Depuis leur découverte, les glycogènes synthase kinases 3 (GSK3) ont été associées à de multiples fonctions cellulaires, incluant notamment la prolifération et la survie cellulaire. La délétion homozygote de GSK3? chez les souris est létale au stade embryonnaire E13,5 et il a été démontré que l'apoptose massive des hépatocytes due à une hypersensibilité au TNF? serait la principale cause de la létalité suggérant que l'activité de GSK3? est nécessaire pour la survie cellulaire. Plusieurs études suggèrent une activité des GSK3 plus élevée dans certains types de cancers, particulièrement au niveau des adénocarcinomes pancréatiques. Différentes études proposent que les GSK3 pourraient réguler la voie NF?B et influencer la prolifération et la survie des cellules pancréatiques tumorales. Mes travaux de maîtrise visaient à déterminer le rôle des GSK3 dans la survie et la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. Dans un premier temps, l'inhibition prolongée (24 à 72h) de l'activité des GSK3 a permis d'observer une diminution de l'activité métabolique des cellules pancréatiques tumorales humaines : MIA PaCa2 et PANC-1. Cette diminution semble être due en partie à une induction de l'apoptose et à une inhibition de la prolifération cellulaire. En effet, l'inhibition des GSK3 induit l'apoptose chez les cellules pancréatiques tumorales humaines (MIA PaCa2, PANC-1 et BxPC3) après 48 et 72h, mais non chez les cellules d'origine non-tumorale (HPDE6 et HEK293T). L'étude plus approfondie du mécanisme moléculaire de l'apoptose induit suite à l'inhibition des GSK3 par l'inhibiteur pharmacologique spécifique SB216763 démontre 1- l'activation des caspases 3 et 7, 2- l'augmentation de l'homologue BCL-2 pro-apoptotique BIM et 3- la diminution de l'homologue anti-apoptotique BCL-2. L'analyse des voies de signalisation associées à la survie cellulaire et à l'apoptose suite à l'inhibition des GSK3 a permis d'observer l'activation de la voie JNK-c-Jun qui contribuerait potentiellement à l'induction de l'apoptose. À cet égard, nous avons observé que la voie JNK est nécessaire 1- au clivage de PARP, 2- à l'activation de la caspase 7 et 3- à l'augmentation de BIM induit par l'inhibition des GSK3. De plus, la diminution de l'expression de c-Jun, une cible des JNK, à l'aide d'un siARN prévient la modulation de BIM par l'inhibition des GSK3, alors que l'induction de l'apoptose n'est pas bloquée. Donc, l'activation de la voie JNK-c-Jun semble également nécessaire à la régulation de l'homologue BCL-2 proapoptotique BIM. Nous avons ensuite observé que la voie MEKK1-JNK-c-Jun semble insuffisante pour induire l'apoptose des cellules PANC-1, suggérant que l'activation de la voie JNK pourrait requérir la régulation de d'autres voies afin d'induire l'apoptose. Dans un deuxième temps, nous avons observé que l'inhibition des GSK3 pendant 16h inhibe la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. En effet, nous avons observé que l'inhibition des GSK3 pendant 16h empêche l'atteinte du point de restriction en phase G1 du cycle cellulaire. Nous avons observé qu'en réponse au sérum les GSK3 sont inactivées de façon transitoire (0- 10h) avant d'être réactivées (10-16h). L'inhibition de l'activité des GSK3 lors de leur réactivation (10-16h) par le SB216763 prévient 1- l'hyperphosphorylation de pRb et de p130 et 2- l'augmentation d'E2F1 induites par le sérum et 3- diminue l'expression d'E2F4, suggérant un rôle des GSK3 dans la phase G1 tardive du cycle cellulaire. Également, nous avons observé la présence de complexes formés de GSK3-pRb et de GSK3?-E2F4 dans les cellules pancréatiques tumorales humaines. Ces observations suggèrent que l'activité des GSK3 pourrait contribuer à l'hyperphosphorylation de pRb et de p130 et pourrait également réguler directement l'activité des E2F. Bref, ces résultats suggèrent que l'activité des GSK3 est essentielle pour la survie et la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. Les auteurs suggèrent donc que l'inhibition des GSK3 pourrait s'avérer un traitement potentiel du cancer pancréatique, en ciblant les cellules cancéreuses. [Symboles non conformes]

Plusieurs études ont suggéré une implication des glycogène synthase kinases 3 (GSK3) dans la carcinogenèse, notamment du pancréas. Des études ont rapporté des résultats contradictoires quant à l’impact des GSK3 sur la survie cellulaire. Au niveau du pancréas, il a été observé que l’inhibition des GSK3 inhibe la croissance entre autres via la régulation de la voie JNK ou NFkB. Les inhibiteurs des GSK3 sont présentement à l’étude comme traitement de différentes pathologies, notamment pour le cancer pancréatique. Une meilleure compréhension des voies de signalisation régulées par les GSK3 sera donc nécessaire. Nous avons entrepris ces travaux afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation de la survie des cellules pancréatiques tumorales par les GSK3. Nous avons démontré que l’inhibition des GSK3 induit l’apoptose et l’autophagie dans les cellules pancréatiques tumorales humaines. L’inhibition des GSK3 stimule l’autophagie autant dans les cellules pancréatiques tumorales que non tumorales, alors que l’apoptose est induite spécifiquement dans les cellules tumorales. Contrairement à l’apoptose, l’autophagie est induite indépendamment de la voie JNK-cJUN suite à l’inhibition des GSK3. Nos résultats démontrent que l’inhibition des GSK3 mène à l’inactivation de la voie mTORC1 qui pourrait contribuer à l’induction de l’autophagie. D’autre part, nos travaux ont démontré pour la première fois que les GSK3 régulent le facteur de transcription EB (TFEB) dans les cellules pancréatiques tumorales. En effet, l’inhibition des GSK3 entraîne la déphosphorylation de TFEB, notamment sur la Ser211, la dissociation des 14-3- 3 et sa translocation nucléaire. Nos résultats suggèrent que la régulation de TFEB par les GSK3 impliquerait des Ser/Thr phosphatases et pourrait être indépendante de l’activité mTORC1. L’inhibition de l’autophagie ou la déplétion de l’expression de TFEB sensibilise les cellules pancréatiques tumorales à l’apoptose induite suite à l’inhibition des GSK3 suggérant un rôle pro-survie de l’autophagie et de TFEB dans ces cellules. Enfin, l’inhibition des GSK3 semble mener à l’inhibition de la glycolyse qui contribuerait à l’induction de l’apoptose. En résumé, nos résultats démontrent que l’inhibition des GSK3 induit à la fois des signaux pro-apoptotiques et pro-survie suggérant que l’équilibre entre ces signaux dicterait l’impact des GSK3 sur la survie des cellules pancréatiques tumorales humaines.

Etude à l'aide des outils de transcriptomique de 17 cultures primaires, maintenues à l'état vivant par xénogreffes et cultures cellulaires, et issues de patients ayant présenté un adénocarcinome pancréatique. Par clustering hiérarchique basée sur l'ensemble des gènes du transcriptome tumoral, 5 patients avec dénomination anonyme se sont fortement distingués des autres patients et présentaient de façon similaire des tumeurs peu différenciées sur le plan histologique et une survie péjorative de moins de 8 mois. Dans cette population de « courts survivants », un total de 942 gènes exprimés de façon significativement différentielle a été retrouvé. Parmi ces gènes, 439 gènes sont apparus significativement sous exprimés et 505 gènes significativement surexprimés (fold change ≥2). L'analyse par GO a montré que parmi ces 942 gènes différentiellement exprimés, nous avons retrouvé un enrichissement important chez les courts survivants, des gènes impliqués dans le cycle cellulaire et l'activité mitotique, la réponse cellulaire au stress, le métabolisme cellulaire ainsi que le métabolisme de l'ADN et l'organisation chromosomique. Par ailleurs, nous avons choisi parmi les 17 cultures primaires, les 3 lignées cellulaires les plus sensibles et les 3 les plus résistantes aux drogues selon les résultats des tests de « Chimiogramme ». Plusieurs gènes ont été identifiés comme spécifiquement surexprimés ou sous-exprimés en relation avec une sensibilité ou une résistance particulières des cellules aux drogues utilisées. Nous avons identifié 671 gènes associés à la gemcitabine, 1107 à l'oxaliplatine, 308 au 5-FU et seulement 34 et 46 au docétaxel et au SN38 respectivement. / We developed an efficient strategy in which PDAC samples from 17 consecutive patients were collected by Endoscopic Ultrasound-Guided Fine-Needle Aspiration (EUS-FNA) or surgery and preserved, by an original approach, as breathing tumors by xenografting and as a primary culture of epithelial cells. Transcriptomic analysis was performed from breathing tumors by an Affymetrix approach. We observed a significant heterogeneity in the RNA expression profile of tumors. However, the bioinformatic analysis of this data was able to discriminate between patients with long- and short-term survival corresponding to patients carrying poorly-differentiated PDAC tumors respectively. We identified 942 genes with statically different expression. Among these genes, 439 were under-expressed and 505 genes over-expressed (fold change ≥2) in short survivors. Primary culture of cells allowed us to analyze their relative sensitivity to anticancer drugs in vitro by a "Chemogram", by similarity with the antibiogram for microorganisms, establishing an individual profile of drug sensitivity. As expected, the response was patient-dependent. Interestingly, we also found that the transcriptome analysis predict the sensitivity of cells to the five anticancer drugs the most frequently used to treating patients with PDAC. In conclusion, using this approach, we found that the transcriptomic analysis could predict the sensitivity to anticancer drugs and the clinical outcome of patients with PDAC.

TP53INP1 est un gène suppresseur de tumeur qui est inactivé dans les lésions pré-tumorales pancréatiques. Il est impliqué dans la régulation de la mort cellulaire notamment via l'activation de la voie p53. Cette thèse a pour objectif de mieux caractériser le mécanisme d'action de TP53INP1 afin de mieux comprendre son rôle suppresseur de tumeur dans le cancer pancréatique. Nous avons montré dans un premier temps que TP53INP1 est associé à une diminution de la migration cellulaire via l'inhibition de l'expression du gène SPARC. Dans un second temps, nous avons montré que la protéine TP53INP1 est impliquée dans l'autophagie, où elle interagit avec les protéines de la famille LC3/Atg8 au sein des autophagosomes, et favorise la mort cellulaire de manière dépendante de l'autophagie. Enfin, nous avons mis en évidence que TP53INP1 est régulée par le contexte de stress cellulaire via des modifications post-traductionnelles. En effet, nous avons montré que la SUMOylation de TP53INP1 est nécessaire à l'activation de la réponse au stress oxydatif de p53. Ces travaux ont donc permis de mieux caractériser le rôle de suppresseur de tumeur de TP53INP1 et son mécanisme de régulation. / TP53INP1 is a tumor suppressor gene which is inactivated in early pancreatic lesions. It is involved in regulation of cell death through the activation of the p53 pathway. The aim of this work is to better characterize the molecular mechanism of action of TP53INP1 in order to better understand its tumor suppressor role. Firstly, we have shown that TP53INP1 expression is associated with a decreased cell migration through the down-regulation of SPARC. Secondly, we have demonstrated that TP53INP1 is involved in autophagy, through its direct interaction with LC3/Atg8 family proteins into the autophagosomes, and induces autophagy-dependent cell death. Then, we have shown that TP53INP1 is regulated by cellular context, through its post-translational modifications. Indeed, the SUMOylation of TP53INP1 is required to activate the p53 oxidative stress response pathway. All these findings allow a better understanding of the tumor suppressor role of TP53INP1 and of its regulation mechanism.

La protéine de stress p8 fut découverte et caractérisée dans notre laboratoire. Cette protéine est surexprimée dans l'adénocarcinome pancréatique et possède un rôle dans la progression tumorale. Pendant ce travail de thèse, nous nous sommes focalisé sur le rôle de p8 dans les phases initiales de la tumorigénèse pancréatique et sur ses mécanismes d'action, impliqués dans la progression tumorale. Nous avons montré que p8 joue un rôle essentiel dans l'apparition des lésions PanINs suite à l'activation de l'oncogène Kras. Au niveau cellulaire, nous avons montré que la protéine p8 protège les cellules tumorales pancréatiques contre le stress de la privation en nutriments via la régulation de l'expression de RelB et IER3. La voie p8, RelB et IER3 est impliquée dans l'inhibition de l'apoptose suite au stress. De plus, nous avons observé que ces trois protéines sont co-exprimées dans les adénocarcinomes humains et leur expression corrèle avec l'évolution de la maladie. Dans un second lieu, nous avons démontré le rôle essentiel de la protéine p8 dans la résistance des cellules tumorales pancréatiques à l'hypoxie et à la privation en glucose. Nous avons identifié la voie p8/Aurora KinaseA, qui en réponse au stress métabolique, réduit l'apparition des dommages à l'ADN en contrôlant l'expression des gènes liés au cycle cellulaire et à la réparation de l'ADN. De plus, nos recherches ont montré que p8 protège les cellules tumorales du stress métabolique en inhibant la mort cellulaire dépendante de l'autophagie. Nous espérons que nos résultats aideront à mieux cibler les cellules tumorales pancréatiques et leur caractère résistant au stress micro-environnemental extrême. / The stress protein p8 was discovered and characterized in our laboratory. Over expressed in pancreatic adenocarcinoma, p8 is involved in tumor progression. During my PhD studies, we focused on the role of p8 in pancreatic cancer development and on its mechanisms of action. First, we demonstrated that p8 is essential for PanIN development following Kras oncogene activation. At the cellular level, we found that p8 protects pancreatic cancer cells upon nutrient starvation stress through the regulation of RelB and IER3 expression. p8, RelB and IER3-dependent cascade inhibits apoptosis after the starvation stress. Furthermore, we showed that these tree proteins are co expressed in human pancreatic adenocarcinoma. One the other hand, our study showed that p8 is involved in pancreatic cancer cells resistance to hypoxia and glucose starvation. We identified a p8/Aurora KinaseA pathway which, in response to such metabolic stress, reduces DNA damage by regulating cell cycle and DNA repair genes expression. Moreover, our studies demonstrated that p8/AURKA path protects cancer cells against metabolic stress by inhibiting autophagy-associated cell death. We expect that our data will help to get new therapeutics against pancreatic cancer.

Les récentes avancées dans notre compréhension de la tumorigenèse pancréatique ont montré que la présence d'un compartiment cellulaire non tumoral : le « stroma » ou « microenvironnement intra-tumoral », avait une incidence directe sur la progression de la maladie. Le but de ce travail était de déterminer le rôle du stroma dans la progression de l'adénocarcinome pancréatique. Pour cela, nous avons étudié le profil d'expression génique spécifique du stroma. Ceci nous a permis de mettre en évidence des gènes impliqués dans la régulation du système nerveux, dénommés « facteurs neurogéniques », pouvant être reliés aux phénomènes de remodelage neural observés dans les adénocarcinomes pancréatiques. Ceux-ci sont associés aux douleurs caractéristiques du cancer du pancréas, aux récidives locales, à l'extension locorégionale. Nous avons alors approfondi notre étude sur l'axe SLIT2/ROBO. Nos résultats montrent qu'au travers la sécrétion de Slit2, le stroma a un impact direct sur le remodelage neural. Ces données peuvent permettre d'ouvrir une nouvelle voie thérapeutique dans le cancer du pancréas, ayant pour but de cibler les conséquences du remodelage neural. / Recent progress in our understanding of pancreatic tumorigenesis had shed light on the non tumoral cell compartment of the tumor, so-called "stroma" or "intra-tumoral microenvironment", in the spread of the disease. The goal of our work was to decipher the role of stroma in the spread of this disease. We could analyze the specific gene expression profile of stroma, leading to the discovery of several genes plausibly linked to neural remodeling, called "neurogenic factors". This neural remodeling is clinically correlated with neuropathic pain and locoregional spread. We have next deepened our analysis on the axis SLIT2/ROBO. We could demonstrate that stromal compartment is able to impact on neural remodeling, through secretion of Slit2. These results provide rationale to investigate the disruption of stromal/neural compartment connexion with Slit2/ROBO inhibitors for treatment of pancreatic cancer reccurrence and pain.

Le pronostic est depuis longtemps un concept de base de la médecine. Hippocrate envisageait déjà le pronostic des maladies par l’étude des circonstances passées, l’établissement des faits présents, et enfin la prédiction des phénomènes à venir. Pour lui, tout l’art du pronostic était de savoir interpréter intelligemment ces informations, et ainsi moduler le pronostic en fonction de leur valeur relative. Une recherche à visée pronostique consiste toujours actuellement en l’examen des relations entre un état de santé connu au moment de l’investigation et un évènement futur. L’augmentation de l’espérance de vie implique que de plus en plus de personnes vivent avec une ou plusieurs maladies ou problèmes altérant leur santé. Dans ce contexte, l’étude du pronostic n’a jamais été aussi importante. Cependant, contrairement au domaine des essais cliniques randomisés dans lequel les recommandations CONSORT sont appliquées depuis plus de 20 ans et garantissent une recherche de qualité, la recherche pronostique commence seulement à se doter d’initiatives similaires. En effet, des recommandations TRIPOD ont été élaborées en 2015 et un groupe de travail, PROGRESS, s’est constitué en 2013 au Royaume-Uni et a fait le constat que les recherches a visée pronostique sont réalisées de façon très hétérogènes et malheureusement ne respectent pas toujours des standards de qualité nécessaires pour supporter leurs conclusions et garantir la reproductibilité des résultats (...) / Prognosis is historically a basic concept of medicine. Hippocrates already considered the prognosis of disease as the study of the past circumstances, the establishment of the present state of health and finally the prediction of future events. He presented the prognosis as the ability to interpret these elements and to adapt the prognosis regarding their relative values. Currently, the prognostic research is still based on the examination of the relationship between a well-established health condition at the time of the investigation and the occurrence of an event. The increase in life expectancy implies that more and more people are living with one or more diseases or with problems that can impair their health status. In this context, the study of the prognosis has never been more important. However, in comparison with the field of randomized clinical trials in which the CONSORT statement recommendations are implemented for more than 20 years in order to guarantee quality research, the prognostic research only begins to develop similar initiatives. Indeed, in 2015 the TRIPOD statement recommendations were provided and in 2013 a working group called PROGRESS was constituted in the United Kingdom and its members made the observation that prognostic researches are developed with considerable heterogeneity in the methodology used and unfortunately do not always meet the quality standards required to support their conclusions and their reproducibility (...)