L'endothélium cornéen joue un rôle important dans le maintien de la transparence cornéenne, notamment en assurant le rôle de barrière entre la chambre antérieure et la cornée, et en créant des gradients ioniques nécessaires à la déturgescence stromale. Dans le cas de dysfonctions de l'endothélium, une perte progressive de la vision est engendrée. Parmi les causes de dysfonctions, la dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (DECF) est la plus importante. Présentement, le seul traitement disponible pour les endothéliopathies cornéennes est la greffe de cornée. Comme la demande en tissus oculaires est grandissante, des alternatives incluant l'expansion in vitro des cellules endothéliales cornéennes (CECs) ont été proposées, soit l'endothélium reconstruit et l'injection de CECs intracamérale. L'enjeu principal lors de la culture des CECs est la transition endothélio-mésenchymateuse (TEM), phénomène où les CECs perdent leur phénotype fonctionnel pour acquérir un phénotype fibroblastique non fonctionnel. Plusieurs étapes de la culture des CECs, comme l'isolement ou le milieu utilisé, peuvent être optimisées afin de conserver la fonctionnalité des CECs. Dans cet ordre d'idée, notre laboratoire a récemment démontré que l'ajout de TGF-β1 permettait de maintenir le phénotype fonctionnel lorsqu'il était ajouté à des CECs confluentes. L'objectif général du projet est d'optimiser les paramètres d'isolement et de culture afin de générer des CECs fonctionnelles pouvant être utilisées en alternative à la greffe de cornées cadavériques. Plus spécifiquement, les objectifs de cette thèse sont 1) d'identifier les paramètres d'isolement permettant de générer des CECs de haute densité et de phénotype endothélial, 2) de comparer l'efficacité des trois isoformes du TGF-β sur le maintien du phénotype endothélial en phase de maturation, de déterminer quels sont les mécanismes impliqués dans la maturation en présence de TGF-β ainsi que de confirmer la fonctionnalité tissulaire dans un modèle de chambres antérieures artificielles et 3) d'étudier l'effet du TGF-β2 sur les CECs provenant de spécimens pathologiques (DECF), notamment l'effet sur la mort cellulaire, sur l'expression des récepteurs du TGF-β et sur la TEM. Afin de répondre à l'objectif 1, deux méthodes d'isolement des CECs ont été comparées (EDTA et collagénase). Les résultats ont montré qu'une plus grande quantité de CECs viables étaient extraites des spécimens post-mortem avec la collagénase et que ces CECs avaient une morphologie plus circulaire. En ce qui a trait à l'objectif 2, les trois isoformes du TGF-β ont été ajoutées aux CECs en phase de maturation et ont permis de générer des cultures de CECs ayant un phénotype fonctionnel in vitro. Le transcriptôme et les voies de signalisation activées par le TGF-β ont été étudiés par la suite. Les résultats de profilage génique ont révélé une augmentation de l'expression de gènes liés à l'adhésion matricielle. Le profilage des voies de signalisation a, pour sa part, permis d'identifier 8 kinases significativement plus actives, dont la kinase AKT. Pour le dernier volet de cet objectif, la fonctionnalité tissulaire a été évaluée en utilisant un modèle d'injection de CECs sur cornées dévitalisées contenues dans des bioréacteurs. Une meilleure adhésion des CECs ayant préalablement été exposées au TGF-β2 ainsi qu'un rétablissement plus rapide des jonctions a été observé dès 2 jours de culture dynamique. Pour répondre à l'objectif 3, des CECs provenant de spécimens DECF ont été exposées au TGF-β2 avant que la mort cellulaire, l'expression des récepteurs du TGF-β et l'expression des jonctions intercellulaires soient mesurées. Aucune différence quant à la mort cellulaire n'a été observée. Seul le récepteur I du TGF-β est augmenté suite à l'exposition au TGF-β2. Les CECs pathologiques exprimaient plus fortement les protéines reliées aux jonctions intercellulaires et localisées à la membrane. Les travaux présentés dans cette thèse proposent une méthode de culture qui génère des CECs fonctionnelles. Ils démontrent également que le TGF-β2 aurait un rôle protecteur sur l'intégrité de la barrière endothéliale lorsque les CECs sont confluentes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/70374 |
| Date | 21 July 2022 |
| Creators | Santerre, Kim |
| Contributors | Proulx, Stéphanie |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xviii, 189 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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