Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine vétérinaire : Toulouse 3 : 2008. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p. 99-106.

Le bélier a été choisi comme modèle animal en tant que reproducteur saisonnier pour l'étude de l'α-glucosidase dans le plasma séminal. Son activité spécifique est basse dans les cas d'immaturité du spermatozoïde suggérant ainsi qu'elle serait un marqueur de la fonction épididymaire. L'étude de l'enzyme dans les fluides du rete testis et de 10 zones de l'épididyme démontre que cette glande contribue majoritairement au contenu en α-glucosidase du plasma séminal. En vue d'élucider le rôle possible de cet enzyme dans le processus de maturation du spermatozoïde, l'α-glucosidase a été purifiée 10,000 fois avec un rendement de 5%. C'est une glycoprotéine très mineure de 105 KDa et de structure monomérique. / Montréal Trigonix inc. 2018

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biologie de la reproduction : Clermont-Ferrand 2 : 2005. / thèse avec publications en anglais. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliographie dispersée.

Thèse (Ph.D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Thèse d'exercice : Médecine. Médecine physique et réadaptation : Université de Nantes : 2004. / Bibliogr. f. 54-59 [77 réf.].

Pour pallier aux problèmes d'infertilité masculine, de plus en plus de cliniques de fertilité font appel à l'injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde (ICSI) directement dans un ovule. Le gamète mâle peut alors être isolé du testicule, de l'épididyme, ou obtenu après éjaculation. Les risques associés à l'ICSI font l'objet de nombreux débats en ce qui concerne les modifications -en particulier épigénétiques- que cette technique peut induire sur les gamètes et la santé de la progéniture. L'objectif de ma thèse était de cartographier le profil de méthylation d'ADN spermatique dans les différents segments du tractus mâle, de comprendre les mécanismes impliqués dans ces changements, et ultimement évaluer les conséquences que ces marques épigénétiques pourraient avoir sur le développement embryonnaire. Dans le cadre de mon projet, les spermatozoïdes testiculaires et épididymaires ont été purifiés à partir du modèle de souris transgénique (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) dans lequel les gamètes mâles présentent une fluorescence endogène et peuvent être isolés par cytométrie en flux. L'analyse par séquençage bisulfite d'une représentation réduite (RRBS) du méthylome de l'ADN spermatique a mis en évidence un profil de méthylation d'ADN variable au niveau post-testiculaire, les spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme présentant des marques de méthylation d'ADN les plus distinctes des autres régions anatomiques. L'analyse in silico de ces changements de méthylation d'ADN nous a permis de définir que la plupart des gènes ciblés par ces modifications sont associés à des fonctions importantes pour le développement embryonnaire. Afin d'étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans ces changements, l'activité des ADN (dé)méthyltransférases a été évaluée dans l'épididyme. Bien que ces enzymes soient détectées au niveau testiculaire et post-testiculaire, leur activité est réduite dans cet organe, mettant ainsi en évidence une cause alternative à ces changements. Grâce à nos analyses de cytométrie en flux, nous avons identifié l'existence de deux populations spermatiques présentant des niveaux de fluorescence CAG-DsRed distincts dans la région proximale de l'épididyme. Ces deux populations ont des profils de méthylation d'ADN significativement différents pour trois gènes d'intérêt et sont sensibles au traitement DNAse. Ceci suggère que l'association d'ADN extracellulaire avec une sous-population spermatique serait responsable du changement du profile de méthylation d'ADN observé dans la région proximale de l'épididyme. La réalisation de ce projet nous a permis 1) de définir l'hétérogénéité du méthylome de l'ADN spermatique au cours de la maturation post-testiculaire à l'aide d'outils de pointe, et 2) d'identifier les sources potentielles de ces changements. En plus de contribuer à l'avancement des connaissances, notre recherche réalisée sur un modèle murin pourrait avoir des implications directes en santé humaine. En effet, l'évaluation du degré de conservation de cette hétérogénéité épigénétique chez l'homme pourrait ultimement améliorer les critères de sélection des spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme utilisés pour l'ICSI et diminuer les risques associés. / The technique, intracytoplasmic sperm injection (ICSI), is applied more and more frequently in infertility clinics to overcome male infertility issues. In that context, spermatozoa can be collected from the testis, epididymis, or from the ejaculate, and directly injected into an egg. However, the risks associated with ICSI are the subject of much debate with regard to the modifications -particularly epigenetic- that this technique can induce on the gametes and the health of the offspring. Therefore, the main objective of my thesis was to map-out the sperm DNA methylation profile in different segments of the male tract to understand the mechanisms involved in these changes, and ultimately to assess the consequences that these epigenetic marks could have on embryonic development. As part of my project, testicular and epididymal spermatozoa were purified from the transgenic mouse model (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) in which male gametes exhibit endogenous fluorescence and can be isolated by flow cytometry. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) of the sperm DNA methylome showed a variable DNA methylation profile at the post-testicular level, with sperm from the epididymal proximal region exhibiting DNA methylation marks most distinct from other anatomical regions. The in silico analysis of these DNA methylation changes allowed us to define that most of the genes targeted by these modifications are associated with important functions for embryonic development. In order to study the mechanisms potentially involved in these changes, the expression and activity of (de)methyltransferases were assessed in the epididymis. Although these enzymes were detected at the testicular and post-testicular levels, their activity was reduced in this organ, thus highlighting an alternative cause for these changes. Through our flow cytometry analyses, we identified the existence of two sperm populations with distinct CAG-DsRed fluorescence levels in the proximal region of the epididymis. These two populations displayed significantly different DNA methylation profiles for three genes of interest and were sensitive to DNAse treatment. This suggests that the association of extracellular DNA with a sperm subpopulation would be responsible for the change in the DNA methylation profile observed in the proximal region of the epididymis. The achievement of this project allowed us to 1) define sperm DNA methylome heterogeneity during post-testicular maturation using state-of-the-art tools, and 2) identify potential sources of these changes. In addition to contributing to the advancement of knowledge, our research carried out on a mouse model could have direct implications for human health. Indeed, evaluating the degree of conservation of this epigenetic heterogeneity in humans could ultimately improve the selection criteria for spermatozoa from the proximal region of the epididymis used for ICSI and reduce the associated risks.

Pour pallier aux problèmes d'infertilité masculine, de plus en plus de cliniques de fertilité font appel à l'injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde (ICSI) directement dans un ovule. Le gamète mâle peut alors être isolé du testicule, de l'épididyme, ou obtenu après éjaculation. Les risques associés à l'ICSI font l'objet de nombreux débats en ce qui concerne les modifications -en particulier épigénétiques- que cette technique peut induire sur les gamètes et la santé de la progéniture. L'objectif de ma thèse était de cartographier le profil de méthylation d'ADN spermatique dans les différents segments du tractus mâle, de comprendre les mécanismes impliqués dans ces changements, et ultimement évaluer les conséquences que ces marques épigénétiques pourraient avoir sur le développement embryonnaire. Dans le cadre de mon projet, les spermatozoïdes testiculaires et épididymaires ont été purifiés à partir du modèle de souris transgénique (CAG/su9-DsRed2, Acr3- EGFP) dans lequel les gamètes mâles présentent une fluorescence endogène et peuvent être isolés par cytométrie en flux. L'analyse par séquençage bisulfite d'une représentation réduite (RRBS) du méthylome de l'ADN spermatique a mis en évidence un profil de méthylation d'ADN variable au niveau post-testiculaire, les spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme présentant des marques de méthylation d'ADN les plus distinctes des autres régions anatomiques. L'analyse in silico de ces changements de méthylation d'ADN nous a permis de définir que la plupart des gènes ciblés par ces modifications sont associés à des fonctions importantes pour le développement embryonnaire. Afin d'étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans ces changements, l'activité des ADN (dé)méthyltransférases a été évaluée dans l'épididyme. Bien que ces enzymes soient détectées au niveau testiculaire et post-testiculaire, leur activité est réduite dans cet organe, mettant ainsi en évidence une cause alternative à ces changements. Grâce à nos analyses de cytométrie en flux, nous avons identifié l'existence de deux populations spermatiques présentant des niveaux de fluorescence CAG-DsRed distincts dans la région proximale de l'épididyme. Ces deux populations ont des profils de méthylation d'ADN significativement différents pour trois gènes d'intérêt et sont sensibles au traitement DNAse. Ceci suggère que l'association d'ADN extracellulaire avec une sous-population spermatique serait responsable du changement du profile de méthylation d'ADN observé dans la région proximale de l'épididyme. La réalisation de ce projet nous a permis 1) de définir l'hétérogénéité du méthylome de l'ADN spermatique au cours de la maturation post-testiculaire à l'aide d'outils de pointe, et 2) d'identifier les sources potentielles de ces changements. En plus de contribuer à l'avancement des connaissances, notre recherche réalisée sur un modèle murin pourrait avoir des implications directes en santé humaine. En effet, l'évaluation du degré de conservation de cette hétérogénéité épigénétique chez l'homme pourrait ultimement améliorer les critères de sélection des spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme utilisés pour l'ICSI et diminuer les risques associés. / The technique, intracytoplasmic sperm injection (ICSI), is applied more and more frequently in infertility clinics to overcome male infertility issues. In that context, spermatozoa can be collected from the testis, epididymis, or from the ejaculate, and directly injected into an egg. However, the risks associated with ICSI are the subject of much debate with regard to the modifications -particularly epigenetic that this technique can induce on the gametes and the health of the offspring. Therefore, the main objective of my thesis was to map-out the sperm DNA methylation profile in different segments of the male tract to understand the mechanisms involved in these changes, and ultimately to assess the consequences that these epigenetic marks could have on embryonic development. As part of my project, testicular and epididymal spermatozoa were purified from the transgenic mouse model (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) in which male gametes exhibit endogenous fluorescence and can be isolated by flow cytometry. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) of the sperm DNA methylome showed a variable DNA methylation profile at the post-testicular level, with sperm from the epididymal proximal region exhibiting DNA methylation marks most distinct from other anatomical regions. The in silico analysis of these DNA methylation changes allowed us to define that most of the genes targeted by these modifications are associated with important functions for embryonic development. In order to study the mechanisms potentially involved in these changes, the expression and activity of (de)methyltransferases were assessed in the epididymis. Although these enzymes were detected at the testicular and post-testicular levels, their activity was reduced in this organ, thus highlighting an alternative cause for these changes. Through our flow cytometry analyses, we identified the existence of two sperm populations with distinct CAG-DsRed fluorescence levels in the proximal region of the epididymis. These two populations displayed significantly different DNA methylation profiles for three genes of interest and were sensitive to DNAse treatment. This suggests that the association of extracellular DNA with a sperm subpopulation would be responsible for the change in the DNA methylation profile observed in the proximal region of the epididymis. The achievement of this project allowed us to 1) define sperm DNA methylome heterogeneity during post-testicular maturation using state-of-the-art tools, and 2) identify potential sources of these changes. In addition to contributing to the advancement of knowledge, our research carried out on a mouse model could have direct implications for human health. Indeed, evaluating the degree of conservation of this epigenetic heterogeneity in humans could ultimately improve the selection criteria for spermatozoa from the proximal region of the epididymis used for ICSI and reduce the associated risks.

Le sperme est le principal vecteur de dissémination du VIH. La muqueuse colorectale exposée au sperme infecté lors de rapports anaux, aussi bien chez l’homme que chez la femme, représente le plus fort risque d’infection parmi toutes les voies de transmission sexuelle. Un nombre croissant d’études suggèrent que la transmission sexuelle du VIH via les cellules infectées présentes dans les sécrétions génitales du donneur serait plus efficace que par les particules virales libres. A ce jour, le rôle et les mécanismes de transmission des cellules infectées du sperme ont été peu étudiés. De plus, l’effet potentiel du liquide séminal (LS) sur cette transmission est mal connu. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de démontrer une transmigration active et rapide: (i) de leucocytes sanguins à travers la barrière colorectale, et un effet inhibiteur du LS sur cephénomène, sans altération de la barrière épithéliale. (ii) de leucocytes séminaux. Des analyses par cytométrie de flux ont permis de mettre évidence à la fois des particularités et des similitudes quant à l’équipement protéique des cellules séminales et de leurs équivalents sanguins. Ce travail fournit de nouvelles données sur la transmission du VIH par les cellules infectées du sperme, et sur l’effet du sperme sur la transmission colorectale. La démonstration de la transmigration de leucocytes séminaux suggère que ces cellules jouent un rôle dans la transmission du VIH au niveau colorectale qui nécessite d’être pris en compte dans les stratégies de prévention. Les mécanismes en jeu et ceux responsables de l’effet du LS restent à élucider et devrait permettre à terme de dégager de nouvelles cibles thérapeutiques. / Semen is the main vector of HIV dissemination. The colorectal mucosa exposed to semen infected cells during anal intercourse, in both men and women, represents the highest risk of infection among all sexual transmission routes. An increasing number of studies suggest that sexual transmission of HIV via infected cells present in the donor's genital secretions would be more effective than free viral particles. To date, the role and transmission mechanisms of infected sperm cells have been poorly studied. Moreover, the potential effect of seminal fluid (SF) on this transmission is poorly understood. In this context, my thesis work has demonstrated an active and rapid transmigration: (i) of blood leukocytes across the colorectal barrier, and an inhibitory effect of SF on this phenomenon, without altering the epithelial barrier. (ii) of seminal leucocytes. Flow cytometry analyzes have revealed both features and similarities in the protein equipment of seminal cells and their blood equivalents. This work provides new data on HIV transmission by infected sperm cells, and on the effect of semen on colorectal transmission. Demonstration of transmigration of seminal leukocytes suggests that these cells play a rôle in colorectal HIV transmission that needs to be considered in prevention strategies. The mechanisms involved and those responsible for the effect of SF remain to be elucidated and should eventually lead to new therapeutic targets.

Le sperme est le vecteur principal de dissémination du VIH. Des travaux récents indiquent la présence de facteurs dans le liquide séminal (LS) des hommes non infectés qui modulent l'infectivité par le VIH de cellules in vitro. Nous avons préalablement montré que les principaux organes génitaux mâles qui contribuent à l'élaboration du sperme sont infectés par le VIH, ce qui modifie probablement la composition du LS des hommes VIH+. Pour preuve, des différences significatives dans les profils cytokiniques ont été mises en évidence dans le LS d'hommes VIH+ par rapport à celui d'hommes sains. Dans ce contexte, mes travaux de thèse se sont articulés autour de 3 axes : Effet du sperme d'hommes infectés par le VIH-1 sur l'infection des lymphocytes T CD4+ : nous avons comparé, pour la première fois à notre connaissance, l'effet du LS d'hommes infectés versus celui d'hommes sains sur l'infectivité par le VIH dans des modèles cellulaires. Nous avons mis en évidence un effet différentiel du LS d'hommes séropositifs par rapport au LS d'hommes séronégatifs. L'effet stimulateur observé du LS d'hommes VIH-non-infectés sur l'infection par le VIH-1 des cellules T CD4+ est significativement diminué pour les LS d'hommes VIH+. Cet effet différentiel serait au moins en partie lié à la surexpression de certaines cytokines dont RANTES et à la sous expression à la membrane du corécepteur CCR5. Effet du LS sur l'infection d'explants cervicaux et colo-rectaux : les muqueuses cervivo-vaginale et colorectale représentent des portes d'entrée majeures du virus dans l'organisme et sont donc des modèles particulièrement physiologiques. Nous avons montré que le LS induit une diminution de l'infection ex vivo des tissus exocervicaux alors qu'aucun effet n'est observé sur l'infection des tissus colorectaux. Fractionnement du liquide séminal et identification des facteurs à activité biologique sur l'infection par le VIH-1 : nous avons débuté une approche protéomique qui nous a permis de décomplexifier le LS par fractionnement grâce à des HPLC successives, de sélectionner des fractions biologiques actives et d'identifier des protéines candidates, par spectrométrie de masse, potentiellement responsables d'un effet inhibiteur sur l'infection par le VIH-1. Sur la base de la littérature et de nos résultats, il apparaît clairement que le LS est un fluide biologique complexe dont l'effet global sur l'infection résulte de la somme des activités biologiques de facteurs stimulateurs et inhibiteurs. En outre, l'effet du sperme sur l'infection est dépendant du modèle d'étude cellulaire ou tissulaire, et du statut sérologique du donneur. En effet, les différences de composition (cytokines, peptides antimicrobiens…) entre les spermes d'hommes infectés ou non aboutissent à des modifications dans la modulation de l'infection VIH-1 par le sperme via des mécanismes directs ou indirects qui ouvrent de nombreuses perspectives d'études. / Semen represents the main vector of HIV transmission. Several studies have recently shown that, in addition of being a carrier of HIV particles and infected cells, seminal fluid (SF) could modulate the efficiency of HIV infection of target cells through its intrinsic properties. These studies were all performed with SF from uninfected donors. But the composition of SF from HIV-infected men significantly differs from that of HIV-infected men, as demonstrated by studies on SF cytokines content, and microbiome. In addition, we showed that semen-producing organs are infected by HIV which most probably influences their seminal secretions. As a matter of fact, the volume of the ejaculate of HIV+ donors is generally less than that of uninfected men. In this context, my thesis was articulated around 2 axes: Effect of SF from HIV infected men on HIV-1 infection of Lymphocytes T CD4+: the effect of SF from HIV-infected men (HIV+SF) versus SF from uninfected donors (SF) on HIV infectivity of CD4+ T cells. We observed a significantly reduced infection of CD4+T cells by HIV-1 R5 in presence of HIV+SF as compared with SF, the latter displaying enhancing activity. This differential effect was not observed on the infectivity of the CD4+ cell line TZM-bl, or on PBMC infection by HIV-1 X4. We compared the composition of HIV+SF versus SF in terms of enhancing peptides, cytokines and prostaglandins, and investigated the impact of SF from both HIV-infected and uninfected men on CD4+T cell HIV receptors expression, activation and proliferation. HIV+SF vs HIV-SF was found to induce a significantly higher downmodulation of CCR5 expression shortly after exposure, which correlated with the concentrations of CCR5 ligands in semen. Effect of SF on HIV infection of cervix and colorectal tissues: the cervix and colorectal mucosa represent major front doors of the virus in the body and are thus particularly physiological models. We showed that the SF leads to a decrease of the infection ex vivo in exocervix tissues while no effect is observed on the infection of colorectal tissues. Fractionation of the seminal fluid and identification of factors with biologic activity on the HIV-1 infection : we had beginning a proteomic approach which allowed to decomplexified SF by successive HPLC, to select active biological fractions and to identify candidate proteins, by mass spectrometry, potentially responsible for an inhibitory effect on the infection by the HIV 1. Based on the literature and on our results, it clearly appears that SF is a complex biological fluid. Moreover, the effect of the semen on HIV-1 infection is dependent on the cellular or tissular model and on the HIV status of the donor. Indeed, the differences of composition (cytokines, antimicrobial peptides) between semen from infected men or SF from uninfected men lead to modifications of the modulation of HIV-1 infection by semen via direct or indirect mechanisms which which pave the way for further investigations.