La thérapie cellulaire constitue une stratégie prometteuse dans le traitement de l'infarctus du myocarde. Afin de mieux contrôler la survie, la différenciation et l'intégration des cellules greffées, nous avons tenté une approche d'ingénierie tissulaire en associant les cellules à un microvecteur comportant une surface biomimétique et pouvant libérer un facteur de croissance (FC), les microcarriers pharmacologiquement actifs (MPA). Parmi les cellules utilisées dans une telle approche, les cellules souches adultes dérivées du tissu adipeux (ADSC) ne soulèvent pas de problèmes d'ordre éthique et permettent de réaliser des greffes autologues. Ces cellules sont largement étudiées pour la régénération de nombreux tissus en vertu de leurs propriétés immuno-modulatrices, de leur capacité à sécréter des FC et chémokines, mais également de leur large potentiel de différenciation. Dans une première étape, nous avons étudié l'effet des molécules de la matrice extracellulaire et des MPA sur la différentiation en cardiomyocytes des ADSC en présence d'un cocktail de FC. Nous avons ainsi pu observer que l'apport du cocktail de FC permettait aux cellules de s'engager dans la voie de différentiation cardiaque après 2 semaines. En comparant l'effet de la laminine (LM) et de la fibronectine sur cette différentiation, nous avons pu observer que la LM permettait d'induire une différentiation dans une cellule plus mature et que ceci était potentialisée par un enrichissement du milieu en TGF!1. Finalement, l'apport de MPA recouverts de LM favorisait une différentiation plus rapide des cellules en présence du cocktail. Les MPA peuvent également libérer un facteur de croissance de manière prolongée au cours du temps. Par conséquent, nous avons encapsulé 3 protéines, le VEGF, le HGF et l'IGF-1, et d'étudier leur effet sur les comportement des ADSC. Nous avons ainsi pu observer que des MPA libérant du HGF et de l'IGF-1 induisaient une différenciation de ADSC dans la voie cardiaque et que cette différentiation était également observée lorsque les complexes ADSCMPA étaient intégrés dans un hydrogel thermosensible. Cependant, nous avons aussi observé que la quantité de protéines libérées à partir des MPA était plus faible dans le gel. Nous avons donc cherché dans une dernière partie à améliorer le profile de libération des protéines à partir des MPA en changeant la composition du polymère. Nous avons ainsi utilisé différents copolymères triblock PLGA-PEG-PLGA pour formuler des microsphères et évaluer leur rôle sur la libération de la protéine mais aussi sur la stabilité de celle-ci durant la dégradation du polymère.

Ce travail a pour objectif l’élaboration de surfaces permettant le contrôle de l’adsorption protéique et de l’adhésion cellulaire. Deux axes d’études permettent de répondre à cette problématique : d’une part l’optimisation des conditions de greffage par réaction thiol-ène de chaînes éthylène glycol (OEG ou PEG) comportant une fonction thiol sur une monocouche auto-assemblée de trichlorosilane d’undécényle, d’autre part la caractérisation chimique de surface (mesures d’angle de contact, ellipsométrie, microscopie de fluorescence, infrarouge en réflexion totale atténuée IR-ATR, spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X XPS, spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol ToF-SIMS) à l’issue de chaque étape de traitement. L’étude méthodologique des conditions de greffage thiol-ène montre la mise au point d’un système bicouche structuré après 1 minute de réaction pour le greffage OEG, 1 heure pour le greffage PEG. Par l’emploi de divers substrats (oxyde de silicium, titane, verre), différentes molécules OEG-thiol ou PEG-thiol (longues de 7 à 220 unités éthyléniques, terminées –méthyle, -carboxyle ou –amine), nous mettons en avant les déclinaisons possibles de cette stratégie. Ces terminaisons chimiques conduisent, au choix, à l’inhibition de l’adsorption protéique ou à l’adsorption de biomolécules, albumine de sérum bovin (BSA) ou fibronectine (Fn), permettant de faire de l’adhésion spécifique. Le contrôle, dans le plan de l’échantillon, des zones exposées à la lumière par photochimie lors du greffage thiol-ène autorise le photopatterning des surfaces permettant la maîtrise de l’adsorption protéique et également de l’adhésion cellulaire à la surface. / The aim of this work is to design surfaces allowing controlling cellular adhesion by the study of protein adsorption and cell adhesion. Two main parts were investigated in order to answer this challenge: on one side the optimization of grafting conditions using the thiol-ene reaction of thiol-terminated ethylene glycol chains (OEG or PEG) on a undecenyltrichlorosilane self-assembled monolayer, on the other side the surface chemical characterization (angle contact measurement, ellipsometry, fluorescence microscopy, attenuated total reflection infrared IR-ATR, X-ray Photoelectron Spectroscopy XPS, Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry ToF-SIMS) after each reaction step. The methodological investigation of thiol-ene grafting conditions exhibits the development of a bilayer structured system after a 1 minute reaction time concerning OEG grafting, 1 hour in case of PEG grafting. By using different substrates (silicon oxide, titanium, glass), different molecules OEG-thiol or PEG-thiol (from 7 to 220 ethylene unit long, methyl-, carboxyl- or amine-terminated), we highlight the range of available versions of this strategy. These chemical extremities lead on demand either to protein adsorption inhibition or to biomolecule adsorption, bovine serum albumin (BSA) or fibronectin (Fn) giving access to specific adhesion.By controlling the light-exposed areas in the sample plan, the photochemistry occurring during the thiol-ene grafting allows to design surface patterning for addressing both protein adsorption and cell adhesion on the sample surface.

La matrice extracellulaire (MEC) intervient dans de nombreux processus biologiques tels que la migration, la différentiation ou l’adhésion cellulaire. Elle est également associée à plusieurs évènements pathologiques. La cohésion de la MEC est assurée par un réseau organisé et complexe de protéines présent au voisinage immédiat des cellules. Ce projet a pour objectif de contribuer à la caractérisation structurale et fonctionnelle de certaines de ces complexes protéiques. Le Gelatin Binding Domain (GBD) (⁶FI¹²FII ⁷⁸⁹FI), localisé dans la région N-terminale de la fibronectine est connu pour interagir avec la transglutaminase 2 (TG2), le collagène de type I, ou encore des protéines d’adhésion bactériennes tel que la FNE (protéine de Streptococcus equi). Mes travaux de thèse portent donc sur la caractérisation fonctionnelle et structurale de ces interactions par des approches biophysiques et biochimiques. Ce travail a permis de cartographier les régions d’interactionentre la TG2 et le GBD d’une part et la FNE et le GBD d’autre part. Nous avons par la suite entrepris une étude par SAXS des complexes TG2/GBD et FNE/GBD et réussi à établir des modèles structuraux d’interaction entre (1) le GBD et le domaine N-terminal de la TG2 et (2) entre la FNE et le sous fragment ⁷⁸⁹FI du GBD. La structure tridimensionnelle de la protéine FNE a été résolue par cristallographie aux rayons X grâce à l’utilisation d’un outil original facilitant l’obtention de cristaux. / The extracellular matrix (ECM) is involved in a number of biological pathways associated with the cell migration, differentiation, adhesion and is also implicated in several pathological events. The cohesion of the ECM is accomplished by a highly organized protein complex network on the cell surface. The Gelatin Binding Domain (GBD) (⁶FI¹²FII ⁷⁸⁹FI) of the N-terminal region of fibronectin is found to interact with the transglutaminase 2 (TG2), collagen type I and the bacterial adhesion protein FNE. In this study, we conducted the structural and functional characterization of the protein complexes involved in the cohesion of ECM. The interactions between either TG2 or FNE and GBD have been characterized and the regions responsible for the interactions have also been mapped. Furthermore, we studied TG2/GBD and FNE/GBD complex by SAXS and built two models underscoring the interactions between (1), the GBD and the Nterminus of TG2 and (2), FNE and the sub-fragment ⁷⁸⁹FI of GBD providing insights on mechanistically elucidating the protein interactions during the cohehsion of ECM. The X-ray structure of the protein FNE of Streptococcus equi has been determined at 1.8 Å, by using an original tool that facilitates obtaining crystals.

Le travail présenté dans cette thèse porte sur l’élaboration de couches minces des biomatériaux biomimétiques nanostructurées par des techniques lasers pulsés et leur évaluation de point de vue physico-chimique et biologique (biocompatibilité, prolifération et différentiation cellulaires avec des biomatériaux). Le but vise à développer une nouvelle méthode de recouvrement d’implants osseux par des techniques laser pulsé avancées (PLD – Pulsed Laser Deposition et MAPLE - Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation). Ces techniques sont utilisées pour la synthèse d’un système biphasique composé de nanoparticules d’hydroxyapatite (HA) associées à des protéines d’adhérence type fibronectine (FN) et vitronectine (VN) déposées sur un substrat type titane. Le support métallique permettra de maintenir la rigidité mécanique, l’hydroxyapatite favorisera la bio-intégration dans le tissu osseux et les protéines accélèreront l’adhérence cellulaire. L’objectif principal est d’accélérer l’adhérence des cellules et formation des tissus sur les implants. Les études de prolifération et différentiation cellulaire suggèrent une prédisposition des cellules à la prolifération induite par les revêtements VN et à la différentiation stimulée par les revêtements FN. Les effets significatifs sur l’attachement, l’adhésion et la prolifération observés dans nos études sont très importants pour la première phase de stabilité mécanique d’un implant. Les couches HA/protéines déposées par laser pourraient permettre de réduire cette phase. / The work presented within the thesis concern the fabrication of biomimetic nanostructured biomaterial thin films by pulsed laser techniques and their evaluation from the physico-chemical and biological (cellular biocompatibility, proliferation and differentiation) points of view. The aim is to develop a new method for coating the osseous implants by advanced pulsed laser techniques (PLD – pulsed laser deposition and MAPLE – matrix assisted pulsed laser evaporation). These techniques are used for the fabrication of a biphasic system composed of hydroxyapatite (HA) nanoparticules associated with large adhesion proteins as e.g. fibronectin (FN) and vitronectin (VN) deposited on a titanium substrate. The metallic substrate will allow keeping the mechanical rigidity; the hydroxyapatite will favor the bio-integration in the osseous tissue while the proteins will accelerate the cellular adhesion. The main objective is to speed up the cellular adhesion and the formation of new tissue around the implant. The cellular proliferation and differentiation studies demonstrated a predisposal to cell proliferation induced by the VN coatings and to cell differentiation by FN. The significant effects on the cell adhesion, proliferation and differentiation observed in our studies are of great importance for the mechanical stability phase of the implant. The layers HA/proteins deposited by laser could reduce the time of this phase.

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale primaire la plus fréquente. Une dérégulation des voies de signalisation de l’EGFR et un fort potentiel invasif sont les caractéristiques principales du GBM. Malheureusement, les essais cliniques impliquant des thérapies anti-EGFR dans le traitement des GBM demeurent inefficaces. Nous avons précédemment montré que le récepteur de la fibronectine, l’intégrine α5β1, est associé avec un mauvais pronostic et une résistance des patients au temodal. Les intégrines peuvent coopérer avec les récepteurs aux facteurs de croissance et ainsi amplifier leur potentiel oncogénique. Ici, nous avons cherché à déterminer le rôle de l’intégrine α5 dans la résistance aux thérapies anti-EGFR. Utilisant la lignée U87 de GBM, on a dans un premier temps confirmé que l’activation de l’intégrine sous l’influence de la fibronectine, potentialisait la signalisation de l’EGFR. La perte d’expression d’α5 sensibilise les cellules U87 aux anti-EGFR (cetuximab, gefitinib) dans des essais de clonogénicité en soft agar. L’expression d’ α5 favorise la résistance aux 2 drogues lors de la migration cellulaire. Pour aller plus loin, nous avons développé un nouveau test basé sur la quantification de l’évasion cellulaire à partir d’une sphère tumorale. La perte d’ α5 augmente la sensibilité des cellules U87 à 2 TKI réversibles spécifiques de l’EGFR, gefitinib et erlotinib, mais n’a pas d’effet sur l’efficacité du lapatinib, un TKI irréversible ciblant EGFR, ErbB2, ErbB3 et ErbB4. Grâce à la microscopie confocale, nous avons montré l’effet important du gefitinib sur l’endocytose de l’intégrine et de l’EGFR. Ces résultats suggèrent que l’expression d’ α5 favorise la résistance aux TKI par l’activation des voies de signalisation des récepteurs ErbB ou en contrôlant le trafic membranaire de l’EGFR. On a aussi montré que pour favoriser l’adhésion cellulaire, l’intégrine α5 stimulait la fibrillogénèse. Dans les cellules migrant à distance de la sphère, l’intégrine α5 est strictement engagée dans des adhésions cellule-substrat contenant la protéine FAK activée. Nos résultats soulignent le rôle central du couple fibronectine/ intégrine α5 dans l’invasivité du GBM et la résistance aux thérapies anti-EGFR. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common primary brain tumor. Alteration of the EGFR pathway and high invasive potential are hallmarks of GBM. Unfortunately, trials using anti-EGFR therapies for the treatment of GBM reveal limited efficacy. We previously showed that overexpression of the fibronectin receptor, α5β1 integrin, is associated with a poor prognosis for patients and is responsible for chemoresistance to temodal. Integrins can cross-talk with growth factor receptors and amplified their oncogenic activity. Here, we sought to determine the potential role of α5 integrin in resistance to anti-EGFR therapy. Using U87 GBM cell line, we first confirmed that fibronectin-mediated integrin activation potentiated EGFR signaling. Loss of α5 integrin expression sensitized U87 cells to anti-EGFR drugs (cetuximab, gefitinib) in soft agar clonogenic assay. α5 expression can trigger resistance to both drugs on cell migration. To go further, we developed a new assay based on the quantification of cell evasion from tumor spheroids. α5 depletion increased U87 cell sensitivity to gefitinib and erlotinib, 2 EGFR-selective reversible TKI, but had not effect on lapatinib efficacy, an irreversible TKI that target EGFR, ErbB2, ErbB3 and ErbB4. Confocal microscopy revealed a strong impact of gefitinib on EGFR and integrin endocytosis. These results suggested that α5 expression may trigger resistance to TKI either by activating ErbB pathways or by controlling EGFR membrane trafficking. We also showed that to promote cell adhesion, α5 integrin stimulated fibronectin fibrillogenesis. As cells moved away from the spheroids, α5 became strictly engaged in cell-substratum adhesion sites where it recruited activated FAK. Our work highlights the pivotal role of fibronectin/α5β1 integrin in invasivity of GBM and resistance to anti-EGFR drugs.

Ce travail s’inscrit dans le cadre général du développement de biomatériaux ostéoinducteurs pour la réparation de grands défauts osseux. L’étude est une contribution à la compréhension des interactions physiques et chimiques entre des céramiques phosphocalciques et deux protéines d’intérêt : la fibronectine, protéine d’adhésion cellulaire, et le VEGF (pour Vascular Endothelial Growth factor) qui est impliqué dans la vascularisation et l’amélioration de la formation osseuse.Les interactions physiques fibronectine/biocéramique ont été étudiées par spectroscopie de force afin d’évaluer l’influence de la topographie et de la composition chimique de céramiques phosphocalciques en hydroxyapatite (HA), hydroxyapatite silicatée (SiHA) et hydroxyapatite carbonatée (CHA) sur l’adhésion de la fibronectine. Les résultats obtenus par cartographie de forces mettent en évidence une absence d’incidence de la chimie des céramiques polies sur la répartition en surface et l’intensité des forces d’adhésion. En revanche ces dernières sont plus fortes au niveau des joints de grains des céramiques non polies mettant en avant une influence de la topographie de surface des matériaux modulée par la chimie.Le protocole de fonctionnalisation par le VEGF consiste en trois étapes : silanisation, addition du SM(PEG)6 et immobilisation du VEGF. Les interactions chimiques VEGF/biocéramique ont été étudiées principalement par imagerie Raman pour suivre ces étapes successives de la fonctionnalisation par le VEGF de céramiques polies en hydroxyapatite (HA) et hydroxyapatite carbonatée (CHA). Cette approche a permis de cartographier l’évolution chimique de la surface des matériaux et de mettre en évidence la distribution spatiale ainsi que les réactions préférentielles entre les molécules intermédiaires et le VEGF en fonction de la nature du substrat. / This work is ascribed within the framework of the development of osteoinductive biomaterials for the repair large bone defects. It is a contribution to the understanding of the physical and chemical interactions between phosphocalcic ceramics and two proteins of interest: fibronectin (Fn), a cell adhesion protein, and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) which is involved in vascularisation and improvement of bone formation.Fibronectin/bioceramic physical interactions were studied by force spectroscopy to evaluate the influence of the topography and the chemical composition of phosphocalcic ceramics made of hydroxyapatite (HA), silicated hydroxyapatite (SiHA) and carbonated hydroxyapatite (CHA) on fibronectin adhesion. The results obtained in terms of force cartography do not indicate any impact of the polished ceramics chemistry on the surface distribution and intensity of adhesion forces. However, these forces are more intense at the level of the grain boundaries of unpolished ceramics, highlighting an influence of the topography modulated by the chemical composition.The protocol for functionalisation by VEGF consists of three steps: silanisation, addition of SM(PEG)6 and immobilisation of VEGF. VEGF/bioceramic chemical interactions were studied mainly by Raman imaging in order to follow the successive steps of the functionalisation by VEGF of the polished surface of ceramics made of hydroxyapatite (HA) and carbonated hydroxyapatite (CHA). This approach allowed to map the surface chemical changes and to point out the spatial distribution as well as the preferential reactions between the intermediate molecules and VEGF depending of the substrate.