L’identification fréquente de mutations des protéines régulatrices du complément suggère que les lésions endothéliales du syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa) résultent d’une activation incontrôlée de la voie alterne du complément. Les mutations, en soi, ne constituent cependant que des facteurs de susceptibilité et les mécanismes menant de l’anomalie de régulation du complément au développement de lésions de microangiopathie thrombotique rénale restent mal compris. L’objectif de ce projet était donc d'étudier certains mécanismes de l’activation du complément à la surface des cellules endothéliales dans le SHUa et les conséquences de cette activation pour l’endothélium. Dans ce but, ce travail s’est initialement concentré sur la mutation C3R139W, dont nous avons réalisé la caractérisation phénotypique et fonctionnelle et qui a constitué un modèle d’étude des conséquences d’un complément dérégulé sur l’endothélium. Cette mutation a été identifiée de façon sporadique chez 4% des patients de la cohorte française de SHUa. Son étude phénotypique a mis en avant une évolution fonctionnelle rénale souvent sévère mais inhomogène ainsi qu’une fréquence non négligeable d’événements cardio-vasculaires. Sa caractérisation fonctionnelle a révélé une augmentation de son affinité pour le facteur B, à l’origine de la formation d’une « hyper C3 convertase », échappant également en partie aux systèmes de contrôle (diminution de liaison avec la MCP). L’étude de ses conséquences endothéliales a montré, à la surface de cellules pré-activées, une augmentation des produits d’activation du complément et de l’expression membranaire de facteur tissulaire, faisant le lien avec l’acquisition d’un phénotype endothélial prothrombotique. Nous rapportons également, sous l’effet de sérum porteur de cette mutation, une majoration de la perméabilité et du détachement cellulaire, susceptibles de traduire une souffrance endothéliale. Dans la deuxième partie et en vue de préciser les liens entre anomalie du complément et activation des cellules endothéliales, nous nous sommes intéressés au rôle de l’hémolyse, dénominateur commun des SHU. Nous avons ainsi montré que l’hème libre activait la voie alterne du complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales et ce, de façon exacerbé, en cas de dysrégulation sous-jacente du complément. Nous avons identifié plusieurs mécanismes d’action par lesquels l’hème peut activer le complément : il favorise les interactions C3/C3 et ainsi la formation d’une hyper C3/C5 convertase, déclenche une mobilisation des corps de Weibel-Palade à l’origine de l’expression membranaire de P-selectine, qui est capable d’activer la voie alterne du complément et induit une diminution de l’expression membranaire des régulateurs MCP et DAF. Par ces travaux, nous avons précisé les liens entre activation du complément et acquisition d’un phénotype endothélial prothrombotique dans le SHUa. Nous avons notamment identifié l’hémolyse comme un acteur potentiel de l’amplification des lésions endothéliales complément-dépendantes. Son contrôle pourrait ainsi constituer une nouvelle voie thérapeutique dans le SHU. / Pas de résumé en anglais

Le syndrome hémolytique et urémique atypique (SHU) et les glomérulonéphrites à dépôts de C3 sont des pathologies rares. Le SHU atypique est une pathologie aigüe sévère, responsable de microangiopathie thrombotique rénale glomérulaire et artériolaire. La glomérulonéphrite à dépôts de C3 (GNC3) est une pathologie chronique responsable d’une protéinurie et d’une insuffisance rénale chronique qui évolue sur plusieurs années. Ces pathologies sont secondaires soit à un défaut de régulation soit à une hyperactivation de la voie alterne du complément. Dans ces deux pathologies, le risque de récidive après transplantation rénale est élevé et responsable d’une perte de greffon. L’objectif de ma thèse a été de rechercher des marqueurs prédictifs de récidive et de sévérité conditionnant le pronostic de la transplantation rénale pour ces deux pathologies complément–dépendantes. Une approche à la fois clinique, biologique et génétique a permis de déterminer pour le SHU atypique : les facteurs de risque génétique de récidive, de déterminer pour la première fois que la présence de l’haplotype homozygote du Facteur H (gtgt) est associée à risque de récidive et de préciser les conséquences fonctionnelles des mutations. Ce travail a contribué à établir les recommandations du traitement chez les patients transplantés pour un SHU atypique. Les facteurs de risque de récidives des glomérulonéphrites à C3 ont été recherchés à partir d’une large cohorte de patients que j’ai créée. Ce travail a permis de mettre en évidence une corrélation entre l’hyperactivation de la voie alterne du complément (élévation du C5b9 soluble, C3 plasmatique bas), la présence de dépôts (C3, C5b9) dans le rein en post transplantation et la sévérité de la récidive. La consommation de C3 en phase fluide, la présence d’un sC5b9 élevé et la présence de C5b9 in situ sont associées à une récidive sévère. Enfin, j’ai participé à la première description de mutations de DGKE dans le SHU atypique. J’ai mis au point la technique d’immunohistochimie permettant de détecter et localiser DGKE dans les cellules endothéliales et podocytaires rénales. Ce travail a permis de montrer que le DGKE est présent dans l’endothélium rénal, élément essentiel du mécanisme physiopathologique du SHU atypique. Le DGKE est apporté par le rein transplanté et permet de corriger le risque de récidive après transplantation chez les patients déficitaires. / Pas de résumé en anglais

Résumé confidentiel / Confidential abstract

De façon physiologique, la voie alterne (VA) du complément est activée en permanence. Elle doit donc être finement régulée à tous les niveaux de la cascade afin de ne pas être délétère pour l'hôte. Chez l'homme, deux pathologies rénales sont associées à une activation non contrôlée de la VA du complément: le syndrome hémolytique et urémique atypique et la glomérulopathie à dépôts de C3 (GP-C3). Pathologie du sujet jeune essentiellement, la GP-C3 regroupe deux entités, la maladie des dépôts denses (GN-DD) et la glomérulonéphrite à dépôts de C3 (GN-C3), d'expressions clinique et histologique hétérogènes et toutes les deux de pronostic rénal réservé en l’absence de traitement efficace disponible (médiane de survie rénale de l’ordre de 8 à 10 ans). Les anomalies de la VA du complément mises en évidence dans la GP-C3 sont essentiellement acquises en rapport avec la présence d'auto anticorps (Ac) dirigés contre la C3 convertase alterne, le C3NeF, ou contre le FH, une protéine régulatrice essentielle de la VA. Dans 15 à 20% des cas seulement, les anomalies sont génétiques en rapport avec des mutations du FH, du FI. Les approches in silico de modélisation moléculaire des protéines mutées apportent des éléments de réponse quant à la responsabilité potentielle d'une mutation dans l’activation non contrôlée de la VA, néanmoins, l'étude des conséquences fonctionnelles est indispensable pour relier l'anomalie à la survenue de la pathologie rénale mais aussi pour comprendre les mécanismes précis impliqués dans le déterminisme des lésions rénales, de GN-DD ou de GN-C3. J'ai dans un premier temps étudié les conséquences fonctionnelles de la première mutation de C3 identifiée dans une forme familiale de GN-C3. In silico, cette mutation I734T est située au niveau d'un site impliqué dans la liaison de C3 avec deux protéines régulatrices, le FH et CR1 et à proximité du site d’interaction avec le FB. In vitro, j'ai pu confirmer que la mutation était responsable d'une activation de la VA au niveau tissulaire en rapport avec un défaut induit de régulation par le FH mais surtout CR1, une protéine régulatrice membranaire, identifié pour la première fois comme acteur dans la physiopathologie de la GP-C3. Par ailleurs, en raison de l'expression exclusivement podocytaire de CR1 au niveau glomérulaire, nous avons émis l'hypothèse que les régulateurs pouvaient jouer un rôle déterminant dans la localisation préférentielle des dépôts de C3 au niveau glomérulaire dans cette pathologie. Dans une deuxième partie, à la fois clinique et expérimentale, j'ai travaillé sur les formes acquises de GP-C3 en étudiant un sous-groupe particulier de patients de la cohorte française de GP-C3, âgés de plus de 50 ans et présentant une gammapathie monoclonale. La partie clinique de ce travail a permis de démontrer que la fréquence des gammapathies monoclonales est très nettement augmentée dans la GP-C3 chez les patients âgés de plus de 50 ans comparée à la population générale, que le pronostic rénal est particulièrement sombre avec une médiane de survie rénale de l’ordre de 2 ans et demi mais que le traitement efficace du clone B sous-jacent permet d'améliorer significativement la survie rénale. Les données de l’étude clinique suggèrent indirectement qu’il existe un lien entre l'immunoglobuline (Ig) monoclonale et l'activation de la VA responsable de l'apparition des lésions rénales. Dans la partie expérimentale, j'ai étudié les mécanismes d'activation de la VA dans ce contexte de gammapathie afin de confronter les données de l’étude clinique. L'étude des biomarqueurs d'activation de la C3/C5 convertase et le démembrement des mécanismes d'activation ont permis de conclure que la GP-C3 associée aux gammapathies monoclonales est caractérisée par une activation tissulaire de la VA impliquant la C3 convertase mais aussi et surtout la C5 convertase. (...) / Complement alternative pathway is physiologically activated. It need to be tightly regulated to avaoid uncontrolled deleterious overactivation on host cell surface. In human, two renal diseaes are associated with uncontrolled AP activation, hemolytic uremic syndrom atypical (aHUS) and C3 glomerulopathy (C3G). C3G occures mainly in children and young adults and regoups two distinct histopathological entities, dense deposit disease (DDD) and C3 glomerulonephritis (C3GN). Renal outcomes in C3G is poor since up to 50% of patients reach end stage renal disease 8 to 10 years after diagnosis. Complement abnormalities in C3G are mainly acquired induced by the presence of C3 Nephritic Factor (C3NeF): an autoantibdy targeting the AP C3 convertase. Less frequently C3G patients have anti-FH autoantibodies (Ref) or genetic abnormalities (variants in the FH, FI or CFHR5 genes. In silico analysis of mutated proteins give information about the role of mutation on AP overactivation. However, characterization of functional consequences of these mutations is required to proved the direct link between the abnormality and the occurrence of C3G. I first studied the functional consequences of the first C3 mutation, C3I734T, identified in a familial C3GN. In silico analysis revealed that the mutated residue, T734, is located on the C3 and C3b protein surface and that the substitution I734T may not be associated with major structural changes. The mutated amino acid is located on interaction site between C3b and complement regulatory proteins, FH and CR1. In vitro, the major defect of C3I734T was a decrease in binding to CR1, resulting in lower CR1 dependent cleavage of C3b by FI. These results provide evidence for a CR1 functional deficiency being responsible for deficient complement regulation. Binding of C3I734T to Factor H (FH) was normal, but C3I734T was less efficiently cleaved by Factor I, leading to enhanced C3 fragments binding on glomerular cells. In the second part of my work, I studied acquired C3G in patients with concomitant monoclonal gammopathy. In the clinical part of this study, we demonstrated The high prevalence of monoclonal gammopathy in C3G patients aged over 50, reaching 65% in the French C3G national cohort, strongly suggests a pathogenic link between the two conditions. Next, we demonstrated that renal outcomes is significantly worser in patients with monoclonal gammopathy compared to patients without monoclonal gammopathy but that efficient chemotherapy resulted in higher renal response rate and longer renal survival than conservative or immunosuppressive therapy. Results of the clinical part of the study strongly suggest a link betwwen the monoclonal gammopathy and the occurrence of C3G. In the experimental part of this work, I studied the mechanisms of complement AP activation in these population. Biomarkers of C3 and C5 convertase activation were present 40% and 81% of patients respectively. Anti-complement protein antibodies were found in 23/41 (56%) patients, including in most of patients, anti-FH and anti-CR1 antibodies. I found new antigenic target, C5 and properdin in few cases. The anti-FH and anti-CR1 antibodies were associated with clear functional consequences. Nevertheless, the anti-complement proteins reactivity was not carried out by the MIg in 75% of the cases. I discovered that the MIg induced a direct AP C3 convertase overactivation in 23/34 (67%) patients responsaible for a C5 convertase overactivation in presence of patients’ Ig, in a properdin dependant manner. Our results suggest that MIg and polyclonal autoantibodies could act in synergy: AP overactivation induced by the MIg could be amplified by the inefficient complement regulation, caused by the polyclonal anti-complement autoantibodies. All my results allow to better understand the pathophysiological mechanisms involved in C3G and open up reflection on therapeutic approaches for C3G associated with monoclonal gammopathy.