TP53INP1 est un gène suppresseur de tumeur qui est inactivé dans les lésions pré-tumorales pancréatiques. Il est impliqué dans la régulation de la mort cellulaire notamment via l'activation de la voie p53. Cette thèse a pour objectif de mieux caractériser le mécanisme d'action de TP53INP1 afin de mieux comprendre son rôle suppresseur de tumeur dans le cancer pancréatique. Nous avons montré dans un premier temps que TP53INP1 est associé à une diminution de la migration cellulaire via l'inhibition de l'expression du gène SPARC. Dans un second temps, nous avons montré que la protéine TP53INP1 est impliquée dans l'autophagie, où elle interagit avec les protéines de la famille LC3/Atg8 au sein des autophagosomes, et favorise la mort cellulaire de manière dépendante de l'autophagie. Enfin, nous avons mis en évidence que TP53INP1 est régulée par le contexte de stress cellulaire via des modifications post-traductionnelles. En effet, nous avons montré que la SUMOylation de TP53INP1 est nécessaire à l'activation de la réponse au stress oxydatif de p53. Ces travaux ont donc permis de mieux caractériser le rôle de suppresseur de tumeur de TP53INP1 et son mécanisme de régulation. / TP53INP1 is a tumor suppressor gene which is inactivated in early pancreatic lesions. It is involved in regulation of cell death through the activation of the p53 pathway. The aim of this work is to better characterize the molecular mechanism of action of TP53INP1 in order to better understand its tumor suppressor role. Firstly, we have shown that TP53INP1 expression is associated with a decreased cell migration through the down-regulation of SPARC. Secondly, we have demonstrated that TP53INP1 is involved in autophagy, through its direct interaction with LC3/Atg8 family proteins into the autophagosomes, and induces autophagy-dependent cell death. Then, we have shown that TP53INP1 is regulated by cellular context, through its post-translational modifications. Indeed, the SUMOylation of TP53INP1 is required to activate the p53 oxidative stress response pathway. All these findings allow a better understanding of the tumor suppressor role of TP53INP1 and of its regulation mechanism.

Le cancer de la prostate (CaP) est actuellement le cancer le plus fréquent en France et constitue l'une des principales causes de décès par cancer chez l'homme dans les pays industrialisés. Un tiers des patients avec un CaP à priori localisé auront déjà des micro-métastases au moment du traitement local. Ces patients qui répondent dans un premier temps à la castration (hormonothérapie) seront cependant en échappement hormonal dans les 2 ans qui suivent. Récemment, plusieurs essais cliniques de phase III ont rapporté un gain de survie avec la chimiothérapie à base de docétaxel dans les CaPs métastatiques résistants à la castration. Néanmoins, la survie n'est prolongée que de 2 ou 3 mois et de nouvelles approches thérapeutiques ciblant des voies de signalisation spécifiques sont donc nécessaires. Les travaux réalisés au cours de cette Thèse ont permis tout d'abord de montrer, grâce à l'utilisation de TMAs, que la surexpression de TP53INP1, une protéine de réponse au stress, était un facteur de mauvais pronostic dans le CaP, prédictif notamment du risque de rechute biologique. Nous avons ensuite pu montrer grâce à des xénogreffes de cellules tumorales (LNCaP) que les taux d'ARNm de TP53INP1 diminuaient durant l'hormonothérapie et que TP53INP1 était de nouveau significativement surexprimée dans les tumeurs résistantes à la castration. Nous avons développé et déposé un brevet pour un oligonucléotide antisens (ASO) inhibant TP53INP1. Le traitement in vitro des lignées cellulaires hormonosensibles LNcaP et hormono-résistantes C4-2 par l'ASO induit une diminution d'expression de la protéine TP53INP1, inhibe la prolifération cellulaire et induit une augmentation de l'apoptose. / Prostate cancer (PC) is the most common malignancy in France and one of the most frequent leading causes of cancer-related death in men in industrialized countries. Even with aggressive screening, approximately one-third of patients believed to have localized PC will already have micro-metastatic disease at the time of definitive local therapy. These patients initially respond to androgen ablative therapy, but with time, their tumors ultimately become unresponsive and recur within 2 years as castration-resistant prostate cancer (CRPC). Recently, docetaxel-based regimens have shown improved survival in men with CRPC in phase III studies. However, the median overall survival was prolonged for only 2-3 months, and thus development of new therapeutic approaches that target relevant signaling pathways are essential to restore the androgen-sensitivity of CRPC. We showed, using tissue micro-array (TMA) analysis, that over-expression of Tumor Protein 53-Induced Nuclear Protein 1 (TP53INP1), a cell stress response protein, is a worse prognostic factor in PC, particularly predictive of biological cancer relapse. We also we found that TP53INP1 protein expression decreases during castration therapy (CT) and significantly increases in human CRPC. TP53INP1 mRNA was also significantly increased in castration-resistant (CR) tumors of LNCaP xenograft compared to the castration-sensitive (CS) taken before CT. We developed and world-wide patented one antisense oligonucleotide (ASO) targeting TP53INP1 (PCT/IB2011/054555). Treatment of LNCaP and C4-2 cells in vitro with TP53INP1 ASO downregulates TP53INP1 protein level, inhibits proliferation and induces apoptosis.

Notre laboratoire a caractérisé TP53INP1 comme un gène clé de réponse au stress cellulaire. Cible de p53, TP53INP1 est ubiquitairement exprimé et fortement induit lors de différents stress in vivo et in vitro. Sa surexpression ectopique induit un arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire. Nous avons montré que l’expression de TP53INP1 est perdue dans plusieurs cancers chez l’homme et que sa réexpression dans les cellules cancéreuses inhibe la croissance tumorale. De plus, les souris TP53INP1-déficientes sont très susceptibles au développement de tumeurs induites et présentent un stress oxydatif permanent caractérisé par une augmentation du taux de ROS. L’ensemble de ces résultats indique que TP53INP1 possède une fonction suppressive de tumeur probablement en lien avec son implication dans la régulation du statut redox cellulaire. Le but de mon travail de thèse est de décrypter cette fonction an niveau cellulaire et moléculaire en exploitant le modèle des souris déficientes. Mes travaux montrent que l’absence de TP53INP1 affecte tous les processus biologiques dérégulés lors de la tumorigenèse. En effet, la perte de TP53INP1 se caractérise par une augmentation de la prolifération cellulaire, de la migration cellulaire, de l’angiogenèse et de l’instabilité génétique. De façon paradoxale, les cellules déficientes pour TP53INP1 présentent une sensibilité accrue à l’apoptose induite par un stress indépendant ou non de p53. Cette sensibilité se base probablement sur un fort défaut de l’autophagie dans ces cellules. Nous observons également une diminution du taux des petites molécules antioxydantes liée au stress oxydatif constitutif observé dans ces souris. Les défauts observés en absence de TP53INP1 sont corrigés par un traitement avec un antioxydant, le N-Acetylcystéine, ce qui démontre le lien entre le rôle suppresseur de tumeur de TP53INP1 et son implication dans le contrôle du stress oxydatif. Ce travail a permis de mieux comprendre le rôle antioxydant TP53INP1 en lien avec sa fonction de suppresseur de tumeur. / Our laboratory has characterized TP53INP1 as a key gene in cell stress response. Target of p53, TP53INP1 is ubiquitously expressed and strongly induced during various stress-inducing treatments in vivo and in vitro. Its ectopic overexpression induces cell cycle arrest and cell death. We have shown that the expression of TP53INP1 is lost in many human cancers and that its re-expression in cancer cells inhibits tumor growth. In addition, TP53INP1-deficient mice are highly susceptible to induced tumors and show a permanent oxidative stress characterized by increased ROS levels. Taken together, these results indicate that TP53INP1 has a tumor suppressor function likely related to its involvement in the regulation of cellular redox status. The purpose of my PhD is to decipher the cellular and molecular function of TP53INP1 by exploiting the model of deficient mice. My work shows that the absence of TP53INP1 affects all biological processes deregulated in tumorigenesis. Indeed, the loss of TP53INP1 is characterized by an increase in cell proliferation, cell migration, angiogenesis and genetic instability. Paradoxically, TP53INP1-deficient cells have increased susceptibility to stress-induced apoptosis, independently or not of p53. This sensitivity is probably based on a strong impairment of autophagy in these cells. We also observed a decrease in the rate of small antioxidant molecules related to constitutive oxidative stress in these mice. The defects observed in the absence of TP53INP1 are corrected by treatment with an antioxidant, N-acetylcysteine, demonstrating the link between the role of TP53INP1 in tumor suppression and its involvement in redox control. This work has led to a better understanding of the antioxidant role of TP53INP1 linked to its function as a tumor suppressor.

TP53INP1 est un gène cible de p53 qui code une protéine à activité suppressive de tumeur. En son absence, on observe la dérégulation de nombreux phénomènes cellulaires impliqués dans le processus tumoral, comme la mort cellulaire, la prolifération, la migration ou encore l’instabilité génétique. Certains d’entre eux sont modulés par le stress oxydatif chronique qui existe dans les cellules et organes déficients pour TP53INP1. Cette thèse a pour objectif de mieux caractériser le mécanisme d’action de TP53INP1, afin de mieux comprendre son rôle suppresseur de tumeur en lien avec la régulation du métabolisme oxydatif. Nous avons montré dans un premier temps que TP53INP1 est impliquée dans l’autophagie, où elle interagit avec les protéines de la famille LC3/Atg8 au sein des autophagosomes, et favorise la mort cellulaire de manière dépendante de l’autophagie. Puis nous avons déterminé que c’est un défaut du processus mitophagique qui est à l’origine du stress oxydatif chronique constaté en absence de TP53INP1. Ce niveau de ROS élevé induit une dérégulation du métabolisme des lipides, observée in vitro dans les cellules déficientes pour TP53INP1 (accumulation de gouttelettes lipidiques), et retrouvée in vivo dans les souris TP53INP1 KO (prédisposition à l’obésité et au phénomène de résistance à l’insuline). C’est une levée du blocage de l’expression du gène Pparg régulant la lipo- et l’adipo-genèse et une inhibition du processus de lipolyse qui expliquerait notre phénotype. Ces travaux ont donc permis de mieux caractériser le rôle suppresseur de tumeur de TP53INP1 et son mécanisme de régulation. / TP53INP1 is a p53 target gene coding a protein with a tumor suppressor activity. In absence of TP53INP1, we observe deregulation of different cellular phenomena implicated in tumoral progression, such as cell death, proliferation, migration or even genetic instability. Some of them are modulated by chronic oxidative stress existing in TP53INP1-deficient cells or organs. The aim of this work is to better characterize the molecular mechanism of action of TP53INP1 in order to better understand its tumor suppressor role related to regulation of oxidative metabolism. Firstly, we demonstrated that TP53INP1 is involved in autophagy, through its direct interaction with LC3/Atg8 family proteins within autophagosomes, and induces autophagy-dependent cell death. Then we evidenced that a defect in mitophagic process is at the origin of chronic oxidative stress noticed in absence of TP53INP1. This elevated ROS level induces lipid metabolism deregulation, observed in vitro in TP53INP1-deficient cells (lipid droplets accumulation), and mirrored in vivo in TP53INP1 KO mice (predisposition to obesity and to insulin resistance phenomenon). A derepression of Pparg gene expression, which regulates lipo- and adipo-genesis, and inhibition of lipolysis process would explain our phenotype. Altogether these findings allow a better understanding of the tumor suppressive function and regulation mechanisms of TP53INP1.

Les CSH sont responsables de la production de toutes les cellules sanguines et possèdent une double capacité d'auto-renouvellement et de différenciation en progéniteurs incluant les progéniteurs lymphoïdes B. Étant donné l’importance des CSH, leur physiologie est étroitement contrôlée par une pléthore de signaux qui équilibrent quiescence, prolifération, auto-renouvellement et différenciation. La diminution de la fonction des CSH au cours du vieillissement dépend de plusieurs facteurs intrinsèques et extrinsèques, y compris l’accumulation des ROS au cours du vieillissement. Lorsque les taux de ROS intracellulaires deviennent excessifs, ils provoquent une sénescence ou une apoptose, entraînant un épuisement prématuré des CSH et un dysfonctionnement hématopoïétique. La régulation et les effets des ROS sont donc liés au destin des CSH. Notre laboratoire a dévoilé l'activité antioxydante de la protéine TP53INP1. En effet, les souris KO développent un stress oxydatif chronique. Le gène codant pour TP53INP1 est exprimé au niveau basal dans tous les types de cellules de la MO et est fortement surexprimé lorsque la moelle osseuse lors du vieillissement. L'analyse des compartiments cellulaires de la MO a montré que l'absence de TP53INP1 a un impact important sur la différenciation des cellules B, qui est étonnamment maintenue dans la moelle osseuse des souris KO âgées, et réduite chez les souris WT âgées. Ces cellules B produisent IgM et IgG et sont fonctionnelles. Le traitement antioxydant inverse le phénotype observé. Enfin, nous démontrons que la maintenance des lymphocytes B chez les souris KO âgées est dépendant de la voie de signalisation IL-7Rα / pSTAT5. / HSCs are responsible for the production of all blood cells and possess the dual ability to self-renew and differentiate into progenitor including precursors of B cells which complete their differentiation in the spleen. Given their importance, their physiology is tightly controlled by a plethora of signals that balance quiescence, proliferation, self-renewal and differentiation. The decreased repopulation and differentiation capacity of HSC during aging is believed to depend on several intrinsic and extrinsic factors, including aging-associated accumulation of ROS. At physiological level, ROS can regulate various cellular functions, including HSCs and lineage precursors proliferation, differentiation and mobilization. However, when intracellular ROS levels become excessive, they cause senescence or apoptosis, resulting in a premature exhaustion of HSCs and hematopoietic dysfunction. In this condition many signaling molecules are activated. Our laboratory has previously unveiled TP53INP1; indeed, TP53INP1- KO mice develop a chronic oxidative stress. The gene encoding TP53INP1 is expressed at basal level in all BM cell types, and strongly over-expressed when the BM upon aging. Analysis of BM cell compartments showed that the absence of TP53INP1 strongly impacts on B cell differentiation, which is surprisingly maintained in old KO BM while reduced in old WT. As shown by immunization assays, these B cells produce IgM and IgG showing that they are functional. Antioxidant treatment that scavenges ROS reverses the phenotype observed in old KO BM. Finally, we demonstrate that the B cell maintenance observed in KO old BM is due to an enhanced IL-7Rα/ pSTAT5 signaling pathways.