Το οστό αποτελεί ένα σύνθετο υλικό, χαρακτηριζόμενο από μια πολύπλοκη ιεραρχική δομή. Συνίσταται από τρεις φάσεις, μια ανόργανη, μια οργανική και μια υδατική. Το ανόργανο μέρος του, το οποίο αντιστοιχεί περίπου σε 60-65% της κατά βάρος περιεκτικότητάς του, αποτελείται από ένα χημικό και δομικό ανάλογο του φωσφορικού άλατος υδροξυαπατίτης [Ca10(PO4)6(OH)2], το οποίο γι’ αυτό το λόγο καλείται βιοαπατίτης ή βιολογικός απατίτης. Το οργανικό μέρος αποτελεί περίπου το 30% της κ.β. περιεκτικότητάς του και κυριαρχείται από την παρουσία της πρωτεΐνης κολλαγόνο (τύπου Ι), το ποσοστό της οποίας ανέρχεται σε 90% περίπου της οργανικής φάσης. Το υπόλοιπο τμήμα αυτής καταλαμβάνεται από ένα πλήθος άλλων πρωτεϊνών, οργανικών ενώσεων και κυττάρων. Το εναπομένον 5-10% της μάζας του οστού αποτελείται από νερό. Η σύσταση του οστού και πιο συγκεκριμένα η περιεκτικότητά του σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο (των οποίων η συνολική % κ.β. περιεκτικότητα ανέρχεται σε πάνω από 95% επί ξηρού οστού) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις μηχανικές ιδιότητές του, όπως είναι η αντοχή σε θραύση, η ακαμψία και η ελαστικότητα. Οι μεταβολές των μηχανικών ιδιοτήτων σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις των οστών κατά τις οποίες είναι πολύ πιθανή η εμφάνιση κατάγματος, όπως είναι η οστεοπόρωση –από την οποία πάσχει ένα σημαντικό μέρος του πληθυσμού– αλλά και άλλες λιγότερο συνηθισμένες παθήσεις όπως η οστεομαλακία και η ατελής οστεογένεση. Οι παραπάνω ασθένειες και κυρίως η οστεοπόρωση, διαγιγνώσκονται μέχρι σήμερα με μέτρηση της οστικής πυκνότητας (Bone Mineral Density, BMD). Η συγκεκριμένη όμως παράμετρος υστερεί στην αξιόπιστη πρόβλεψη του κινδύνου εμφάνισης καταγμάτων. Για το λόγο αυτό, η νέα προσέγγιση στο συγκεκριμένο ζήτημα απαιτεί ως διαγνωστικό εργαλείο τη γνώση παραμέτρων που σχετίζονται άμεσα με τις μηχανικές ιδιότητες, ανάγοντας έτσι και τη σύσταση των οστών ως ένα πιθανό αξιόπιστο παράγοντα εκτίμησης του κινδύνου εμφάνισης κατάγματος. Αν και η σύσταση του οστού μπορεί να υπολογιστεί με διάφορες αναλυτικές τεχνικές, η χρήση της φασματοσκοπίας Raman (RS) αποτελεί μια προσέγγιση στο συγκεκριμένο ζήτημα η οποία παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως είναι η δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο, η ελάχιστη επεξεργασία του προς ανάλυση δείγματος ενώ ήδη έχουν αρχίσει να γίνονται προσπάθειες και για την ανάπτυξη μεθόδου για την in vivo ανάλυση των οστών. Λαμβάνοντας επομένως υπόψη τα σημαντικά πλεονεκτήματά της φασματοσκοπίας Raman και τη σπουδαιότητα της σύστασης στον καθορισμό της ποιότητας του οστού, επιχειρήθηκε η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ποσοτική ανάλυση της περιεκτικότητας των οστών σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο με τη βοήθεια της φασματοσκοπίας Raman. Για το σκοπό αυτό, συλλέχθηκαν δείγματα βόειων οστών (από το συμπαγές και το σπογγώδες τμήμα) και αφού πραγματοποιήθηκε χημικός καθαρισμός τους από ξένες οργανικές ενώσεις (λιπίδια, μυελός, κύτταρα), ορισμένα δοκίμια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του κολλαγόνου –κατόπιν διάλυσης του βιοαπατίτη με EDTA– ενώ κάποια άλλα δοκίμια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του βιοαπατίτη –με διάλυση του κολλαγόνου σε υδραζίνη. Στα πλαίσια χαρακτηρισμού των δοκιμίων, μελετήθηκαν οι επιδράσεις που επάγουν η διαδικασία του χημικού καθαρισμού και το πρωτόκολλο απομόνωσης κολλαγόνου στην κρυσταλλική δομή του βιοαπατίτη. Μετρήσεις με τη βοήθεια της περίθλασης ακτίνων Χ (XRD), αποκάλυψαν ότι ενώ ο χημικός καθαρισμός δεν επηρεάζει τη δομή των δοκιμίων ωστόσο, το πρωτόκολλο απομάκρυνσης του κολλαγόνου με υδραζίνη έχει ως συνέπεια την αύξηση της κρυσταλλικότητας και του μεγέθους των κρυσταλλιτών του βιοαπατίτη σε σημαντικό βαθμό. Επιπλέον, από μελέτες με φασματοσκοπία υπερύθρου και XRD προέκυψε ότι η μεταβολή των παραπάνω παραμέτρων οφείλεται στην απομάκρυνση των ιόντων CO32- και HPO42- από τους κρυσταλλίτες του βιοαπατίτη, η οποία προκαλείται από χρήση της υδραζίνης. Μάλιστα προέκυψε ότι όσο μεγαλύτερη είναι η θερμοκρασία της χρησιμοποιούμενης υδραζίνης τόσο μεγαλύτερη είναι η κινητική των μεταβολών που επάγονται στις κρυσταλλογραφικές παραμέτρους του βιοαπατίτη. Αναμιγνύοντας καθορισμένες ποσότητες βιοαπατίτη και κολλαγόνου, παρασκευάστηκαν πρότυπα μίγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ευθειών αναφοράς, για τον προσδιορισμό της σύστασης του οστού ως προς αυτά τα συστατικά. Από τα φάσματα Raman του οστού επιλέχθηκε η ν1 δόνηση των ΡΟ43- του βιοαπατίτη που εμφανίζεται ως μια κορυφή στα 960 cm-1 ως δείκτης της ποσότητάς του ενώ για το κολλαγόνο δοκιμάστηκαν δύο κορυφές, μια στα 1667 cm-1 που ανήκει στη δόνηση του αμιδίου Ι και άλλη μια στα 2941 cm-1 που αποδίδεται στην C-H2 δόνηση. Κατά την ανάλυση που ακολούθησε, χρησιμοποιήθηκαν τόσο τα ύψη όσο και τα εμβαδά κάτω από τις αντίστοιχες κορυφές. Οι λόγοι εντάσεων (εκφραζόμενές από τα ύψη ή τα εμβαδά των κορυφών) των δονήσεων 960 cm-1/1667 cm-1 και 960 cm-1/2941 cm-1 είναι ανάλογοι του λόγου περιεκτικοτήτων σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο. Προέκυψαν επομένως τέσσερεις ευθείες αναφοράς. Από αξιολόγηση των συγκεκριμένων ευθειών αναφοράς προέκυψε ότι μεγαλύτερη ακρίβεια στον υπολογισμό του λόγου περιεκτικοτήτων βιοαπατίτη και κολλαγόνου παρουσιάζει αυτή που χρησιμοποιεί το λόγο υψών των κορυφών 960 cm-1/1667 cm-1. Επιπλέον, επιχειρήθηκε η ανάπτυξη ενός νέου μοντέλου βαθμονόμησης με τη χρήση χημειομετρικών μεθόδων και πιο συγκεκριμένα εφαρμόζοντας τον αλγόριθμο PLS, ο οποίος έχει εφαρμοστεί με σημαντική επιτυχία τα τελευταία χρόνια στην ανάλυση φασματοσκοπικών δεδομένων. Επειδή για την ανάπτυξη του νέου μοντέλου χρησιμοποιήθηκε μια μεγάλη περιοχή του φάσματος (από 366 cm-1 ως 1800 cm-1) και όχι μεμονωμένες δονήσεις, αναμένετο μεγαλύτερη ακρίβεια στον υπολογισμό της σύστασης των αγνώστων δειγμάτων. Από τους διάφορους τρόπους κατασκευής μοντέλων ποσοτικής ανάλυσης βιοαπατίτη και κολλαγόνου που αναπτύχθηκαν, αυτό που επέδειξε τα καλύτερα χαρακτηριστικά ήταν εκείνο που τα πειραματικά δεδομένα, πριν την επεξεργασία τους με τον αλγόριθμο PLS, υποβλήθηκαν στον SNV (Standard Normal Variate) μετασχηματισμό. Μετά την επιλογή των βέλτιστων για κάθε μέθοδο μοντέλων, ακολούθησε η αξιολόγησή τους με άλλες τεχνικές. Αρχικά, ποσοτικοποιήθηκε η περιεκτικότητά σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο μεγάλου αριθμού δοκιμίων οστών, με τις παραπάνω μεθόδους που βασίζονται στη φασματοσκοπία Raman. Ακολούθως, τα ίδια οστά αναλύθηκαν με τις τεχνικές της φασματομετρίας ατομικής απορρόφησης (AAS) και της θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA) ως προς την περιεκτικότητά τους σε ανόργανη και οργανική φάση. Σύγκριση των αποτελεσμάτων από αυτές τις τεχνικές με τα αντίστοιχα που προέκυψαν από την ανάλυση με φασματοσκοπία Raman, κατέδειξαν μειωμένη ικανότητα πρόβλεψης της περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο και για τα δύο μοντέλα που είχαν αναπτυχθεί με βάση τη φασματοσκοπία Raman. Θεωρώντας ως ένα από τους λόγους αποτυχίας των παραπάνω μοντέλων ποσοτικής ανάλυσης την επιλογή της δόνησης του αμιδίου Ι στα 1667 cm-1 ως δείκτη της ποσότητας του κολλαγόνου, επιχειρήθηκε η κατασκευή ενός νέου μοντέλου ποσοτικής ανάλυσης, με την επιλογή διαφορετικών δονήσεων για την ποσοτικοποίηση του κολλαγόνου. Οι κορυφές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αυτές στα 855 και 878 cm-1 οι οποίες ανήκουν σε δονήσεις των αμινοξέων προλίνη και υδροξυπρολίνη αντίστοιχα ενώ, για το βιοαπατίτη χρησιμοποιήθηκε και η κορυφή στα 960 cm-1. Και πάλι αναπτύχθηκαν μοντέλα λαμβάνοντας υπόψη τα ύψη και τα εμβαδά των παραπάνω κορυφών. Τελικά, προέκυψε ότι το βέλτιστο μοντέλο ήταν αυτό στο οποίο ως δείκτης της ποσότητας του κολλαγόνου χρησιμοποιήθηκε το άθροισμα των υψών των κορυφών στα 855 και 878 cm-1. Αξιολόγηση του συγκεκριμένου μοντέλου μέσω της σύγκρισης με τα αποτελέσματα που εξήχθησαν από τις ποσοτικές αναλύσεις με την ατομική απορρόφηση και τη θερμοσταθμική ανάλυση, κατέδειξε ιδιαίτερα ικανοποιητική σύγκλιση των τιμών περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο από τις τρεις τεχνικές. Ως εκ’ τούτου, κατέστη δυνατή η δημιουργία ενός μοντέλου ακριβούς πρόβλεψης της σύστασης των οστών ως προς την ανόργανη και την οργανική φάση. Η εξίσωση της καμπύλης αναφοράς που προτείνεται για το σκοπό αυτό είναι η: όπου: Ηi είναι το ύψος της κορυφής του φάσματος Raman στον κυματάριθμο i και ΧΒ, ΧC οι % κ.β. περιεκτικότητες των οστών σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο αντίστοιχα / Bone is a composite material characterized by a complicated hierarchical structure. It consists of three phases: inorganic, organic and aqueous. The inorganic is the dominant part accounting 60-65% w/w of bone and is a chemical and structural analogue of the mineral hydroxyapatite [Ca10(PO4)6(OH)2]. It is exactly for this reason that it is called bioapatite or biological apatite. The organic part constitutes about 30% of the weight of bone and its principal component is collagen (type I), which accounts for more than 90% of the weight of the organic phase. Non-collagenous proteins, lipids, cells and other organic substances are also included in the organic part of bone. The remaining 5-10% w/w of bone is water. The composition of bone and particularly the concentrations of bioapatite and collagen (which together exceed 95% w/w of dry bone) play a crucial role in its mechanical properties, including resistance to fracture, stiffness and elasticity. These properties relate to various pathological situations of bone which may cause fractures like osteoporosis –the most frequent metabolic bone disease– osteomalacia, osteogenesis imperfecta and others. For the diagnosis of the above diseases and especially of osteoporosis, measurements of BMD (Bone Mineral Density) is the gold standard. However, nowadays it is a common belief that BMD alone cannot reliably predict the risk of bone fracture. For this reason, a new approach is followed according to which the study of factors that influence the mechanical properties of bone is suggested for diagnostic purposes. Inarguably, the composition of bone appears to be a key factor for the evaluation of risk fracture. Despite the fact that composition of bone has been determined by various analytical techniques, the use of Raman spectroscopy (RS) for this purpose, has been inadequately exploited. The simultaneous analysis of inorganic and organic phase, the minimal or even none requirements for sample preparation and the promising ongoing efforts for the in vivo analysis of tissues, rendered this technique a powerful tool for the study of bones. Taking into account the important advantages of RS and the role of bone composition as a diagnostic parameter, it was attempted to develop a method, based on RS, of quantitative analysis of the composition of bioapatite and collagen in bone. A large number of bovine bone specimens (cortical and trabecular) was collected. Lipids, marrow and the non-collagenous proteins were removed by chemical methods. Some of the specimens were treated with EDTA solutions for the separation of collagen. A second batch of bone specimens was subjected to the removal of organic phase by hydrazine. Afterwards, the effect of chemical purification and of hydrazine treatment on the crystal structure of bioapatite was investigated. X-Ray Diffraction (XRD) measurements revealed that although chemical purification does not have any significant effect, hydrazine treatment induces noteworthy changes of the crystal size and crystallinity of the mineral phase. Further XRD measurements and investigation of bone specimens with infrared spectroscopy unveiled that the observed changes were temperature depended and were due to the removal of CO32- and HPO42- ions from the crystal lattice of bioapatite, caused by hydrazine. A series of standard mixtures was prepared by mixing carefully weighted amounts of the purified bone components and the corresponding calibration curves were constructed. These calibration lines could be used for the quantitative analysis of bone specimens with respect to its content in bioapatite and collagen. The peak at 960 cm-1 of the Raman spectrum of bone was selected as marker of bioapatite (ν1 vibration of ΡΟ43-¬). For collagen two peaks were tested, at 1667 cm-1 (vibration of amide I) and at 2941 cm-1 (vibration of C-H2). For these two peaks both, the height and the integrated areas were used for the construction of the respective calibration curves. Height and area ratios of 960 cm-1/1667 cm-1 and 960 cm-1/2941 cm-1 peaks are proportional to the ratio of mass fraction of bioapatite to collagen. For the models developed, the most accurate was proved to be this one that used the height ratio of 960 cm-1/1667 cm-1 peaks. For comparison reasons, new models were developed based on chemometrics and in particular by using the PLS algorithm. PLS has been proved a powerful method for the analysis of multivariate problems and during the last years there is a growing number of applications in spectroscopy. A broad region of the Raman spectrum was used from 366 cm-1 to 1800 cm-1 and various spectral filters were tested. The best results were obtained for the SNV spectral filter. Following the selection of the optimum model for each of the two different methods of calibration, they were evaluated with the results from other analytical techniques. Various bone specimens were quantified for bioapatite and collagen with the implementation of the developed models and their results were compared with the corresponding results of two other analytical techniques, Atomic Absorption Spectroscopy (AAS) and Thermogravimetric Analysis (TGA). Although analytical results showed good agreement between AAS and TGA, the consensus of the results obtained by RS and that of AAS and TGA was poor. This indicates that the developed methods based on RS were inappropriate. A possible reason for the failure of the above models, which based on RS, could be the selection of amide I vibration for the quantification of collagen. Thus, additional models were constructed using different peaks as collagen markers. The peaks at 855 and 878 cm-1 were selected, which are attributed to vibrations of the amino acids proline and hydroxyproline, respectively. For bioapatite the peak at 960 cm-1 was used. The quantitative analysis was developed using heights and integrated areas of the selected peaks. Comparison between the models showed that the best results were obtained by the model that takes into account the sum of the heights at 855 cm-1 and 878 cm-1. Comparison of this model with the results obtained from AAS and TGA showed excellent agreement with respect to the content of bone specimens in bioapatite and collagen. The calibration equation derived for this model is: where: Hi is the height of the peak at the i wavenumber of the Raman spectrum and ΧΒ, ΧC are the % mass content of bioapatite and collagen in the bone specimens respectively

Le but de cette étude était d’évaluer si la bone morphogenetic protein (BMP)-2 pouvait aider à contrôler le phénotype de chondrocytes humains dans des conditions de culture à long terme nécessaires pour la transplantation de chondrocytes autologues (TCA). Nous avons aussi évalué le potentiel de la BMP-2 comme facteur de réparation du cartilage, en combinaison avec un biomatériau à base de collagène, pour étendre la technique aux lésions arthrosiques. Des chondrocytes humains ont été cultivés selon la procédure utilisée pour la TCA. Nous avons évalué la réponse des chondrocytes à la BMP-2 en culture monocouche ou dans les éponges de collagène par des analyses par PCR en temps réel, par Western blotting et Immunohistochimie.L’ajout de BMP-2 améliore le caractère chondrogénique des chondrocytes humains amplifiés en monocouche. L’effet stimulateur de la BMP-2 sur l’expression du collagène de type II a été observé au niveau des gènes mais aussi des protéines, ce qui est une propriété essentielle pour la reconstruction d’une matrice cartilagineuse. Nos résultats ont aussi montré que dans des chondrocytes tout d’abord amplifiés en monocouche puis cultivés en éponges de collagène en présence de BMP-2, la BMP-2 est capable de restaurer l’expression du gène COL2A1 et la synthèse de collagène de type II qui avaient été perdues pendant l’amplification. De manière importante, aucun signe de maturation hypertrophique ou d’induction ostéogénique n’a été détecté. Cette étude est la première à révéler le bénéfice de l’ajout de BMP-2 à des chondrocytes humains comme un agent thérapeutique pour la réparation du cartilage. / The aim of this study was to investigate if bone borphogenetic brotein (BMP)-2 could help to control human chondrocytes phenotype in long-term culture conditions necessary for autologous chondrocyte implantation (ACI). We also evaluated the potential of BMP-2 as a repair factor in combination with collagen-based biomaterials, to extend the technique to osteoarthritic lesions. Human chondrocytes were cultured independently, according to the procedure used for ACI. We evaluated the responsiveness of chondrocytes to BMP-2 when cultured in monolayer or within collagen sponges using Real-time PCR, Western blotting and Immunohistochemistry. Exogenous BMP-2 improved the chondrogenic character of human chondrocytes when amplified in monolayer. The stimulatory effect of BMP-2 on type II collagen expression was observed not only at the mRNA level but also at the protein level, and this is crucial for cartilage matrix reconstruction. Our data with human chondrocytes first amplified in monolayer then cultured in collagen sponges in the presence of BMP-2 have revealed that BMP-2 is able to restore COL2A1 gene expression and type II collagen synthesis that were lost during the amplification step. Importantly, no sign of hypertrophic maturation or osteogenic induction was detected beside the chondrogenic stimulatory effect of BMP-2. This study is the first to reveal the benefit of adding exogenous BMP-2 to human chondrocytes as a therapeutic agent for cartilage repair.

Ce travail s’inscrit dans le cadre général du développement de biomatériaux ostéoinducteurs pour la réparation de grands défauts osseux. L’étude est une contribution à la compréhension des interactions physiques et chimiques entre des céramiques phosphocalciques et deux protéines d’intérêt : la fibronectine, protéine d’adhésion cellulaire, et le VEGF (pour Vascular Endothelial Growth factor) qui est impliqué dans la vascularisation et l’amélioration de la formation osseuse.Les interactions physiques fibronectine/biocéramique ont été étudiées par spectroscopie de force afin d’évaluer l’influence de la topographie et de la composition chimique de céramiques phosphocalciques en hydroxyapatite (HA), hydroxyapatite silicatée (SiHA) et hydroxyapatite carbonatée (CHA) sur l’adhésion de la fibronectine. Les résultats obtenus par cartographie de forces mettent en évidence une absence d’incidence de la chimie des céramiques polies sur la répartition en surface et l’intensité des forces d’adhésion. En revanche ces dernières sont plus fortes au niveau des joints de grains des céramiques non polies mettant en avant une influence de la topographie de surface des matériaux modulée par la chimie.Le protocole de fonctionnalisation par le VEGF consiste en trois étapes : silanisation, addition du SM(PEG)6 et immobilisation du VEGF. Les interactions chimiques VEGF/biocéramique ont été étudiées principalement par imagerie Raman pour suivre ces étapes successives de la fonctionnalisation par le VEGF de céramiques polies en hydroxyapatite (HA) et hydroxyapatite carbonatée (CHA). Cette approche a permis de cartographier l’évolution chimique de la surface des matériaux et de mettre en évidence la distribution spatiale ainsi que les réactions préférentielles entre les molécules intermédiaires et le VEGF en fonction de la nature du substrat. / This work is ascribed within the framework of the development of osteoinductive biomaterials for the repair large bone defects. It is a contribution to the understanding of the physical and chemical interactions between phosphocalcic ceramics and two proteins of interest: fibronectin (Fn), a cell adhesion protein, and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) which is involved in vascularisation and improvement of bone formation.Fibronectin/bioceramic physical interactions were studied by force spectroscopy to evaluate the influence of the topography and the chemical composition of phosphocalcic ceramics made of hydroxyapatite (HA), silicated hydroxyapatite (SiHA) and carbonated hydroxyapatite (CHA) on fibronectin adhesion. The results obtained in terms of force cartography do not indicate any impact of the polished ceramics chemistry on the surface distribution and intensity of adhesion forces. However, these forces are more intense at the level of the grain boundaries of unpolished ceramics, highlighting an influence of the topography modulated by the chemical composition.The protocol for functionalisation by VEGF consists of three steps: silanisation, addition of SM(PEG)6 and immobilisation of VEGF. VEGF/bioceramic chemical interactions were studied mainly by Raman imaging in order to follow the successive steps of the functionalisation by VEGF of the polished surface of ceramics made of hydroxyapatite (HA) and carbonated hydroxyapatite (CHA). This approach allowed to map the surface chemical changes and to point out the spatial distribution as well as the preferential reactions between the intermediate molecules and VEGF depending of the substrate.