au niveau proposé puisque lorsque la cellule est compétente, leurs efficacités sont comparables. Par contre, mes travaux mettent en évidence l'existence d'un contrôle de la régulation en mode imparfait dont la nature reste à préciser.

Les canaux Ca2+ activés par le voltage (CaV) sont des protéines membranaires qui génèrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite à une dépolarisation membranaire. Ces complexes oligomériques sont classifiés selon les propriétés structurelles de la sous-unité principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unité CaVα1. La sous-unité auxiliaire CaVβ module l’expression membranaire et la dépendance au voltage du « gating » de la sous-unité CaVα1 des canaux HVA (« high-voltage-activated ») CaV1 et CaV2. La sous-unité CaVβ est formée par un domaine SH3 (« Src homology-3 ») connecté à un domaine GK (« guanylate kinase-like ») par le biais d’un domaine variable HOOK. Dans le but d’identifier les résidus dans la CaVβ3 qui sont responsables de la densité membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unité auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la délétion complète du domaine SH3 ainsi que la délétion du domaine HOOK n’ont pas modifié la densité membranaire de CaV2.3 ni ses propriétés d’activation. Cependant, la délétion de cinq résidus dans le domaine GK interrompt l’expression membranaire et l’expression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de résidus identifiés précédemment comme soutenant une affinité de liaison de l’ordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaVβ n’a pas modifié de manière significative l’adressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre résidus leucine dans les régions α3, α6, β10 et α9 du domaine GK ont grandement réduit l’adressage membranaire du canal CaV2.3. Nos résultats confirment que le domaine GK contient les déterminants moléculaires responsables de la fonction chaperone de CaVβ. Cela dit, l’adressage membranaire induit par CaVβ semble être déterminé par des éléments structuraux qui ne sont pas strictement dépendants d’une liaison à haute affinité de CaVβ sur CaVα1. / Voltage-activated Ca2+ channels (CaV) are membrane proteins that play a key role in promoting Ca2+ influx in response to membrane depolarization in excitable cells. They form oligomeric complexes that are classified according to the structural properties of the pore-forming CaVα1 subunit. Auxiliary CaVβ subunits modulate cell-surface expression and voltage-dependent gating of high-voltage-activated (HVA) CaV1 and CaV2 α1 subunits. CaVβ subunits are formed by a Src homology-3 (SH3) domain and a guanylate kinase-like (GK) domain connected through a variable HOOK-domain. In order to identify the residues responsible for the CaVβ3-induced membrane density of CaV2.3, we produced mutants along CaVβ3’s fonctionnal domains. Complete deletion of the SH3 domain as well as deletion of the HOOK domain did not alter plasma membrane targeting of CaV2.3 nor its typical activation gating. In contrast, 5-residue deletions in the GK domain disrupted cell surface trafficking and functional expression of CaV2.3. Mutations of residues known to carry nanomolar affinity binding in the GK domain of CaVβ did not significantly alter cell surface density. Mutations of a quartet of leucine residues in the α3, α6, β10, and α9 regions of the GK domain, each expected to curtail protein-protein interaction, were found to significantly impair cell surface targeting of CaV2.3 channels. Altogether, our results confirm that the GK domain includes the molecular determinants carrying the chaperone function of CaVβ. However, CaVβ-induced cell surface targeting appears to be determined by structural elements that are not strictly dominated by high-affinity binding of CaVβ onto CaVα1.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins. / Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.

Les cellules souches neurales quiescentes (CSN) sont le réservoir de la neurogenèse adulte, permettant de produire des nouveaux neurones tout au long de la vie. Cependant, la neurogenèse décroit au cours du vieillissement, provoquant des déclins cognitifs incurables. Afin de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent la prolifération des CSN, nous avons mis en place une méthode de tri par cytométrie en flux qui permet pour la première fois d'isoler les CSN quiescentes et leurs cellules filles dans la ZSV adulte murine. Cette technique nous a permis de prouver que le blocage de la voie GABAAR in vivo provoque l'entrée en cycle des CSN quiescentes. Ainsi, les signaux GABA produits par les neuroblastes dans la ZSV permettent de maintenir les CSN dans leur état de quiescence. Au cours du vieillissement, nous montrons que la production progressive de TGFβ1 par les cellules endothéliales de la niche allonge la phase G1 des CSN activées, diminuant sensiblement la production de nouveaux neurones, sans toutefois diminuer le stock de CSN. Nous mettons ainsi en évidence deux voies majeures contrôlant la prolifération des CSN in vivo, la voie du GABAAR et la voie TGF-β/Smad-3. En vue d'une application thérapeutique, nous prouvons que leur blocage pharmacologique permet de stimuler efficacement la neurogenèse in vivo.

Notre génome, véritable mode d'emploi de chaque cellule et organisme, est constamment menacé par de multiples agents endogènes ou exogènes qui endommagent la biomolécule d'ADN. Ces lésions résultantes, de nature diverse, sont notamment impliquées dans les processus de vieillissement cellulaire, de cancérogénèse et de mort cellulaire. Afin de contrer ces effets néfastes, les organismes ont développé différents systèmes de réparation de l'ADN capables de prendre en charge spécifiquement chaque type de dommages. Parmi ces voies métaboliques, la réparation par excision de base (BER) répare chaque jour des dizaines de milliers de dommages, incluant les bases alkylées, oxydées ou désaminées, les sites abasiques ou encore certaines cassures de brin. Dans le présent travail, nous exposons la mise au point d'un nouveau biocapteur pour la détection des activités enzymatiques du BER. L'outil se caractérise par un set de sondes nucléiques autocomplémentaires, fluorescentes ou pro-fluorescentes, immobilisées sur microbilles paramagnétiques. Chaque sonde est modifiée par l'introduction sélective d'une lésion, substrat d'une activité enzymatique ciblée (ADN N-glycosylase, AP-endonucléase). L'activité d'excision/incision de la lésion, conduit à la coupure de la sonde et à la déshybridation de la structure. L'analyse et la quantification du clivage spécifique est réalisée en fluorescence, soit à partir du surnageant par spectrofluorimétrie, soit des billes par cytométrie en flux. Ce dispositif permet la détection multiplexée des activités enzymatiques de protéines purifiées ou au sein d'extraits nucléaires. Egalement, des applications dans le criblage d'inhibiteurs de la réparation de l'ADN sont envisageables dans le cadre de recherches pré-cliniques. L'adaptation de ces tests in vitro à la détection de la réparation de l'ADN in cellulo a fait l'objet de développements préliminaires.

La réponse lymphocytaire T, spécifique, est complexe, car elle fait intervenir plusieurs acteurs et dépend de paramètres externes et internes difficiles Cette multitude de paramètres rend difficile d'appréhender la réaction, surtout du point de vue dynamique. Une meilleure connaissance de ce mécanisme permettrait d'analyser et si possible anticiper les désordres immunitaires ou d'immuno-intervention (vaccins, immunothérapies). La modélisation et la simulation numériques permettraient de tester des hypothèses, de dessiner de nouvelles conditions expérimentales et in fine d'optimiser des protocoles thérapeutiques. Dans ce but, Un modèle mathématique mimant la réponse adaptative T a été proposé par notre équipe (Bidot <i>et al.</i> 2008). Le modèle utilise des paramètres publiés et les confrontations avec des données expérimentales validées dans la littérature montrent qu'il est réaliste. Cependant, il reste encore imprécis car certains paramètres n'ont pas été déterminés. Dans le but de compléter, corriger et valider notre modèle, nous nous sommes intéressés à l'étude détaillée du lymphocyte T sous différents aspects. Dans un premier temps, nous avons étudié expérimentalement la variabilité d'expression des CD3 membranaires et ses conséquences dans l'activation des lymphocytes. Puis, nous avons cherché à étudier le comportement des lymphocytes T pour des stimulations spécifiques (selon le peptide) à l'aide d'un modèle murin spécifique d'un antigène par transfert de gène du récepteur T. Enfin, nous avons réalisé un modèle mathématique dans le but de surmonter les ambigüités des traitements statistiques des résultats de cytométrie en flux en utilisant les principes de dynamique de population.

Les organismes vivent dans des environnements dynamiques. Or la plupart des approches expérimentales étudient la fonction et la sélection des gènes dans des environnements statiques. De ce fait, la sélection naturelle agissant en environnements fluctuants reste mal comprise. L´objectif de mon projet a été de déterminer si certains gènes sont particulièrement importants pour la fitness (taux de croissance) de cellules de levures en environnements oscillants. Un crible génomique, basé sur une automatisation de micro-cultures et sur un multiplexage de banques de séquençage, m´a permis de mesurer la fitness de milliers de mutants nuls en conditions de stress périodique. J´ai trouvé que la prédictibilité de la fitness en environnements périodiques, à partir de la fitness en environnements statiques, diffère selon les gènes et les conditions. Ainsi, certains mutants présentent des croissances similaires en conditions statiques mais différentes en conditions dynamiques. Curieusement, quelques gènes jouent un rôle bivalent : ils favorisent fortement la croissance lors de fluctuations lentes et ils la défavorisent lors de fluctuations rapides. J´ai également observé de nombreux mutants avec une croissance plus élevée qu´attendue aux fréquences de fluctuations les plus rapides. Cet effet s´explique partiellement par une perte de sensibilité environnementale de ces mutants, qui continuent à se diviser rapidement malgré la présence d´un stress. Ces résultats montrent comment la sélection naturelle agit sur les mutations en environnements fluctuants. Ils ouvrent la porte à des études mécanistiques de la prédictibilité de la fitness en environnements périodiques. / Organisms live in dynamic environments. However, most experimental approaches study the function and selection of genes in steady environments. Therefore, natural selection acting on fluctuating environments remains poorly understood. The objective of my project was to determine if some genes are especially important for fitness (growth rate) of yeast cells in oscillating environments. A genomic screen, based on an automation of micro-cultures and on a multiplexing of sequencing libraries, allowed me to measure fitness of thousands of null mutants in periodic stress conditions. I found that predictability of fitness in periodic stress, from fitness in steady environments, varies depending on the specific genes and conditions considered. This way, some mutants have similar growth in steady conditions, and different growth in dynamic conditions. Curiously, some genes play a bivalent role: they strongly favor growth during slow fluctuations, and reduce it during fast fluctuations. I also observed many mutants with higher growth than expected at the highest frequencies of fluctuations. This effect can be partially explained by a loss of environmental sensitivity of those mutants, that continue to divide quickly despite the presence of a stress. Those results show how natural selection can act on mutations in fluctuating environments. They open the door to mechanistic studies of the predictability of fitness in periodic environments.

Cette thèse présente une étude du métabolisme énergétique du spermatozoïde d’huître creuse, Crassostrea gigas. Les principaux objectifs sont (1) d’établir la dynamique des caractéristiques cellulaires et biochimiques du spermatozoïde de cette espèce durant la phase de mouvement, (2) d’identifier les voies de synthèse d’ATP et leurs substrats et (3) de déterminer l’implication du métabolisme énergétique dans le succès à la fécondation du spermatozoïde de cette espèce. Les résultats de ce travail montrent la longue durée du mouvement (de 24 à 72h) du spermatozoïde d’huître creuse et le maintien d’une concentration élevée en ATP intracellulaire, jusqu'à la fin du mouvement. Le rôle de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) dans la synthèse d’ATP a été mis en évidence. Le spermatozoïde d’huître creuse montre une grande plasticité dans l’utilisation de ses voies de production d’énergie, assurant la synthèse d’ATP par d’autres voies qu’OXPHOS lorsque la mitochondrie est inhibée. L’accumulation de phosphoarginine en fin de mouvement montre une capacité de stockage de l’ATP synthétisé. La nature des substrats endogènes utilisés pour la synthèse d’ATP reste cependant à déterminer. La forte capacité de régulation du métabolisme énergétique du spermatozoïde d’huître creuse, associée à la possibilité de synthétiser de l’énergie au cours de sa longue phase de nage, contribuent probablement au succès du peuplement observé chez cette espèce. Ce travail apporte une première description du métabolisme énergétique du spermatozoïde d’huître creuse, améliorant la connaissance fine de cette cellule. / The present study aims at describing the energy metabolism of Pacific oyster, Crassostrea gigas, spermatozoon. The main objectives are: (1) describing the kinetic of cellular and biochemical characteristics of Pacific oyster spermatozoon during its movement phase, (2) identifying the metabolic pathways to produce energy and their substrates, (3) determining the involvement of energy metabolism in fertilization success. The results showed the long duration (ranging 24 to 72h) of the movement of Pacific oyster spermatozoon and the maintenance of a high intracellular ATP content until the end of the movement phase. The role of oxidative phosphorylation (OXPHOS) in ATP production was highlighted. Alternative ATP producing pathways might contribute to sustain energy production when OXPHOS is impaired, showing the high adaptation capacity of Pacific oyster spermatozoa. An increase of phosphoarginine content observed at the end of the movement phase suggests energy storage capacity. Endogenous substrates involved in ATP synthesis must be determined. Both the high regulation capacity of the energy metabolism of Pacific oyster spermatozoa and their ability to restore energy stores catabolized during movement likely contribute to the successful settlement observed in the wild. In conclusion, this work provided a fine description of energetic metabolism of Pacific oyster spermatozoon.