Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1998. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le TGFB(bêta) est un facteur clé dans l'homéostasie du réseau vasculaire. Le laboratoire a découvert que le TGFB(bêta) induit des podosomes dans les cellules endothéliales (CE) artérielles in vitro. Ces microdomaines riches en F-actine, sont capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Nous avons mis en évidence des structures de même type dans l’endothélium natif, démontrant la pertinence des observations in vitro. Les CE expriment 2 récepteurs de type I au TGFB(bêta), ALK5 et ALK1, dont les fonctions respectives sur les CE font l’objet de controverses. Nous montrons in vitro, que l’assemblage des podosomes est dépendant de ALK1 et est induit dans un contexte d'activation de la CE. La fibronectine, présente dans la matrice lors de situations d'activation de la CE, est régulée par TGFB(bêta) /ALK1 dans notre modèle et est essentielle à la formation des podosomes. L'ensemble des données obtenues laisse présager un rôle des podosomes endothéliaux dans le remodelage artériel en réponse au TGFB(bêta). / TGFB(beta), a pleiotrop cytokine, acts as an important regulator for the maintenance of vascular homeostasis. Our team has discovered, for the first time, that TGFB(beta) induces podosomes formation in aortic endothelial cells (EC) in vitro. Podosomes are highly dynamic adhesion microdomains formed at the ventral membrane, consisting of a core of F-actin and actin-associated proteins, surrounded by a ring structure which in turn is consisting of plaque proteins as well as signaling proteins. In addition to the presence of specific markers, they are distinguished from other adhesion structures by the presence of metalloproteases, endowing them with the ability to degrade the extracellular matrix locally. We have bringing to light these structures in the endothelium of native arterial vessel exposed to biologically active TGFB(beta), showing relevance of these structures. Endothelial cells express two types I receptors of TGFB(beta), ALK5 and ALK1, which relative function on EC are controversial. We show in our model in vitro, that podosomes formation is ALK1-dependent and are induced when EC are in an active background. Fibronectin, an extracellular matrix component which is present during active situation, is regulated by TGFB(beta)/ALK1 signaling pathway and is essential for podosomes formation. This work open up new avenues to study the role of podosomes in vascular pathophysiology. We propose that podosomes are involved in arterial vessel remodeling.

La matrice extracellulaire est un réseau enchevêtré de macromolécules variées, en étroite relation avec les cellules qu'elle environne. Les interactions bidirectionnelles qui s'établissent entre les cellules et leur microenvironnement matriciel régulent mutuellement leur comportement et devenir. La diversité biochimique des constituants moléculaires de la matrice, leurs propriétés biophysiques, leur architecture tout comme leur dynamique représentent autant de signaux régulateurs. Parmi les constituants de la matrice, la fibronectine (FN) est une glycoprotéine structurale et fonctionnelle majeure intervenant dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Ces fonctions diverses sont directement liées à la dynamique structurale de cette protéine et à sa capacité à interagir avec les autres molécules matricielles, dont elle-même. Retrouvée sous forme soluble dans les fluides biologiques, la FN est incorporée dans les matrices insolubles sous forme d'assemblages supramoléculaires principalement fibrillaires mais aussi sous forme d'agrégats. Ces assemblages sembleraient être impliqués dans des processus physiologiques et pathologiques distincts.Si l'étude des assemblages de FN est rendue possible par l'élaboration de modèles in vitro, les mécanismes de polymérisation et l'effet d'assemblages de structures définies sur le comportement cellulaire restent cependant à mieux élucider et constituent le cœur de ce travail.Les travaux ont donc consisté à élaborer des assemblages de FN, à caractériser les mécanismes et structures impliqués dans leur polymérisation, et à étudier leur influence sur un modèle de cellules cancéreuses ovariennes. D'autre part, des études préliminaires comparatives ont été menées avec un analogue végétal de la FN.L'irréversibilité de la dénaturation thermique de la FN entraîne la formation d'agrégats de type amyloïde. Deux populations d'agrégats coexistent en solution. Cette agrégation est corrélée à une diminution de l'accessibilité des sites de liaison à la gélatine et des sites RGD, et à une diminution de l'incorporation dans les réseaux matriciels. De plus, si la FN sous sa forme agrégée n'est pas cytotoxique pour les cellules étudiées, la modification de la conformation de la FN favorise leur migration isolée et aléatoire.Ces résultats soulèvent la question de l'implication de ces agrégats de FN dans des processus pathologiques tels que le développement tumoral. / Extracellular matrix is a complex meshwork of various macromolecules that have a tight relationship with the surrounding cells. Bidirectional interactions between cells and the microenvironment control their respective behaviors and fate. The biochemical diversity of matrix molecular components, their biophysical properties, their architecture but also their dynamic represent as many regulator signals. Among the components of the matrix, fibronectin (FN) is a major structural and functional glycoprotein involved in numerous physiological and pathological processes. These various functions are directly linked to the structural dynamic of this protein and its ability to interact with others matrix components, in particular with itself. Found as a soluble protein in biological fluids, FN is also incorporated in insoluble matrix as supramolecular assemblies, mainly fibrils but also aggregates. These assemblies could be involved in distinct physiological and pathological processes.If the study of the assembly of the FN is possible with the help of in vitro models, the mechanism of polymerization and the effects of defined assemblies on the cell behavior still have to be better defined.Therefore, this work consisted in elaborating FN assemblies, in characterizing the mechanisms and structures involved in their polymerization and in studying their influence on behaviors of a model of ovarian cancer cells. Besides, preliminary comparative studies have been performed with a plant analogous of FN.We show that irreversible thermal unfolding of FN triggers amyloid-like aggregation. Two states of aggregates could coexist in solution. FN aggregation correlates with a decrease of gelatin-binding domain and RGD sequence accessibility, and a decrease of the incorporation in the matrix network. Moreover, if aggregates are not cytotoxic for the studied cells, conformation change of FN promotes their single-cell and random migration.These results raise questions about the role of FN aggregates in pathological processes like tumor development.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Clostridium difficile est une bactérie entéropathogène responsable de diarrhées nosocomiales post-antibiotiques et de colites pseudomembraneuses. Ces dernières années, l'incidence et la gravité des infections à C. difficile ont significativement augmenté en Amérique et en Europe. Cette évolution semble être liée à l'émergence puis à la dissémination très rapide d'un clone particulièrement virulent de PCR-ribotype 027. Les facteurs de virulence majeurs de C. difficile sont les toxines TcdA et TcdB qui sont responsables des lésions intestinales. Cependant, l’étape de colonisation de l’intestin par la bactérie est considérée comme un pré-requis à l’infection. Afin de mieux comprendre les mécanismes d’hypervirulence de la souche 027, nous nous sommes focalisés sur l’étude du processus de colonisation intestinal de cette souche en le comparant à celui de la souche non épidémique 630∆erm. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de la protéine de liaison à la fibronectine FbpA. La caractérisation in vitro et in vivo d’un mutant d’inactivation de fbpA, nous a permis de montrer l’implication de cette protéine dans le processus de colonisation de la souche non épidémique 630∆erm. La difficulté à obtenir un mutant dans la souche épidémique 027 R20291 ne nous a pas permis de comparer les propriétés adhésives de FbpA entre les deux souches. Dans un deuxième temps, nous avons étudié les caractéristiques des protéines flagellaires FliC, FliD, FlgE et MotB. Nous avons montré que les flagelles agissent en tant qu’adhésines chez la souche 027 et que ce rôle est moins important chez la souche 630∆erm. Nous avons également montré que les flagelles sont impliqués dans des processus cellulaires autres que l’adhésion et la colonisation. Selon une étude transcriptomique d’un mutant ∆FliC de la souche 027 R20291, il s’est avéré que la flagelline est aussi impliquée dans la production de toxines, la sporulation et dans l’adaptation de la bactérie aux conditions de stress. Une étude complémentaire serait nécessaire afin de mieux comprendre le système de régulation qui régi ces différents processus cellulaires.Finalement, nous avons effectué une analyse transcriptomique de la cinétique de colonisation in vivo de la souche 027. L’étude a révélé l’expression précoce des gènes de toxines et de sporulation au cours du processus d’infection. Elle nous a également permis d’identifier des gènes spécifiques à la souche 027 qui sont exprimés lors du processus infectieux. Ces gènes pourraient éventuellement être impliqués dans la virulence de C. difficile 027 et pourraient constituer de nouvelles pistes d’étude. / Clostridium difficile is an enteropathogenic bacterium that causes post-antibiotic nosocomial diarrhea and pseudomembranous colitis. During the last decade, the incidence and the severity of C. difficile infections have significantly increased in America and Europe. This evolution seems to be related to the emergence and to the rapid dissemination of a particularly virulent clone of PCR-ribotype 027. The main virulence factors of C. difficile are the TcdA and TcdB cytotoxins which are responsible for intestinal lesions. However, the intestinal colonization by the bacterium is considered as an indispensible step for infection.To better understand the hypervirulence mechanisms of strain 027, we focused on the study of intestinal colonization process of this strain compared to the colonization process of the non-epidemic strain 630Δerm. First, we studied the role of the fibronectin binding protein FbpA. In vitro and in vivo characterization of a mutant FbpA showed the involvement of this protein in the colonization process of the non-epidemic strain 630Δerm. The difficulty of obtaining a mutant in the epidemic strain R20291 027 does not allow us to compare the adhesive properties of FbpA between the two strains.In a second step, we studied the characteristics of flagellar proteins FliC, FliD, FlgE and MotB. We showed that the flagella have a role in the adhesion and colonization of strain 027 and that this role is less important in strain 630Δerm. We also showed that flagella are involved in other cellular processes than adhesion and colonization. A transcriptomic study of a FliC mutant in 027 R20291 shows that flagellin is also involved in toxin production, sporulation and in the adaptation of bacteria to stress conditions. Further study should be performed to better understand the regulation system that governs these different cellular processes. Finally, we performed a transcriptomic analysis of the kinetic of in vivo colonization of the 027 R20291 strain. The study revealed a very early expression of toxin and sporulation genes during the first stages of the infection process. This analysis also allowed us to identify some genes, specific to 027 strains, which appeared regulated during the infection process. These genes could be involved in the virulence of C. difficile 027 strains and could provide new issues of study to better understand C. difficile virulence.

La résistance à l'anoïkis est une étape importante vers la transformation maligne. Afin de comprendre les mécanismes de survie des cellules de mélanome hautement métastatique B16F10, un matériau cellulosique développé dans le laboratoire (CEL), ainsi que le polyHEMA ont été utilisés comme supports anti-adhésifs. Les cellules, au contact de ces revêtements adoptent une architecture en 3D qui est représentative de la situation in vivo. Le polystyrène sur lequel les cellules s'étalent (2D) et prolifèrent a été utilisé comme support de référence. Le comportement de la lignée de mélanome murin utilisée est comparé à celui de deux autres lignées murines identifiées sensibles à l'anoïkis : les fibroblastes Swiss 3T3 et les pré-ostéoblastes MC3T3. Nous avons pu mettre en évidence des dysfonctionnements représentant des «verrous» moléculaires pouvant être impliqués dans la survie des cellules de mélanome : en particulier l'activation prolongée de RhoA, la faible activation des caspases 3 et 9, l'activation de la voie de survie intracellulaire PI3K/AKT, l'expression élevée des intégrines et prolongée de la survivine. Nous avons alors cherché à lever certains de ces « verrous » en faisant agir des inhibiteurs chimiques ou en utilisant des siRNA. Un effet significatif sur la prolifération cellulaire a été observé en inhibant la voie PI3K/AKT. En revanche, l'hypothèse d'un rôle déterminant de la fibronectine dans le comportement des cellules B16F10 n'a pas été confirmée, au niveau de l'expression du gène (mesurée par qRT-PCR ou inhibée par siRNA). Enfin, des résultats prometteurs ont été obtenus sur l'effet anti-tumoral de la pectine Okra sur les cellules B16F10 cultivées en 3D.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les carcinomes sont des cancers touchant plusieurs organes du corps humain, notamment les seins, le pancréas, les poumons, l'intestin… et sont issus de la transformation de cellules épithéliales en cellules tumorales. Au cours du développement d'une tumeur, les cellules cancéreuses, contrairement aux cellules normales, acquièrent la capacité de se déplacer dans le corps humain, jusqu'à coloniser des organes voisins. Ces colonies sont appelées métastases. Le processus métastatique est responsable de 90% des décès dans le cadre des carcinomes. Ce processus n'est pas dû à l'action isolée des cellules cancéreuses mais est aussi le résultat d'une coopération entre la tumeur et son voisinage – le microenvironnement tumoral – favorisant la survie et la migration des cellules cancéreuses. Les fibroblastes sont une population cellulaire du microenvironnement tumoral. Il a été démontré que les fibroblastes sont activés à proximité des cellules cancéreuses ; on les qualifie de fibroblastes associés au cancer ou CAFs. Dans des tissus de patients, les tumeurs les plus agressives corrèlent avec un enrichissement en fibroblastes et une matrice plus dense. Mon projet de thèse illustre un nouveau mécanisme de coopération entre CAFs et cellules cancéreuses. Cibler l’action des fibroblastes pourrait ralentir la progression tumorale, voire bloquer la formation de métastases. / Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most abundant cells of the tumor stroma. Their capacity to contract the matrix and induce invasion of cancer cells has been well-documented. However, it is not clear if CAFs remodel the matrix by other means (degradation, matrix deposition or stiffening). This project demonstrates that CAFs induce cancer cell invasion through assembly of FN into the matrix. CAFs assembled fibronectin (FN) mainly via integrin α5 but integrin αvβ3 was necessary for initial mechanosensing and fibrillar adhesion formation. In the absence of FN, contractility of the matrix by CAFs is preserved. When degradation is impaired, CAFs retain the capacity to induce invasion in a FN-dependent manner. In all cases, the levels of expression of integrin β3 and the amount of assembled FN was directly proportional to the invasion induced by fibroblast populations. Our results highlight FN assembly and integrin β3 as new hallmarks of CAFs. We also noticed that cancer cells migrate towards CAFs suggesting a possible chemotactic response. Using Dunn’s chemotaxis chamber, we found that cancer cells migrate along a gradient of CAF-conditioned media and a gradient of fibronectin. Finally, orthotopic injections of cancer cells and CAFs in the colon wall of mice revealed that CAFs stimulate metastasis of cancer cells to the liver. In conclusion, our data show that CAFs promote cancer cell invasion by depositing fibronectin that can guide cancer cells favoring metastasis formation.

Les cancers de l’ovaire représentent la première cause de mortalité due aux cancers gynécologiques dans les pays développés. La plupart de ces cancers sont diagnostiqués à des stades tardifs quand les cellules cancéreuses ovariennes ont disséminé et colonisé les parois de la cavité abdominale. En conséquence, ces cancers sont associés à un sombre pronostic.Plus d’un tiers des patientes présentent une accumulation de liquide d’ascite au moment du diagnostic. L’ascite est un fluide exsudatif ayant une composante cellulaire et également une composante liquide acellulaire, constituant un réservoir dynamique de molécules bioactives. Malgré une réponse efficace aux traitements standards, les taux de récidive de cette pathologie restent élevés. L’acquisition d’une chimiorésistance et le mode de propagation atypique des cellules cancéreuses sont deux éléments importants impliqués dans la récidive des cancers ovariens.Le rôle de l’ascite et plus particulièrement de la composante matricielle ascitique, dans le processus de dissémination et dans la chimiorésistance des cellules cancéreuses ovariennes reste peu étudié et constitue le cœur de ce travail de thèse.L’objectif des travaux a été d’étudier l’influence de l’ascite et de deux glycoprotéines matricielles purifiées à partir d’échantillons d’ascites sur les comportements cellulaires propices à la dissémination et à la récidive des cancers ovariens. De plus, l’influence de l’ascite sur la réponse des cellules aux traitements à base de platine a également été recherchée et estimée.L’étude démontre que l’ascite est un microenvironnement propice à la dissémination des cellules cancéreuses ovariennes et que la fibronectine et la vitronectine ascitiques ainsi que leurs récepteurs d’adhérence spécifiques sont des éléments qui participent à la régulation de cette dissémination. L’ascite exerce également un effet protecteur contre l’effet cytotoxique des agents chimiothérapeutiques.Ces résultats mettent en perspectives l’intérêt potentiel de la fibronectine et de la vitronectine ascitiques comme outils diagnostiques et/ou cibles thérapeutiques des cancers ovariens et nous engagent à approfondir l’étude de ces deux molécules et de leurs conséquences sur la progression de la maladie. / Ovarian cancers are the leading cause of death among gynaecological cancers in western countries. Most of these cancers are diagnosed at a late stage, when ovarian cancer cells have spread and colonized the walls of the abdominal cavity. Therefore, these cancers are associated to a poor prognosis.More than one third of the patients show an accumulation of ascites at the time of the diagnosis. Ascites are exudative fluids composed of a cellular and also an acellular fraction. In fact, ascites constitute a dynamic reservoir of bioactive molecules. Even if the response of ovarian cancers to the current first-line therapy, that consit in debulking surgery followed by chemotherapy, is satisfactory, the rate of recurrence remains important. The gain of a chemoresistance and the atypical widespread of cancer cells are two important factors involved in the recurence of the ovarian cancers.The role of ascites and more particularly, of the ascitic matrix componants on the dissemination process and on the chemoresitance of the ovarian cancer cells remain poorly studied and is the aim of this work.The objective of this study was to investiguate the influence of ascites and of two matrix glycoproteins purified from samples of ascites i) on the cells behavior convenient to the dissemination and the recurrence of the ovarian cancers and ii) on the response of cells to therapeutics treatments with platinum.This study suggests that ascites are a permissive microenvironment to the dissemination of ovarian cancer cells and that ascitic fibronectin and vitronectin as well as their specific receptors are actors which participate to the regulation of this dissemination. Ascites also protect ovarian cancer cells against the cytotoxicity of chemotherapeutic drugs.These results illustrate the potential interest of ascites derived fibronectin and vitronectin as diagnosis tools and/or therapeutic targets for ovarian cancers and encourage us to deepen the study of these two molecules and their consequences in the progress of the disease.