Cette recherche a été entreprise dans le "but d'apporter certaines précisions sur les mécanismes d'adaptation des enzymes pancréatiques à la composition du régime décrits par GROSSMAN(52). Dans une deuxième partie, notre travail a été orienté vers l'étude des mécanismes physiologiques qui régissent la sécrétion et la synthèse des enzymes digestifs du pancréas. Ces recherches, menées tant in vivo qu'in vitro, ont englobé l'action de différents stimuli; repas, pancréozymine, gastrine, histamine, sérotonine et acétylcholine.

Le manque d’outils diagnostiques et thérapeutiques efficaces font de l’adénocarcinome ductal pancréatique le cancer le plus létal pour les Canadiens, avec son taux de survie à 5 ans de 8 %. Il est caractérisé par une fréquence élevée de mutations de RAS (90 %) qui est requise pour l’initiation et le maintien de la carcinogenèse. De plus, il a été démontré qu’une activation aberrante de la voie de signalisation NOTCH coopère avec la signalisation RAS dans la promotion de la carcinogenèse pancréatique. La famille NOTCH comprend quatre récepteurs transmembranaires qui subissent une série de clivages protéolytiques suite à la liaison avec leurs ligands. Ces clivages permettent la libération du domaine intracellulaire de NOTCH (NIC) dans le cytosol. NIC transloque ensuite au noyau pour s’associer avec ses partenaires transcriptionnels CSL et MAML1 et favoriser l’expression de gènes cibles tels qu’HES1. Nous avons récemment démontré que l’activation des sérine/thréonine kinases ERK1/2, en aval de RAS, promeut l’expression d’HES1 de façon NOTCH-dépendante dans les cellules pancréatiques tumorales humaines. Bien que cela suggère une interaction entre les voies ERK et NOTCH, les mécanismes sous-jacents cette interaction restent à être identifiés. Il a été suggéré que PIN1, une prolyl-isomérase qui reconnait spécifiquement des résidus proline lorsque ceux-ci sont précédés d’une sérine ou d’une thréonine phosphorylée, interagit avec NIC1. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la prolyl-isomérase PIN1 régule l’activité de la voie NOTCH et a un effet positif sur la croissance des cellules pancréatiques tumorales humaines. Pour y répondre, un modèle stable de cellules pancréatiques tumorales humaines MIAPaCa2 exprimant un shARN dirigé contre PIN1 a été généré. Nous avons démontré que PIN1 et la voie RAS/RAF/MEK/ERK régulent positivement les niveaux d’expression de NIC1. De plus, les niveaux d’expression de PIN1 régulent positivement les niveaux d’expression du récepteur NOTCH1 et du ligand DLL3 sans influencer les niveaux d’expression du récepteur NOTCH3 et des ligands JAGGED 1 et JAGGED 2. PIN1 a une influence positive sur les niveaux d’expression des gènes cibles de la voie NOTCH c-MYC et cycline D1 et une influence négative sur les niveaux d’expression d’HES1. Cette étude a également démontré que les niveaux d’expression de PIN1 influencent positivement la croissance en 2D ainsi que certains régulateurs du cycle cellulaire. Lorsque les cellules MIAPaCa2 sont ensemencées à faible densité, la taille des clones formés est influencée à la fois par les niveaux d’expression de PIN1 et par la voie RAS/RAF/MEK/ERK. Cependant, dans un contexte de croissance en indépendance d’ancrage, PIN1 influence négativement la croissance des cellules MIAPaCa2. Cette étude a démontré que PIN1 pouvait influencer le phénotype des cellules pancréatiques humaines. De plus, l’étude des mécanismes de régulation de la voie NOTCH a révélé une régulation complexe impliquant PIN1.

L’adénocarcinome du pancréas qui représente la quatrième cause de cancer en termes d’incidence reste une tumeur mal comprise et l’ensemble des traitements insuffisamment efficaces. Depuis quelques années, la prise en charge des patients cancéreux s’est individualisée et tente de proposer des traitements à la carte en prenant en compte divers paramètres tumoraux. Pour le cancer du pancréas, la pertinence des hypothèses biologiques pour le pronostic et le traitement des patients, a été très peu évaluée si bien qu’a coté des facteurs cliniques et histologiques, il n’existe pas de marqueurs moléculaires clairement identifiés. Dans la première partie de nos traveaux, nous avons évalué l’intérêt pronostique d’une série de biomarqueurs dont les chimiorécepteurs CXCR4 et CXCR7. CXCR4 est exprimé par les ACP et joue un rôle dans la migration des cellules cancéreuses au travers la matrice extracellulaire, l’adressage métastatique, l’angiogénèse et la vasculogénèse tumorale. CXCR7 est impliqué dans la prolifération cellulaire. Ces deux chimiorécepteurs partagent le même ligand, CXCL12, qui est synthétisé par les cellules stellaires pancréatiques activées et est retrouvé en quantité importante dans le stroma fibrotique tumoral. L’expression de CXCR4 est en partie dépendante du facteur de transcription HIF-1 (hypoxia inducible factor). L’expression de CXCR4, CXCR7, HIF-1 et de Ki-67 à été évaluée par immunohistochimie et confrontée aux facteurs pronostiques classiques (cliniques et anatomopatholologiques). En analyse multivariée, le niveau d’expression de CXCR4 était un facteur pronostique indépendant associé à la survie sans récidive et la survie globale. De plus le niveau d’expression de CXCR4 était associé à la présence de métastase ganglionnaire sur la pièce opératoire et au risque de récidive hépatique. Dans un deuxième temps, les protéines impliquées dans la métabolisation de la gemcitabine ont été évaluées à partir d’une cohorte de patients traités par radiochimiothérapie dans le cadre de deux protocoles cliniques multicentriques de phase II. La gemcitabine pénètre dans la cellule à travers la membrane plasmique soit par diffusion facilitée par des transporteurs nucléosidiques spécifiques appelés hENT (human equilibrative nucleoside transporter), soit par des transporteurs actifs Na+-dépendants ou hCNT (human concentrative nucleoside transporter). Dans la cellule, elle est métabolisée pour générer ses dérivés cytotoxiques actifs. La gemcitabine va tout d’abord être phosphorylée en dérivé monophosphate par la déoxycytidine kinase (dCK). La dCK est considérée comme étant l’enzyme limitante du métabolisme de la gemcitabine. Deux autres étapes de phosphorylation vont suivre faisant tout d’abord intervenir l’uridylate kinase (UMK) puis une troisième kinase qui, elle, est ubiquitaire. In vitro, dans des lignées cellulaires d’adénocarcinome pancréatique, la résistance intrinsèque à la gemcitabine est associée à une diminution ou à une perte d’expression de hENT1 et de la dCK. En plus de son activité cytotoxique directe, la gemcitabine est un puissant radiosensibilisateur. La capacité de cet analogue pyrimidique à potentialiser les effets de la radiothérapie est en partie liée à sa capacité de pénétration. L’expression de hENT1, de hCNT3 et de la dCK a été évaluée et corrélée à la survie sans récidive et la survie globale des patients. En analyse multifactorielle, hENT1 et la dCK sont des facteurs pronostiques indépendants pour la survie sans récidive et la survie globale alors que hCNT3 est un facteur indépendant pour la survie globale. De plus l’analyse combinée de hENT1 et de hCNT3 s’avèrait plus discriminante dans l’identification des patients à haut rique de récidive que l’analyse de chacun de ces facteurs pris isolémment.

La voie de signalisation Notch contient quatre récepteurs transmembranaires qui sont activés de façon ligand dépendant. Les contacts cellulaires permettent l'activation des récepteurs et la relâche entre autres du fragment actif Notch 1 clivé (NIC1). Ensuite, il transloque au noyau pour s'associer à son co-activateur, CSL afin de permettre la formation d'un complexe transcriptionnel actif. La signalisation Notch est régulée à divers niveaux cellulaires. La voie Notch est très engagée durant le développement du pancréas. De plus, différents modèles ont été générés afin de mieux comprendre l'implication de la voie Notch dans le phénomène de la prolifération des cellules pancréatiques Ainsi, la voie Notch est active dans le pancréas immature et est réprimée dans le tissu adulte. La signalisation Notch est très importante pendant la carcinogenèse pancréatique. Il a été démontré que l'inhibition de la voie Notch induit une répression de la croissance cellulaire et bloque la tumorigenèse pancréatique. Une autre voie de signalisation très impliquée dans le cancer du pancréas est la voie KRas qui est mutée dans 90% des adénocarcinomes. Une coopération entre les voies Notch et KRas a été reportée dans différents types de carcinogenèse. De plus, il a été suggéré que la collaboration Notch et KRas passe spécifiquement par la cascade Mek/Erk en aval de KRas. De plus, l'inhibition de la voie Mek/Erk mène à l'inhibition de l'expression d'Hes1, une cible de la voie Notch. Ainsi, nous avions supposé que la cascade KRas/Raf/Mek/Erk favorise la transcription induite par la voie de signalisation Notch. Pour y répondre, il était donc important de déterminer l'impact de la voie Mek/Erk sur l'expression de Notch 1 clivé (NIC1) et de clarifier l'effet de cette voie sur son activité transcriptionnelle. Nous avons observé que la suractivation de la voie Mek/Erk induit un retard de migration de la protéine NIC1 qui est complètement aboli par l'inhibition de la voie Mek/Erk. Des études plus approfondies ont révélé que ces formes de plus haut poids moléculaires étaient des formes phosphorylées de NIC 1 qui pouvaient être associées directement à l'action des Erk 1. Nous avons découvert que ces modifications permettent de réguler l'activité transcriptionnelle de Notch. Ainsi, la phosphorylation de NIC1 induite par la voie Mek/Erk est associée à une augmentation de l'activité transcriptionnelle dépendante de Notch qui mène à l'expression du gène cible, Hes1. Il semble aussi que le domaine PEST de NIC 1 est essentiel afin de permettre les phosphorylations Erk-dépendantes. D'autres effets spécifiques de la voie Mek/Erk sur Notch restent à être découverts. Enfin, le potentiel de cette collaboration entre les voies Notch et KRas/Raf/Mek/Erk pourrait être impliquée dans divers processus cellulaires.

L'adénocarcinome pancréatique est la 4ème cause de décès liés aux cancers dans les pays occidentaux et constitue un véritable défi, tant l'absence de traitement curatif assombrit son pronostic. Les récurrents échecs des thérapies ciblées soulignent la particularité de sa physiopathologie vis-à-vis des autres cancers et la nécessité d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. La mutation activatrice de l'oncogène KRAS, considérée comme l'événement initiateur de la carcinogenèse pancréatique, est retrouvée dans plus de 90% des cas. L'activation consécutive des voies de signalisation MAPK et PI3K amorce la transformation tumorale et constitue un trait caractéristique du cancer pancréatique. Si la synthèse protéique est altérée dans de nombreux cancers, elle semble jouer un rôle encore plus important dans le cancer du pancréas, puisqu'elle se situe au carrefour de voies fortement activées. Les altérations des facteurs régulant l'initiation sont majoritaires, et ont pour but de détourner la machinerie traductionnelle, à l'avantage de la cellule cancéreuse. Si la cellule cancéreuse présente un niveau de synthèse protéique globalement élevé, l'augmentation sélective de la traduction de certains ARNm semble définir des comportements propres aux différents types de cancers. L'adénocarcinome pancréatique est caractérisé par une perte d'expression du répresseur traductionnel 4E-BP1 dès les stades précoces de la transformation, qui n'est observée dans aucun autre cancer. L'objectif de ces travaux était de mettre en évidence les processus cellulaires affectés par la perte de 4E-BP1, ainsi que leurs conséquences sur le développement du cancer pancréatique. Mes résultats démontrent que si l'absence de 4E-BP1 est favorable à la régénération tissulaire dans le contexte de la pancréatite, elle confère un avantage prolifératif aux cellules cancéreuses pancréatiques exprimant KRAS muté, en favorisant leur réplication. Cette faculté est acquise au travers d'une dérégulation de la synthèse d'effecteurs décisifs pour l'entrée en phase S et l'initiation de la réplication. Ceci suggère que la perte de 4E-BP1 pourrait constituer un mécanisme de résistance à la chimiothérapie en favorisant la réplication des cellules cancéreuses. En effet l'amorçage de nouveaux foyers de réplication pourrait permettre d'échapper à l'incorporation d'analogues toxiques de nucléosides tels que la gemcitabine. L'utilisation d'inhibiteurs de la traduction pourrait ainsi constituer une nouvelle approche thérapeutique, en bloquant la réplication et en potentialisant l'effet de la chimiothérapie. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the 4th cause of cancer-related deaths in western countries with a 5-years overall survival of 5% that has not improved for years. The lack of bona fide curative therapeutics brings major challenges for the development of tailored therapies. Recent clinical failures remind the particular pathophysiology of PDAC compared to other cancers and the need for new strategies to be uncovered. Mutated KRAS is considered to be the initial event in the onset of pancreatic carcinogenesis, and is found in more than 90% of cases. Consequent activation of MAPK and PI3K signaling pathways primes transformation and is particularly significant in PDAC. While protein synthesis is altered in several cancers, it seems to be highly contributive to pancreatic carcinogenesis, as it stands at the junction of hyperactivated pathways. Alterations in initiation factors are the most common, and lead to a "hijack" of the translation machinery to the advantage of the cancer cell. While global translation rates are generally higher in cancer cells, specialized cancer behaviors seem to rely on the specific translation of subsets of mRNAs. PDAC is characterized by a loss of the translational repressor 4E-BP1 that happens early in the transformation process, and which seems specific of this malignancy. Our results demonstrate that while 4E-BP1 deficiency improves tissue regeneration in the context of pancreatitis, this confers proliferative advantage to pancreatic cancer cells expressing mutated KRAS through increased replication. This ability is acquired through enhanced synthesis of effectors involved in S phase entry and replication initiation. Those results suggest that 4E-BP1 loss may serve as a mechanism of resistance to chemotherapy, by promoting cancer cells replication. Priming of new replication foci could be an escape from incorporation of toxic nucleosides such as gemcitabine. The use of translation inhibitors might be a novel therapeutic approach through replication blocking and chemotherapy potentiation.

Depuis leur découverte, les glycogènes synthase kinases 3 (GSK3) ont été associées à de multiples fonctions cellulaires, incluant notamment la prolifération et la survie cellulaire. La délétion homozygote de GSK3? chez les souris est létale au stade embryonnaire E13,5 et il a été démontré que l'apoptose massive des hépatocytes due à une hypersensibilité au TNF? serait la principale cause de la létalité suggérant que l'activité de GSK3? est nécessaire pour la survie cellulaire. Plusieurs études suggèrent une activité des GSK3 plus élevée dans certains types de cancers, particulièrement au niveau des adénocarcinomes pancréatiques. Différentes études proposent que les GSK3 pourraient réguler la voie NF?B et influencer la prolifération et la survie des cellules pancréatiques tumorales. Mes travaux de maîtrise visaient à déterminer le rôle des GSK3 dans la survie et la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. Dans un premier temps, l'inhibition prolongée (24 à 72h) de l'activité des GSK3 a permis d'observer une diminution de l'activité métabolique des cellules pancréatiques tumorales humaines : MIA PaCa2 et PANC-1. Cette diminution semble être due en partie à une induction de l'apoptose et à une inhibition de la prolifération cellulaire. En effet, l'inhibition des GSK3 induit l'apoptose chez les cellules pancréatiques tumorales humaines (MIA PaCa2, PANC-1 et BxPC3) après 48 et 72h, mais non chez les cellules d'origine non-tumorale (HPDE6 et HEK293T). L'étude plus approfondie du mécanisme moléculaire de l'apoptose induit suite à l'inhibition des GSK3 par l'inhibiteur pharmacologique spécifique SB216763 démontre 1- l'activation des caspases 3 et 7, 2- l'augmentation de l'homologue BCL-2 pro-apoptotique BIM et 3- la diminution de l'homologue anti-apoptotique BCL-2. L'analyse des voies de signalisation associées à la survie cellulaire et à l'apoptose suite à l'inhibition des GSK3 a permis d'observer l'activation de la voie JNK-c-Jun qui contribuerait potentiellement à l'induction de l'apoptose. À cet égard, nous avons observé que la voie JNK est nécessaire 1- au clivage de PARP, 2- à l'activation de la caspase 7 et 3- à l'augmentation de BIM induit par l'inhibition des GSK3. De plus, la diminution de l'expression de c-Jun, une cible des JNK, à l'aide d'un siARN prévient la modulation de BIM par l'inhibition des GSK3, alors que l'induction de l'apoptose n'est pas bloquée. Donc, l'activation de la voie JNK-c-Jun semble également nécessaire à la régulation de l'homologue BCL-2 proapoptotique BIM. Nous avons ensuite observé que la voie MEKK1-JNK-c-Jun semble insuffisante pour induire l'apoptose des cellules PANC-1, suggérant que l'activation de la voie JNK pourrait requérir la régulation de d'autres voies afin d'induire l'apoptose. Dans un deuxième temps, nous avons observé que l'inhibition des GSK3 pendant 16h inhibe la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. En effet, nous avons observé que l'inhibition des GSK3 pendant 16h empêche l'atteinte du point de restriction en phase G1 du cycle cellulaire. Nous avons observé qu'en réponse au sérum les GSK3 sont inactivées de façon transitoire (0- 10h) avant d'être réactivées (10-16h). L'inhibition de l'activité des GSK3 lors de leur réactivation (10-16h) par le SB216763 prévient 1- l'hyperphosphorylation de pRb et de p130 et 2- l'augmentation d'E2F1 induites par le sérum et 3- diminue l'expression d'E2F4, suggérant un rôle des GSK3 dans la phase G1 tardive du cycle cellulaire. Également, nous avons observé la présence de complexes formés de GSK3-pRb et de GSK3?-E2F4 dans les cellules pancréatiques tumorales humaines. Ces observations suggèrent que l'activité des GSK3 pourrait contribuer à l'hyperphosphorylation de pRb et de p130 et pourrait également réguler directement l'activité des E2F. Bref, ces résultats suggèrent que l'activité des GSK3 est essentielle pour la survie et la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. Les auteurs suggèrent donc que l'inhibition des GSK3 pourrait s'avérer un traitement potentiel du cancer pancréatique, en ciblant les cellules cancéreuses. [Symboles non conformes]

L’adénocarcinome canalaire pancréatique est une maladie agressive et dévastatrice qui est caractérisée par une progression rapide et une résistance aux traitements. Le développement de nouveaux vecteurs à fort potentiel de transfert de gène dans les cellules tumorales pourrait être un outil performant et innovant pour améliorer les traitements existants. Nous avons développé un système de ciblage des cellules tumorales pancréatiques via l’antigène de surface Mucine 4 en utilisant des vecteurs lentiviraux spécifiques permettant le transfert efficace du gène cytotoxique de la Thymidine Kinase (hsv-TK) directement dans des modèles de tumeurs. La transduction lentivirale de cellules tumorales pancréatiques a été possible dans des xénogreffes orthotopiques. Le transfert du gène TK suivi d’un traitement au ganciclovir a montré des résultats encourageants in vivo. L’approche thérapeutique présentée ici semble être plus sécurisé, plus spécifique et aussi efficace qu’un lentivirus à large tropisme pour le transfert de gène dans les tumeurs pancréatiques. La mise en évidence de nouvelles cibles moléculaires dont la dérégulation participe au développement et à l’agressivité des tumeurs pancréatiques pourraient être utilisées pour moduler favorablement les traitements thérapeutiques en cours. De plus, ces nouvelles cibles moléculaires pourraient également servir de facteur de détection précoce ou de marqueurs pronostiques de l’adénocarcinome pancréatique. L’implication des isoformes du récepteur FGFR3 dans les mécanismes moléculaires de l’adénocarcinome pancréatique a été évaluée pour la première fois. Un rôle opposé d’oncogène et de gène suppresseur de tumeur a été découvert pour le FGFR3 en fonction du contexte cellulaire. Des voies de signalisation différentes sont empruntées pour induire ces effets opposés dans les cellules tumorales pancréatiques. Cette nouvelle donnée devra être considérée pour des thérapies ciblées impliquant des inhibiteurs de tyrosine kinases qui, s’ils sont utilisés dans un mauvais contexte cellulaire, pourraient être plus dangereux que bénéfiques. / Pancreatic ductal adenocarcinoma is an aggressive and devastating disease, which is characterized by rapid progression and resistance to treatment. The development of new vectors with high potential of gene transfer in tumor cells could be an innovative and valuable tool. We have developed a strategy of pancreatic tumor cells targeting with the cell surface marker Mucin 4 using specific lentiviral vectors for the efficient transfer of the thymidine kiniase cytotoxic gene within the tumor. Lentiviral transduction of human pancreatic tumor cells was possible when cells were grafted orthotopically. The hsv-TK/GCV anti-cancer system showed promising results in vivo. The approach presented here appeared to be a safer, much more specific and an as efficient way to perform gene delivery in pancreatic tumors, in comparison with a broad tropism lentivirus. Discovering new molecular targets which modulation contributes to the development and aggressiveness of pancreatic tumors could favorably modulate the current therapies. Furthermore, these new molecular targets could also serve as factors of early detection or prognostic markers of pancreatic adenocarcinoma. The involvement of FGFR3 receptor in the molecular mechanisms of pancreatic adenocarcinoma was evaluated for the first time. Opposite roles of both oncogene and tumor suppressor gene have been discovered for FGFR3 depending on the cellular context. Importantly, molecular pathways supporting these effects are different. This new data should be considered for targeted therapies involving tyrosine kinase inhibitors. If used in the wrong cell context they could be more dangerous than beneficial

L'apeline, ligand endogène du Récepteur Couplé aux Protéines G, APJ, joue un rôle majeur au niveau cardiovasculaire, notamment dans l'angiogenèse physiologique et la néovascularisation tumorale. Par une étude profiling array, notre équipe à mis en évidence que le gène de l'apeline est surexprimé dans un tiers des adénocarcinomes humains, et de manière intéressante, avec une fréquence très élevée (2/3) dans les cancers du pancréas. Ainsi, mon projet de thèse avait pour but de caractériser l'implication du système apelinergique dans le cancer du pancréas. L'adénocarcinome pancréatique canalaire (ADK) est la forme la plus commune des cancers du pancréas et la découverte de biomarqueurs et nouvelles cibles potentielles est particulièrement importante pour ce cancer dont le diagnostic est tardif et les traitements peu efficaces. Par une approche immunohistochimique sur des coupes d'ADK humains (49 patients), nous avons mis en évidence que l'apeline et APJ sont fortement exprimés par les cellules tumorales pancréatiques. Dans le but de caractériser l'expression spatio-temporelle de l'apeline et de son récepteur au cours de la carcinogenèse pancréatique, nous avons étudié par immunohistochimie leur expression dans des modèles murins d'ADK. Ainsi, dans les souris K-ras (Lox-Stop-Lox-K-rasG12D/+/Pdx1-Cre) récapitulant les stades précoces de la pathologie, et le modèle murin KPC (Lox-Stop-Lox- K-rasG12D/+ ; Lox-Stop-Lox-Trp53 R172H/+/Pdx1-Cre) qui développe un ADK jusqu'au stade invasif, nos résultats mettent en évidence que l'apeline et son récepteur APJ sont exprimés par les cellules tumorales et ce, dès les premiers stades de la carcinogenèse. Afin d'étudier la fonction de la voie de signalisation apeline, nous avons caractérisé les cascades de transduction activées par l'apeline dans la lignée tumorale pancréatique humaine MiaPaCa qui exprime de façon endogène APJ et l'apeline comme retrouvé in vivo.Dans ces cellules, l'apeline induit la stimulation transitoire des ERKs et de la p70S6 Kinase, l'activation prolongée d'Akt et la phosphorylation inhibitrice de GSK3 stabilisant ainsi la Beta-caténine. De manière intéressante, mes travaux mettent en évidence que l'activation de la voie MAPK induite par l'apeline est dépendante de la protéine Gi. A l'inverse, la stimulation soutenue de la voie PI3K/Akt est indépendante de la voie G mais implique l'internalisation du récepteur. De plus, l'apeline régule positivement la quantité protéique de c-myc et cycline D1 tous deux impliqués dans la prolifération cellulaire, ainsi que de l'Hexokinase 2 permettant de maintenir un fort flux glycolytique, essentiel aux besoins énergétiques de la cellule tumorale. Ces résultats sont en accord avec les effets cellulaires que nous observons puisque l'apeline stimule la prolifération, la capture du glucose ainsi que la migration des cellules tumorales, des propriétés essentielles participant à la progression tumorale.Dans ce contexte, la surexpression de l'apeline et de son récepteur dans l'ADK et l'effet de cette de voie de signalisation sur la cellule tumorale fait de ce couple ligand/récepteur une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement du cancer du pancréas. / Apelin, the endogenous ligand of the human G-protein coupled receptor, APJ, is a key regulator of cardiovascular system, notably during physiological and tumor angiogenesis. Using a cancer profiling array approach, our team clearly showed that apelin gene is overexpressed in one third of the human carcinomas, with the highest frequency (2/3) in pancreatic cancers. Thus, the aim of my PhD project was to characterize apelin signaling function during pancreatic carcinogenesis. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most common form of pancreatic cancer and the discovery of biomarkers and new therapeutic targets is of crucial interest for this cancer since this cancer is diagnosed too late and there is no effective therapy. By an immunohistochemistry approach on human PDAC slides (49 patients), we show that apelin and APJ are strongly expressed by pancreatic tumor cells. In order to characterize apelin and APJ spatio-temporal expression during pancreatic carcinogenesis, we have studied their expression by immunohistochemistry in genetically engineered mouse models of PDAC. In the K-ras mouse model (Lox-Stop-Lox-K-rasG12D/+/Pdx1-Cre) which recapitulates early stages of the disease, and in the KPC mouse model (Lox-Stop-Lox- K-rasG12D/+ ; Lox-Stop-Lox-Trp53 R172H/+/Pdx1-Cre) which develops PDAC until invasive stages, our results demonstrate that apelin and its receptor are expressed by tumor cells since the first steps of carcinogenesis. In order to study apelin signaling function, we have characterized signal transduction pathways activated by apelin in MiaPaCa human pancreatic cancer cell line endogenously expressing apelin and APJ as observed in vivo. In these cells, apelin induces transient activation of ERKs and p70S6 Kinase, a sustained Akt activation and an inhibitory phosphorylation of GSK3 thus allowing Beta-catenin stabilization. Interestingly, my results demonstrate that the MAPK pathway activation apelin induced is Gi protein dependent. Conversely, long term stimulation of PI3K/Akt pathway is G protein independent but instead involves receptor internalization. Moreover, apelin positively regulates on one hand c-myc and cyclin D1 protein levels, both of them being implicated in cell proliferation and on the other hand, intracellular protein content of Hexokinase 2 in order to ensure high glycolytic flux which is essential for tumor cells energy supply. These results are in agreement with cellular effects that we observed since apelin stimulates proliferation, glucose uptake and migration of tumor cells which are essentials properties for tumor progression. Accordingly, apelin and APJ overexpression in PDAC and the effects of this signaling pathway on tumor cells make of this ligand/receptor couple a new potential therapeutic target for pancreatic cancer treatment.

L'adénocarcinome pancréatique (PDAC) est un des cancers les plus létaux, tuant environ 95% des patients diagnostiqués à 5 ans. A l'heure actuelle, aucune chimiothérapie curative n'est disponible. La voie PI3K est une des voies les plus altérées dans les cancers. En particulier, dans la moitié des cancers pancréatiques, une augmentation d'activité de la voie PI3K/Akt/mTOR a été décrite et corrélée à un mauvais pronostic. Les enzymes de signalisation phosphoinositide-3-kinase (PI3K) de classe I sont présentes chez les mammifères sous plusieurs isoformes (p110a, p110ß p110d et p110y). Les isoformes p110a et p110ß sont ubiquitaires alors que p110d et p110y sont majoritairement exprimées dans les cellules immunitaires. Toutes les isoformes de classe I présentent un domaine d'activation par Ras, dont la fonctionnalité reste à être approfondie. Les PI3Ks de classe I phosphorylent le PIP2 en PIP3, un second messager lipidique capable de réguler des fonctions biologiques très variées telles que la prolifération ou la différenciation cellulaire. Bien que les rôles physiologiques des différentes isoformes de PI3K commencent à être connus, le débat actuel dans le domaine des PI3Ks est de savoir quelle isoforme cibler dans le traitement des cancers. Il a récemment été publié que la dépendance à la voie PI3K/Akt d'une tumeur est liée, selon l'organe et les altérations génétiques associées, à l'activité d'une isoforme. La mutation activatrice de l'oncogène KrasG12D est retrouvée dans plus de 90% des cas d'adénocarcinomes pancréatiques et est reconnue comme la mutation " initiatrice " du PDAC. Les souris qui présentent une activation constitutive de l'oncogène KrasG12D reproduisent toutes les étapes de la carcinogenèse pancréatique humaine, des lésions prénéoplasiques jusqu'à l'adénocarcinome (5% des souris à 12 mois). Partant des constats que les PI3K et Kras interagissent physiquement et que seules p110a et p110ß sont exprimées dans le pancréas sain, l'objectif de mon projet de thèse était de déterminer si les deux isoformes ubiquitaires de PI3K pouvaient jouer des rôles différents dans l'initiation de la carcinogenèse pancréatique induite par Kras muté. Pour cela, nous avons généré un nouveau modèle murin qui associe la mutation de l'oncogène KrasG12D avec une inactivation conditionnelle de l'activité kinase de p110a ou de p110ß, mimant ainsi l'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique spécifique. Durant ma thèse, j'ai démontré que seule l'isoforme p110a est nécessaire à l'initiation de la carcinogenèse pancréatique induite par Kras muté. De manière dose-dépendante, l'inactivation d'une seule copie de p110a prolonge significativement la survie des animaux, tandis que les souris présentant une inactivation complète de l'activité kinase de p110a ne développent pas de lésion prénéoplasique. L'inactivation de cette seule isoforme bloque totalement la transdifférenciation des acini, normalement induite par Kras muté ou lors d'une pancréatite aigüe. p110a contrôle cette reprogrammation cellulaire, ainsi que les modifications morphologiques associées, en régulant les petites GTPases Rho, intermédiaires de signalisation essentielles au remodelage du cytosquelette d'actine. De plus, l'activité kinase de p110a est essentielle au maintien d'autres voies de signalisation oncogéniques comme les voies EGFR/MAPK, NF-kB ou encore IL6/STAT3. Dans un modèle de carcinogenèse pancréatique agressif où le suppresseur de tumeur p53 est partiellement inactivé, p110a exprimée dans l'épithélium est impliquée dans la progression tumorale en régulant la prolifération des cellules canalaires mais également, celle des cellules du microenvironnement par une action possiblement paracrine. Cette étude est la première démonstration génétique in vivo de l'implication d'une isoforme de PI3K dans le cancer du pancréas, et apporte un rationnel en faveur de l'utilisation des inhibiteurs spécifiques de p110a dans le traitement du cancer du pancréas. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal cancers, with a 5-yr survival rate <5% of diagnosed patients. No efficient chemotherapy is currently available. PI3K signaling is one of the most altered signaling pathways in cancer. In half of PDAC, PI3K/Akt/mTOR activation is increased and correlated with poor prognosis. Mammals have four isoforms of Class I PI3K (p110a, p110ß p110d and p110y)which activate the Akt/mTOR signaling pathway. p110a and p110ß are ubiquitously expressed whereas p110d and p110y are mainly expressed in immune cells. All PI3K isoforms possess a Ras-binding domain whether it is functional for all isoforms remains to be demonstrated. Upon cell stimulation by cell surface receptors, PI3K generate the phosphatidylinositol tri-phosphate (PIP3), a lipid messenger involved in many cellular processes such as cell growth, proliferation, migration or cell differentiation. PI3K isoforms have nonredundant roles under physiological, nondisease conditions. In cancer, this redundancy of PI3K isoforms appears more complex and intensely debated. It is thus crucial to delineate and understand which PI3K isoform we have to target for each cancer type. Recently, it was shown that PI3K/Akt tumour dependency is tissue-specific and depends on genetic alterations. KrasG12D -activating mutation is found in more than 90% of PDAC and known as the PDAC-initiative mutation. Pancreatic specific expression of a KrasG12D allele in mice faithfully reproduces human pancreatic cancerogenesis, from preneoplastic lesions to adenocarcinoma. Based on the fact that PI3K isoforms and Kras interacts physically and that Kras is the major mutation in PDAC, the aim of my PhD project aims to determine if the two ubiquitous PI3K isoforms, p110a and p110ß, could have non redundant roles during Kras-driven pancreatic cancer initiation. In order to dissect the putative divergent role of p110a and p110ß in the inititation of Kras-driven pancreatic cancerogenesis, we generated new mice models which combined the expression of mutated-Kras and an inactivation of the p110a or p110ß-kinase domains in the pancreas using a conditional targeting strategy, mimicking pharmacological blockade of p110a or p110ß activity. During my PhD, I demonstrated that PI3K p110a isoform is required for Kras-driven pancreatic cancerogenesis. Inactivation of one copy of the pik3ca gene is sufficient to prevent mouse lethality and complete inactivation of p110a catalytic activity completely blocked the occurrence of all types of preneoplastic lesions induced by mutated Kras. Inactivation of this single isoform abrogates the transition of exocrine acinar cells into pancreatic preneoplastic ductal lesions induced by oncogenic Kras and/or pancreatic injury. p110a signaling through small GTPase Rho and actin cytoskeleton controls the reprogramming of acinar cells and regulates cell morphology in vivo and in vitro. Moreover, p110a kinase activity is required for the maintenance of other oncogenic signaling pathways as EGFR/MAPK, NF-kB or IL6/STAT3 axis. Finally, epithelial p110a was necessary for pancreatic ductal cancers to arise from Kras-induced pancreatic preneoplastic lesions by increasing epithelial and stromal cells proliferation in the context of mutated p53. This is the first genetic demonstration of the physiopathological implication of one PI3K isoform in PDAC in vivo and my data provide a strong rational for the use of selective p110a inhibitors in pancreatic cancer therapeutic strategy.

Le pancréas est impliqué dans la digestion alimentaire et le contrôle glycémique. Cette diversité fonctionnelle repose sur des facteurs transcriptionnels et épigénétiques qui assurent une régulation coordonnée de l’identité et de la fonction des cellules. Ma thèse vise à caractériser le rôle de certains de ces facteurs. Nous avons précédemment montré le rôle de Hnf1b dans le développement du pancréas. Nous montrons que son inactivation post-natale chez la souris induit de graves défauts canalaires ainsi qu’une pancréatite associée à des néoplasies intra-épithéliales. La pathologie MODY5 est liée à des mutations de HNF1B. Nous avons analysé un modèle murin du MODY5 généré par insertion d’une mutation humaine chez la souris. Notre étude montre que ces souris constituent un bon modèle de la maladie. Elles sont intolérantes au glucose et présentent une réduction du volume total des gros ilots et des cellules bêta. Sur le plan exocrine, elles développent une pancréatite. Nos analyses suggèrent une étiologie embryonnaire. Antérieurement, notre équipe a montré le rôle des HDACs dans le développement du pancréas. Basés sur l’analogie des voies qui régulent développement et régénération du pancréas, nous avons étudié le rôle des HDACs dans la régénération pancréatique. Nous montrons que l’inactivation de HDAC3 sensibilise le tissu acinaire à l’inflammation et abroge sa régénération. Nos études dévoilent l’implication de nouveaux mécanismes moléculaires dans la survenue de la pancréatite, du cancer du pancréas et du diabète. Ces données pourront contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement ou la prévention des pathologies du pancréas. / The pancreas is crucial for food digestion and glycemic control. Its functional diversity is based on transcriptional and epigenetic factors which ensure the regulation of cellular identity and function. My thesis aims to characterize the role of some of these factors. We previously showed that Hnf1b is required for pancreas development. We show here that Hnf1b post-natal inactivation in mouse leads to strong ductal defects and pancreatitis associated with intraepithelial neoplasia. In human, HNF1B heterozygous mutations cause the MODY5 pathology. We analyzed a unique MODY5 mouse model generated by insertion of human mutation in mouse. We show that these mice constitute a valuable model of the disease. They are glucose intolerant and display reduced total volume of large islets and beta-cells. The exocrine compartment is also altered as mice develop a pancreatitis phenotype. Our analyses suggest an embryonic etiology. Previously, our team revealed HDAC roles in pancreas development. Pancreas regeneration and pancreas development sharing common molecular pathways, we investigated the role of HDACs in pancreas regeneration. We found that HDAC3 inactivation sensitizes acinar tissue to inflammation and prevents its regeneration. Our studies reveal new molecular mechanisms implied in the development of pancreatitis, pancreatic cancer and diabetes. These data could contribute to the identification of new therapeutic targets for the treatment of pancreatic pathologies.