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La physiopathologie artérielle comprend différentes pathologies telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hyperplasie intimale qui sont caractérisées par un remodelage artériel en réponse à différents stress environnementaux. Mon travail de thèse s'est intéressé à décrire les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu en réponse à un stress artériel dans des modèles murins et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention des dommages artériels. Ainsi, nous nous sommes intéressés au rôle d'une isoforme particulière de la famille des phosphoinositide 3-kinase, la PI3Ky. Cette protéine est largement exprimée dans le compartiment hématopoïétique, où son activité catalytique intervient dans l'inflammation de la paroi artérielle, mais elle est également présente à de plus faible niveau dans les CML et les CE. Associée à son rôle catalytique largement impliqué dans la migration et la libération de facteurs inflammatoires, la PI3Ky a été décrite comme ayant des fonctions non-catalytiques, dite " d'ancrage ", activant des phosphodiestérases (PDE). Ainsi, en utilisant deux modèles murins génétiquement modifiés pour la PI3Ky, l'un délété pour la PI3Ky (PI3KyKO pour knockout) et l'autre exprimant une forme inactive de la PI3Ky (PI3KyKD pour kinase dead) nous avons pu évaluer le rôle des 2 fonctions dans des modèles murins de lésions artérielle. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle non-catalytique de la PI3Ky dans les CML. A partir d'un modèle murin de remodelage artériel induit par un stress hypertenseur nous avons observé que l'hyperplasie médiale des CML est dépendante de la PI3Ky, mais indépendante de son activité catalytique. In vitro à partir de cultures primaires de CML de souris nous avons démontré que la PI3Ky régule l'activité des PDE indépendamment de son activité, limitant les taux intracellulaires d'AMPc qui est un puissant frein de la prolifération des CML. Ces modèles nous ont aussi permis de tester une stratégie thérapeutique originale utilisant un peptide perméant inhibant l'interaction PI3Ky/PDE. Ce peptide est capable de prévenir à la fois la prolifération des CML in vitro mais aussi l'hyperplasie médiale in vivo. Dans un deuxième temps, nous avons étudié comment l'activité PI3Ky inflammatoire, inhibe la cicatrisation endothéliale suite à une lésion endovasculaire. A l'aide de différents modèles in vivo et ex vivo de réendothélialisation chez la souris, nous avons pu observer que suite à une lésion vasculaire l'activité de PI3Ky des lymphocytes T induit la sécrétion d'IFNy, entrainant une production locale de CXCL10 par les CML. Cette chimiokine va directement inhiber la cicatrisation endothéliale, indépendamment du compartiment immun. Ces travaux ont permis d'une part de démontrer que l'inhibition de la PI3Ky représentait une stratégie thérapeutique envisageable dans les complications de l'angioplastie mais ont également permis de montrer les mécanismes d'interactions cellulaires complexes mis en jeu lors d'une agression artérielle. Ils ont notamment permis de démontrer un rôle central de la CML agissant comme un relai entre l'inflammation adventitielle et l'endothélium. L'ensemble de ces données a pu mettre en avant une double fonction de la PI3Ky dans les processus de réponse à un stress inflammatoire ou hémodynamique. D'une part, son rôle pro-inflammatoire contrôlé par son activité catalytique, responsable d'une inhibition de la cicatrisation endothéliale via l'activation des CML. D'autre part, son rôle non-catalytique dans les CML, modulant leur prolifération via la signalisation de l'AMPc. Ces travaux permettent d'envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques visant d'une part à inhiber son activité en utilisant des inhibiteurs hautement spécifiques pour cette isoforme et d'autre part des peptides capables de bloquer le rôle non catalytique de la PI3Ky. / Cardiovascular diseases represent the first cause of death worldwide and a large part of them concerns different arterial disorders as hypertension, atherosclerosis, intimal hyperplasia and aneurism. All of these diseases are characterized by arterial remodeling resulting in a complex collaboration between environment and arterial physiology participants: Blood flow, endothelial cells (EC), smooth muscle cells (SMC) and arterial inflammation. In this context, this thesis project is interested in y-isoform of phosphoinositide 3-kinase (PI3Ky). PI3Ky is largely expressed in hematopoietic compartment where its catalytic activity drives arterial wall inflammation, but it is also lower expressed in cardiovascular system such as SMC and EC. Moreover, in addition to catalytic function implicated in chemoattraction and release of inflammatory mediators, PI3Ky has been described to activate phosphodiesterases (PDE) activity, through a non-catalytic "docking" function. At first, this work studied studied non-catalytic docking function of PI3Ky in SMC. Using hypertension-induced arterial remodeling in mice showed that SMC hyperplasia was dependent of PI3Ky protein expression but independent of its activity. Further, in vitro exploration with primary-SMC from mice aorta highlighted that PI3Ky activates PDE independently of its catalytic function, which promotes SMC proliferation by hydrolysis of an anti-mitotic second messenger: the cyclic-AMP. In the same approach, we tested original therapeutic strategy using a permeant-peptide which inhibits PI3Ky/PDE interaction. This permeant-peptide showed good efficiency to prevent both in vitro SMC proliferation and in vivo arterial SMC hyperplasia. The second part of this work how PI3Ky activity in inflammatory cells modulates endothelial healing following endovascular injury. Using in vivo and ex vivo models of arterial de-endothelialization in mouse, we observed a cellular cross talk in arterial wall between T-cells, SMC and EC. PI3Ky activity in T-cells promotes IFNy secretion following arterial injury which indirectly decreases re-endothelialization through a local secretion of CXCL10 by SMC. Indeed, CXCL10 directly inhibits endothelial healing independently of immune compartment. Our findings provide a new promising target to promote endothelial repair and therefore prevent cardiovascular events following endovascular intervention.Altogether, these works unravel an interesting dual function of PI3Ky in arterial stress response. In one hand, catalytic function of PI3Ky drives inflammatory-induced inhibition of endothelial healing, and in other hand, non-catalytic function controls SMC proliferation via inhibition of cyclic-AMP pathway.

Depuis près de 20 ans, l’ingénierie vasculaire est en plein essor, tentant d’apporter des solutions durables dans le traitement de pathologies cardio-vasculaires dont l’incidence est croissante. Utilisés pour le remplacement ou le pontage de vaisseaux obstrués voire lésés, les substituts vasculaires de petit calibre présentent encore des limites importantes, induisant, à plus ou moins court terme, le développement d’hyperplasie intimale ou de thrombose. Les multiples exemples de substituts vasculaires issus de l’ingénierie tissulaire décrits dans la littérature témoignent des difficultés rencontrées pour obtenir une prothèse qui réunirait à la fois des propriétés mécaniques adaptées au site d’implantation et des propriétés biologiques optimales pour assurer la fonction vasculaire. C’est dans cette problématique que se situe cette étude dont l’objectif est de définir la composante matricielle et la composante cellulaire idéales pour un substitut vasculaire de petit calibre. Pour cela, nous nous sommes intéressés aux hydrogels physiques de chitosane, dont les propriétés d’hémocompatibilité et de biorésorption sont reconnues. La composition physico- chimique adéquate d’un point de vue biologique et mécanique a été déterminée afin d’élaborer des tubes qui ont été par la suite endothélialisés. Par ailleurs, le mécanisme d’alignement cellulaire en réponse à un flux laminaire de type artériel, a été particulièrement étudié car il constitue un phénomène d’adaptation des CEs aux contraintes mécaniques perçues in vivo par l’endothélium. Cette caractérisation a permis de mettre en évidence le rôle essentiel d’IQGAP1 dans ce processus et d’initier une seconde étude visant la compréhension du mécanisme d’adhésion des CEs sur le chitosane. Finalement, en alliant recherche fondamentale et recherche appliquée nous avons élaboré un substitut vasculaire cellularisable in vitro et implantable in vivo. / Abstract

La maladie rénale chronique (MRC) par ses conséquences organiques et psychologiques représente unenjeu majeur de santé publique. Sa physiopathologie reste mal connue, mais il est établi que toute atteinte rénale,quelle qu’en soit la cause, aboutit à une réduction du nombre de néphrons fonctionnels. Cette réductionnéphronique est responsable de processus adaptatifs complexes des néphrons sains restants pour maintenir unefonction rénale satisfaisante. Si la perte néphronique est suffisamment importante, le parenchyme rénal vas’altérer progressivement aboutissant au remplacement des néphrons sains par un tissu fibreux puis au déclin dela fonction rénale. Les mécanismes moléculaires impliqués, tant dans l’adaptation à la réduction néphronique,que dans la dégradation progressive du parenchyme rénal sont mal connus et les possibilités d’interventionsthérapeutiques limitées.La voie AKT/mTOR est une voie de signalisation intracellulaire ubiquitaire, très conservée, jouant unrôle central dans l’homéostasie cellulaire par sa fonction de régulation de la croissance, de l’apoptose et du cyclecellulaire. L’extraordinaire complexité de son mode de recrutement témoigne du rôle de carrefour de cette voie.Elle intègre des signaux multiples et très variés (facteurs de croissance, acides-aminés, niveau énergétiquecellulaire, disponibilité de l’oxygène) modulant l’anabolisme cellulaire. Notre compréhension du rôle de cettevoie dans la progression de la MRC est encore très limitée et les données sont peu nombreuses et controversées.Mon travail de thèse a consisté à évaluer, en utilisant un modèle expérimental de réduction néphroniquechez la souris, le rôle de la voie AKT/mTORC au cours de la progression des MRC.Nous résultats démontrent que AKT, et plus précisément AKT2, est une molécule essentielle àl’adaptation podocytaire aux contraintes imposées par la réduction néphronique. En appliquant plusieursmodèles de réduction néphronique à des souris génétiquement modifiées, nous avons pu établir la fonctioncruciale de cette isoforme. En effet, l’inactivation d’Akt2, soit systémique soit conditionnelle dans le podocyte,est responsable d’une hyporéactivité de la voie AKT podocytaire, d’un remodelage du cytosquelette, d’uneaugmentation de l’apoptose glomérulaire avec raréfaction podocytaire et de lésions de glomérulosclérose.Transposant nos données à la pathologie humaine, nous avons mis en évidence une activation podocytaired’AKT2 après transplantation rénale chez les patients présentant une altération importante de la fonction rénale.De façon marquante, la survenue d’une protéinurie en réponse à un traitement par sirolimus s’associait à uneperte de cette activation et à une augmentation de l’apoptose glomérulaire.Parallèlement, nous avons évalué le rôle de cette voie chez l’homme au cours d’une MRC trèsparticulière secondaire à la présence d’anticorps antiphospholipides. Cette néphropathie est caractérisée par laprésence de lésions vasculaires sévères prolifératives, hypertrophiques et progressivement obstructivesaboutissant à la destruction du parenchyme rénal. Jusqu'à maintenant, aucun lien formel n’avait été établi entre laprésence de ces anticorps et le développement des lésions vasculaires, et aucune thérapeutique n’était disponible.Nos résultats indiquent que ces anticorps sont directement pathogènes pour l’endothélium induisant l’activationde la voie AKT/mTORC. L’activation de cette voie stimule la prolifération des cellules endothéliales mais aussi .... / Pas de résumé en anglais

L’identification fréquente de mutations des protéines régulatrices du complément suggère que les lésions endothéliales du syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa) résultent d’une activation incontrôlée de la voie alterne du complément. Les mutations, en soi, ne constituent cependant que des facteurs de susceptibilité et les mécanismes menant de l’anomalie de régulation du complément au développement de lésions de microangiopathie thrombotique rénale restent mal compris. L’objectif de ce projet était donc d'étudier certains mécanismes de l’activation du complément à la surface des cellules endothéliales dans le SHUa et les conséquences de cette activation pour l’endothélium. Dans ce but, ce travail s’est initialement concentré sur la mutation C3R139W, dont nous avons réalisé la caractérisation phénotypique et fonctionnelle et qui a constitué un modèle d’étude des conséquences d’un complément dérégulé sur l’endothélium. Cette mutation a été identifiée de façon sporadique chez 4% des patients de la cohorte française de SHUa. Son étude phénotypique a mis en avant une évolution fonctionnelle rénale souvent sévère mais inhomogène ainsi qu’une fréquence non négligeable d’événements cardio-vasculaires. Sa caractérisation fonctionnelle a révélé une augmentation de son affinité pour le facteur B, à l’origine de la formation d’une « hyper C3 convertase », échappant également en partie aux systèmes de contrôle (diminution de liaison avec la MCP). L’étude de ses conséquences endothéliales a montré, à la surface de cellules pré-activées, une augmentation des produits d’activation du complément et de l’expression membranaire de facteur tissulaire, faisant le lien avec l’acquisition d’un phénotype endothélial prothrombotique. Nous rapportons également, sous l’effet de sérum porteur de cette mutation, une majoration de la perméabilité et du détachement cellulaire, susceptibles de traduire une souffrance endothéliale. Dans la deuxième partie et en vue de préciser les liens entre anomalie du complément et activation des cellules endothéliales, nous nous sommes intéressés au rôle de l’hémolyse, dénominateur commun des SHU. Nous avons ainsi montré que l’hème libre activait la voie alterne du complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales et ce, de façon exacerbé, en cas de dysrégulation sous-jacente du complément. Nous avons identifié plusieurs mécanismes d’action par lesquels l’hème peut activer le complément : il favorise les interactions C3/C3 et ainsi la formation d’une hyper C3/C5 convertase, déclenche une mobilisation des corps de Weibel-Palade à l’origine de l’expression membranaire de P-selectine, qui est capable d’activer la voie alterne du complément et induit une diminution de l’expression membranaire des régulateurs MCP et DAF. Par ces travaux, nous avons précisé les liens entre activation du complément et acquisition d’un phénotype endothélial prothrombotique dans le SHUa. Nous avons notamment identifié l’hémolyse comme un acteur potentiel de l’amplification des lésions endothéliales complément-dépendantes. Son contrôle pourrait ainsi constituer une nouvelle voie thérapeutique dans le SHU. / Pas de résumé en anglais

Les microvésicules (MVs) sont des petites vésicules membranaires libérées par les cellules, ayant des effets bénéfiques et/ou délétères dans le sepsis. Nous avons déjà démontré que la délétion de l’isoforme non musculaire de la kinase de la chaîne légère de la myosine (MLCKnm) protège les souris contre le choc endotoxique en réduisant l'inflammation. Ici, nous avons évalué les conséquences de la délétion de MLCKnm sur le phénotype et les effets inflammatoires des MVs au cours du choc endotoxique. La délétion de MLCKnm augmente le taux circulant des MVs et ceux dérivées des cellules progénitrices. Les souris MLCKnm-/- présentent une augmentation du nombre des plaquettes, mais leurs capacité à libérer les MVs est réduite et une diminution du nombre des leucocytes et des MVs leucocytaires. Une diminution du relâchement de l’aorte a été observé chez les souris injectées avec des MVs dérivées des souris MLCKnm+/+ (MVsMLCKnm+/+), mais pas les MVs dérivées des souris MLCKnm-/- (MVsMLCKnm-/-). En présence de lipopolysaccharide (LPS), MVsMLCKnm+/+ augmentent la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires par les cellules endothéliales de l’aorte de souris alors que les MVsMLCKnm-/- induisent la libération des cytokines anti-inflammatoires. L’injection des MVsMLCKnm-/-, prévient partiellement l'augmentation du stress oxydatif, nitrosatif, et la dysfonction endothéliale induites au niveau des souris par le LPS. Ces résultats montrent que MLCKnm joue un rôle important dans l'activation cellulaire, la libération des MVs, ainsi que le nombre des cellules circulantes. La délétion de MLCKnm permet de générer des MVs circulantes moins inflammatoires avec un potentiel protecteur. / Microvesicles (MVs), small membrane vesicles released from cells, have beneficial and/or deleterious effects in sepsis. We previously reported that non-muscle myosin light chain kinase (nmMLCK) deletion protects mice against endotoxic shock by reducing inflammation. Here, we evaluated the consequences of nmMLCK deletion on the phenotype and inflammatory effects of cell-derived MVs during endotoxic shock. nmMLCK deletion increased circulating levels of MVs. In nmMLCK-/- mice, platelet count was increased but the platelet ability to release MVs was reduced, and both leukocyte-derived MVs and leukocyte count were reduced. Endothelium-dependent relaxation of aorta was reduced in mice injected with MVs from nmMLCK+/+ (MVsnmMLCK+/+) but not from nmMLCK-/- mice (MVsnmMLCK-/-). In presence of lipopolysaccharide, MVsnmMLCK+/+ increased pro-inflammatory cytokine release by mouse aortic endothelial cells whereas MVsnmMLCK-/- enhanced anti-inflammatory secretome. Injection of MVsnmMLCK-/-, but not MVsnmMLCK+/+, prevented the increase of oxidative and nitrative stresses and reduced endothelial dysfunction in aorta from lipopolysaccharide-treated mice. Altogether, nmMLCK plays an important role in cellular activation and release of circulating MVs. Moreover, nmMLCK deletion generates MVs with low inflammatory properties and high protective effects.

Cette recherche visait à étudier les interactions cellules-cellules qui interviennent entre les cellules du PRP, les cellules endothéliales et les ostéoblastes dans un modèle de co-culture in vitro. Ainsi, des quantités de PRP ou de surnageants de PRP, activés par l'ajout de TRAP-6 ou non, ont été ajoutées à des cellules endothéliales ou des ostéoblastes, séparés par une membrane semi-perméable et la prolifération cellulaire mesurée par une méthode colorimétrique. Les résultats obtenus montrent que les surnageants de PRP et les PRP sont mitogéniques pour les cellules endothéliales et pour les ostéoblastes en mono-culture. Cependant, l'effet mitogénique en co-culture n'est observé qu'en présence de surnageant de PRP et ce, uniquement sur la croissance des cellules endothéliales, suggérant un mode de régulation de la division cellulaire distinct de ces deux lignées cellulaires.

La migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF est une étape cruciale du processus angiogénique. La liaison du VEGF sur son récepteur, le VEGFR2, conduit à l’autophosphorylation sur la tyrosine 1214 de ce dernier ce qui induit l’activation de la voie p38 MAP-kinase, le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration cellulaire. Les microARNs sont de courts ARN non-codant qui régulent de façon post-transcriptionnelle l’expression des gènes. Nous avons identifié deux microARNs, miR-20a et miR-196a, dont les niveaux d’expression sont respectivement augmentés et diminués en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces deux microARNs modulent le remodelage du cytosquelette d’actine, la migration et l’angiogenèse. Aussi, nous avons décrit leurs implications dans la régulation de la voie p38. Tout d’abord, miR-20a agit en amont de p38, et réprime l’expression de MKK3 en se liant de façon spécifique à sa région 3’UTR. MKK3 étant un activateur direct de p38 en réponse au VEGF, la surexpression de miR-20a empêche l’activation de p38, de son substrat la MAPKAP kinase-2 et la phosphorylation subséquente de HSP27. En conséquence, miR-20a inhibe la formation des fibres de tension, la migration endothéliale et l’angiogenèse. Ces résultats nous ont permis de conclure que miR-20a agit dans une boucle de régulation négative afin de moduler la migration dépendante de la voie p38 activée par VEGF. Ensuite, le niveau d’expression de miR-196a est diminué en réponse au VEGF et nous avons démontré sa liaison spécifique à la région 3’UTR de l’ANXA1. En accord avec nos précédents travaux démontrant que l’ANXA1 est importante pour la migration endothéliale dépendante de l’activation de p38 par le VEGF, la surexpression de miR-196a empêche la formation des lamellipodes, réduit les capacités migratoires des cellules endothéliales et inhibe ainsi l’angiogenèse in vitro et in vivo. En conclusion, une réduction de l’expression de miR-196a agit en synergie avec le VEGF, pour faciliter la migration endothéliale, en maintenant un niveau d’expression élevé de l’ANXA1 pro-migratoire. Nos résultats, en impliquant miR-20a et miR-196a dans la modulation de l’angiogenèse, apportent des concepts nouveaux sur la régulation de la voie p38 pro-migratoire en réponse au VEGF. Ces travaux ouvrent des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à régulariser l’angiogenèse pathologique. / Endothelial cell migration in response to VEGF is a crucial step of angiogenesis. VEGF binding to its receptor VEGFR2 results in the autophosphorylation of the receptor at tyrosine 1214, which induces the downstream activation of the p38 MAP-kinase pathway leading to actin cytoskeleton remodeling and cell migration. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate post-transcriptionally gene expression. We identified two microRNAs, miR-20a and miR-196a, whose levels of expression were increased and decreased respectively in response to VEGF in endothelial cells. Both microRNAs modulate VEGF dependent-endothelial cell cytoskeleton remodeling, migration and angiogenesis. Also, we described that they are involved in regulating the p38 pathway. First, miR-20a acts upstream of p38, and negatively regulates MKK3 by specifically binding on MKK3 3’UTR. As MKK3 is a direct activator of p38 in response to VEGF, overexpression of miR-20a impairs p38 activation, the downstream activation of MAPKAPK2 and the phosphorylation of HSP27. Consequently, miR-20a reduces stress fibers formation, and subsequent endothelial cell migration and angiogenesis. We conclude that miR-20a may act in a feedback loop to regulate the p38 pathway-mediated VEGF-induced endothelial cell migration. Then, miR-196a is decreased in response to VEGF and we demonstrate its specific binding on ANXA1 3’UTR. In accordance with our previous work demonstrating that ANXA1 is important for VEGF-induced endothelial migration downstream of p38 pathway, overexpression of miR-196a impairs lamellipodia and endothelial cell migratory capacities upon VEGF treatment, leading to angiogenic defects. We conclude that miR-196a acts in a synergetic mechanism with VEGF to facilitate endothelial cell migration, by maintaining high level of the pro-migratory protein ANXA1. Finally, our results implicate miR-20a and miR-196a in the angiogenic process and give new insights in p38 pathway-dependent endothelial cell migration regulation in response to VEGF. The present work opens new avenues for strategies and future development of therapeutics in line with the treatment of angiogenic pathologies.

Les médicaments botaniques, y compris ceux utilisés en médecine traditionnelle chinoise (MTC), traitent depuis longtemps les maladies cardiovasculaires où la dysfonction endothéliale est un facteur de risque bien établi. Dans la littérature, il existe de nombreux rapports sur les avantages dans la clinique et la santé des médicaments ou des préparations botaniques pour le système cardiovasculaire. Il a été indiqué que des médicaments botaniques, en particulier ceux ayant une capacité antioxydante puissante, protègent les cellules endothéliales (CE) en culture contre les radicaux libres et les oxydants. Cependant, il y a peu de recherches sur les médicaments botaniques dans le contexte de la cicatrisation et de la régénération tissulaire. Cette thèse a étudié quatre médicaments botaniques enregistrés dans la MTC pour explorer leurs effets sur la croissance des CE vasculaires et l'angiogenèse, deux événements activement impliqués dans la cicatrisation et la régénération tissulaire. Dans la première partie de la thèse, des cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVEC) ont été cultivées en présence de différentes doses d'extrait d'astragale en forme de poudre, d'injection d'astragale, d'injection de puerarin et de proanthocyanidine. Parmi les quatre médicaments, la proanthocyanidine a montré un effet puissant sur la viabilité cellulaire et stimulé la croissance cellulaire d'une manière dépendante de la dose. En dehors de la gamme de doses efficaces, la proanthocyanidine était inefficace ou cytotoxique. Fait important, la proanthocyanidine testée était capable de maintenir une viabilité cellulaire comparable aux cellules supplémentées avec le milieu spécifique pour les CE avec un niveau bas ou normal de sérum, ce qui suggère le potentiel de la proanthocyanidine en tant que stimulateur de croissance et réactif angiogénique. Dans la seconde partie de la thèse, des études mécanistiques ont été réalisées en bloquant à la fois les récepteurs du facteur de croissance des cellules endothéliales (VEGFR) et les récepteurs du facteur de croissance des cellules épithéliales (EGFR). Cependant, les bloqueurs ont été inefficaces pour réduire l'effet stimulant de la proanthocyanidine sur les CE. En conséquence, il est conclu que la proanthocyanidine stimule probablement la croissance des CE à travers des récepteurs membranaires autres que VEGFR et EGFR. Dans la troisième partie de la thèse, il a été montré que la proanthocyanidine pouvait être chargée dans un cryogel d'alcool polyvinylique, puis libérée du gel à une concentration dans la gamme de la dose efficace. Ceci a démontré la faisabilité d'une libération lente de proanthocyanidine à partir d'un support polymérique. Enfin, la propriété angiogénique de la proanthocyanidine a été testée sur un modèle de membrane chorioallantoïque d'embryon de poulet (CAM), montrant que ce médicament botanique était capable de stimuler le développement du système vasculaire. Cette thèse a donc démontré pour la première fois que la proanthocyanidine est capable de moduler l'activité des CE humaines, particulièrement de réguler positivement l'activité et la croissance des CE en l'absence de facteurs de croissance, et que la proanthocyanidine peut être utilisée comme réactif angiogénique et libérée d'un support de médicament synthétique. En somme, cette thèse a démontré que les médicaments botaniques en médecine traditionnelle chinoise peuvent être utilisés comme substituts pour produits protéiques pour maintenir les cellules en culture et induire l'angiogenèse pour la cicatrisation et la régénération tissulaire. / Botanic drugs including those used in traditional Chinese medicine (TCM) have a long history of treating cardiovascular diseases, of which endothelial dysfunction is well established as a risk factor. In literature there exist extensive reports about the clinic and healthy benefits of botanic drugs or preparations to the cardiovascular system. Botanic drugs particularly those with potent antioxidative capacity have also been reported to protect endothelial cells (EC) in culture against free radicals and oxidants. However, there is little research about botanic drugs in the context of wound healing and tissue regeneration. This thesis studied four botanic drugs recorded in TCM to explore their effects on vascular EC growth and angiogenesis, two events actively involved in wound healing and tissue regeneration. In the first part of the thesis, human umbilical endothelial cells (HUVEC) were cultured in the presence of different doses of astragalus powder extract, astragalus injection, puerarin injection, and proanthocyanidin. Among the four drugs, proanthocyanidin showed a potent effect on cell viability and stimulated cell growth in a dose dependent manner. Outside the effective dose range proanthocyanidin was either ineffective or cytotoxic. Importantly, the proanthocyanidin under test was able to maintain a cell viability comparable with the cells supplemented with the commercially available EC growth medium at both low and normal serum conditions, which suggests the potential of proanthocyanidin as an EC growth stimulator and an angiogenic reagent. In the second part of the thesis, mechanistic studies were performed by blocking both endothelial cell growth factor receptors (VEGFR) and epithelial cell growth factor receptors (EGFR). However, the blockers were ineffective in reducing the stimulatory effect of proanthocyanidin on EC. Therefore it is concluded that proanthocyanidin stimulates EC growth through membrane receptors other than VEGFR and EGFR. In the third part of the thesis, it was shown that proanthocyanidin could be loaded into polyvinyl alcohol cryogel and then released from the gel at a concentration within the effective dose window. This demonstrated the feasibility of drug releasing of proanthocyanidin. Finally, the angiogenic property of proanthocyanidin was tested in chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model, showing that this botanic drug was capable of stimulating vasculature development. Preliminary data in rat subcutaneous model also support the angiogenic potential of proanthocyanidin. This thesis therefore demonstrated for the first time that proanthocyanidin was capable of modulating the activity of human EC and in particular upregulating EC activity and growth in the absence of growth factors, and that proanthocyanidin may be used as an angiogenic reagent and released from a synthetic drug carrier. Consequently, this thesis has demonstrated that botanic drugs in traditional medicine may be used as substitutes of protein products to maintain cells in culture and to induce angiogenesis for wound healing and tissue regeneration.

Thèse en cotutelle pour un Doctorat en génie des matériaux et de la métallurgie, Université Laval, Québec, Canada et l'Université de Haute-Alsace, Mulhouse, France / L’absence de croissance en monocouche des cellules endothéliales sur la paroi des prothèses vasculaires est une des causes d’échec de leur implantation chez l’humain. Des études précédentes ont montré que le recouvrement de ces prothèses par un échafaudage de nanofibres d’acide polylactique (PLA), fabriqué par un système de filage par jet d’air innovant, peut être utilisé pour promouvoir la croissance des cellules endothéliales de façon adéquate. Ainsi, le caractère dégradable d’un matériau comme le PLA permettrait son remplacement graduel par la matrice extra-cellulaire produite par les cellules. D’autre part, la réussite d’une transition entre les nanofibres dégradables et la matrice extra-cellulaire nécessite un remplacement contrôlé et approprié. Or, la dégradation des nanofibres de PLA, dépendant de ses séquences stéréochimiques, est généralement trop longue et peut induire une cytotoxicité relative pendant sa dégradation. Dans ce contexte, les études de cette thèse ont pour objectifs de mieux comprendre la formation des fibres lors du filage, d’optimiser la fabrication des échafaudages permettant ainsi la création de nanofibres d’autres polymères, puis, de concevoir des nanofibres provenant d’un polymère mieux adapté à nos besoins, d’évaluer leur mécanisme de dégradation et sa cytotoxicité durant sa dégradation. Les travaux d’optimisation du système de filage ont démontré que la concentration avec un effet prépondérant. Ainsi, la mesure de la viscosité permet de trouver les paramètres adéquats pour le filage de polymère. Ensuite, un poly(L-lactide) semi-cristallin (PLLA) et un terpolymère de poly(lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) dédié pour des applications vasculaires ont été synthétisés et filés par jet d’air. Ces échantillons ont été dégradés en solution aqueuse et caractérisés par des méthodes physico-chimiques afin de mieux comprendre leurs mécanismes de dégradation et mis en présence de cellules endothéliales pour évaluer leur cytotoxicité. La comparaison entre les échafaudages des deux polymères a montré des comportements singuliers en dégradation, dépendants des caractéristiques thermiques des polymères. De plus, ces mécanismes de dégradation des nanofibres ont une influence directe sur la sensibilité des cellules endothéliales face aux produits de dégradation. En conclusion, ces travaux de doctorat présentent une solution prometteuse pour améliorer les prothèses vasculaires et qui pourrait être appliquée pour résoudre plusieurs problématiques en médecine régénératrice. / The absence of neo-endothelium on the intimal surface of vascular substitutes is known to be one cause of failure upon implantation of these prostheses in humans. Previous studies have shown that the coating of these substitutes with a nanofiber scaffold, made with an innovative air spinning device, can be used to promote a suitable endothelial cells growth. On one hand, the degradable feature of material as PLA enable the progressive replacement of the scaffold by the extracellular matrix of cells. On the other hand, the success of this replacement between degradable nanofibers and the extracellular matrix requires to be appropriate and controlled. Yet, the PLA nanofiber degradation process, which depends on its stereosequences, is generally too long for this application and could involve cell sensitivity during the degradation. In this context, studies from this thesis aim to understand the fibers formation during spinning, optimizing the scaffold fabrication as well as to promote the making of novel polymer scaffolds, then, design solution to polymeric nanofiber scaffolds for vascular application, evaluate its degradation mechanism and cytotoxicity during degradation process. The work on spinning device optimisation has demonstrated that the concentration had a dominant effect. Thus, viscosity measurements enable to find suitable parameters for polymer spinning. Then, a semi-cristalline poly(L-lactide) (PLLA) and a poly(lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) terpolymer specifically made for vascular application have been synthesized and air-spun. These samples were degraded in aqueous solution and characterized by physical and chemical methods to better understand their degradation mechanisms and seeded with endothelial cells to evaluate their cytotoxicity. The comparison between the two polymers scaffolds have shown surprising degradation behaviors depending on thermal properties of polymers. Moreover, these nanofiber degradation mechanisms have a direct influence on endothelial cells sensitivity with degradation by-products. To conclude, these works of doctorate display a promising solution to improve vascular prostheses and which could be applied to solve several issues in regenerative medicine field.