Κατά την ανάπτυξη του οργανισμού, η απόκτηση εξειδικευμένων κυτταρικών λειτουργιών βασίζεται στην ασύμμετρη διαίρεση βλαστικών κυττάρων, την παραγωγή προγονικών κυττάρων και τη σταδιακή διαφοροποίησή τους. Η διαδικασία αυτή απαιτεί τον συντονισμό των μηχανισμών ελέγχου των κυτταρικών διαιρέσεων με επι-γενετικούς και μεταγραφικούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς. Προκειμένου να κατανοήσουμε την ρύθμιση των μηχανισμών αυτών στα βλαστικά και πρόδρομα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος, μελετήσαμε την πρωτεΐνη Geminin, η οποία έχει δειχθεί να συμμετέχει τόσο στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, όσο και στον έλεγχο των αποφάσεων για διαφοροποίηση. Σε προηγούμενα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριό μας απομονώθηκαν βλαστικά και προγονικά κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος από το εμβρυικό ήπαρ διαγονιδιακών μυών 15.5 ημερών που φέρουν ιστοειδική απαλοιφή της Geminin με την χρήση του Cre-LoxP συστήματος υπό τον έλεγχο των ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδίου vav. Η αδρανοποίηση της Geminin στα βλαστικά και πρόδρομα κύτταρα του εμβρυικού ήπατος οδηγεί σε πρόωρο θάνατο και ανώμαλη ανάπτυξη του αιμοποιητικού συστήματος. Αποτελέσματα του εργαστηρίου μας προτείνουν πως η Geminin διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες της αυτό-ανανέωση και διαφοροποίηση των βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος. Για να διαλευκάνουμε τα μοριακά μονοπάτια στα οποία συμμετέχει η Geminin και για τον εντοπισμό του γονιδιακού δικτύου μέσω του οποίου η Geminin ελέγχει τις διαδικασίες αυτό-ανανέωσης και διαφοροποίησης του αιμοποιητικού συστήματος, πραγματοποιήσαμε πειράματα μικροσυστοιχιών DNA. Η παρούσα πτυχιακή εργασία εστιάστηκε στην ανάλυση της συγκριτική μελέτης του γονιδιώματος από τον κυτταρικό πληθυσμό βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος που πραγματοποιήθηκε μεταξύ γονιδιακά τροποποιημένων μυών και μυών μαρτύρων αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προτείνουν πως η έλλειψη της Geminin απορρυθμίζει την έκφραση σημαντικών αναπτυξιακών γονιδίων, όπως μεταγραφικών παραγόντων και ρυθμιστών αναδιάταξης της χρωματίνης που εμπλέκονται στην εμβρυική αιμοποίηση. Οι διαταραχές αυτές μπορούν να αιτιολογήσουν το φαινότυπο που παρουσιάζουν οι μύες στους οποίους έχουμε αδρανοποιήσει το γονίδιο της Geminin. Στο φαινότυπο αυτό παρατηρείται η συσσώρευση των βλαστικών κυττάρων και η ταυτόχρονη μείωση του πληθυσμού και της ικανότητας διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος. / During the development of the organism, the acquisition of specialized cellular functions is based on the asymmetric division of stem cells, the production of progenitor cells and their gradual differentiation. This process requires the coordination of the cell proliferation control mechanisms by epigenetic and transcriptional regulatory mechanisms. In order to understand the regulation of these mechanisms in stem and progenitor cells of the hematopoietic system, we studied the protein Geminin, which has been shown to be involved in both cell cycle regulation and in differentiation decision control. In previous experiments conducted in our laboratory we isolated hematopoietic stem and progenitor cells from the fetal liver of transgenic mice at embryonic day 15.5. The transgenic mice bear tissue specific deletion of Geminin using the Cre-LoxP system under the control of regulatory elements of the vav gene. Inactivation of Geminin in stem and progenitor cells of the fetal liver leads to early death and abnormal development of the hematopoietic system. Previous results from our laboratory suggest that Geminin plays an important role in the self- renewal and differentiation processes of hematopoietic stem and progenitor cells. We performed cDNA microarray experiments to elucidate the molecular pathways and to identify the gene networks through which Geminin controls the self-renewal and differentiation processes in the hematopoietic system. The present study is focused on the whole genome comparison from the hematopoietic stem and progenitor cell population between transgenic mice and wild type mice, used as control samples. The results indicate the deregulation in the expression of important developmental genes like, transcription factors and chromatin rearrangement regulators involved in embryonic hematopoiesis. The abnormalities in gene expression caused by the absence of Geminin in the hematopoietic system of the embryos explain the presented phenotype which is characterized by the accumulation of stem cells and the simultaneous reduction of the progenitor cell population and their ability to differentiate.

Στη διπλωματική αυτή γίνεται μελέτη κάποιων τεχνικών που χρησιμοποιούνται για την αφαίρεση θορύβου από εικόνες μικροσυστοιχιών DNA. Στη συνέχεια γίνεται εφαρμογή φίλτρου median και μετασχηματισμού κυματιδίων (wavelet) για την αφαίρεση θορύβου από πραγματικές εικόνες μικροσυστοιχιών και σύγκριση των αποτελεσμάτων. / -

Σκοπός της έρευνας ήταν να μελετήσουμε την επίδραση της θερμοκρασίας στο ολικό μεταγράφωμα νυμφών zebrafish (Danio rerio, Hamilton 1822), θέλοντας να εστιάσουμε το ενδιαφέρον μας στη διερεύνηση μηχανισμών και μορίων που εμπλέκονται στο φυλοκαθορισμό του συγκεκριμένου ψαριού. Kατορθώσαμε να επιδράσουμε με τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε μία θερμοκρασιακά ευαίσθητη οντογενετική περίοδο, η οποία οριοθετείται από την 10 έως την 20dpf. Η επιλογή των θερμοκρασιών έγινε με σημείο αναφοράς τους 28 ºC, η οποία είναι η πρότυπη θερμοκρασία ανάπτυξης των zebrafish. Η μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας επιτεύχθη με διατήρηση των πειραματικών μας πληθυσμών σε θερμοκρασίες που αποκλίνουν κατά 4-6 ºC από την πρότυπη, δηλαδή στους 32 ºC και 22 ºC αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, ολόκληρος ο πειραματικός πληθυσμός αναπτύχθηκε στη πρότυπη θερμοκρασία των 28 ºC μέχρι και την 10 dpf, όπου μετά την πάροδο της χωρίστηκε σε τρεις υπoπληθυσμούς καθένας από τους οποίους εκτέθηκε στους 22 ºC, 28 ºC ή 32 ºC αντίστοιχα για 280 θερμοημέρες (χρονική περίοδος :10-20dpf). Ακολούθησε δειγματοληψία (100 περίπου ατόμων) από κάθε υποπληθυσμό και εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA. Τα δείγματα μας υβριδοποιήθηκαν σε microarrays, τα οποία έφεραν αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες για 15.500 γονίδια του zebrafish. Τα δεδομένα επεξεργάστηκαν με τη χρήση δυο εξειδικευμένων βιοπληροφορικών προγραμμάτων, τα Biosystanse και Dchip, με τη βοήθεια των οποίων συγκρίθηκαν οι εξής καταστάσεις: 10dpf _28 ºC με 20dpf _28 ºC, η οποία αποτελεί την αναπτυξιακή σύγκριση ώστε να ελέγξουμε γονίδια των οποίων η έκφραση αυξάνεται ή ελαττώνεται στα δυο αυτά στάδια αλλά και 20dpf_22 ºC με 20dpf_32 ºC, 20dpf_22 ºC με 20dpf_28 ºC και 20dpf_28 ºC με 20dpf_32 ºC, ώστε να παρατηρηθεί η επίδραση του περιβαλλοντικού παράγοντα ″θερμοκρασία″ στο μεταγράφωμα των ιχθυδίων. / The purpsose of this research was to analyse how temperature effects the total trascriptome at juvenile zebrash (Danio rerio, Hamilton 1822). So, we focus our investigation in the inspection of mechanisms and molecules which probably associated with the sex determination at this specific type of fish. We militated in the thermosensitive ontogenetic period ( from 10 to 20 days post fertilization) with three different temperatures. These three temperatures were 22, 28 and 32οC. Exemplary temperature for zebrafish is 28οC (environmental temperature). Initially, experimental population grew up to 28οC until the 10th day post fertilization. After this temporal period, population separated to three smaller experimental populations which of them grew up to 22, 28 and 32οC respectively for 280 thermodays ( chronic period: 10-20dpf). The next step was sampling (about 100 fish from each experimental population) and then isolating total RNA from each one of the samples. Total RNA samples hybridized on microarrays. Microarrays contained complementary sequences for about 15.500 genes of zebrafish genome. The data analyzed with two specific bioinformatics programs, Biosystance and Dchip. The use of these bioinformatics programs helped us comparing the following situations: 10dpf _28 ºC to 20dpf _28 ºC (developmental comparison) over and above 20dpf_22 ºC to 20dpf_32 ºC, 20dpf_22 ºC to 20dpf_28 ºC and 20dpf_28 ºC to 20dpf_32 ºC (temperature comparison).

Η σύγκριση του μεταγραφικού προφίλ με χρήση μικροσυστοιχιών DNA είναι μια τεχνική που βελτιστοποιήθηκε την τελευταία δεκαετία. Η διαδικασία μπορεί να διαχωριστεί σε δύο μέρη: το πειραματικό και το υπολογιστικό. Το πρώτο μέρος αφορά στα βήματα της επιλογής της μικροσυστοιχίας, της απομόνωσης του βιολογικού υλικού, της σήμανσης και της επέκτασης, της υβριδοποίησης και της σάρωσης. Το υπολογιστικό μέρος αφορά στην ποσοτικοποίηση της εικόνας, στην κανονικοποίηση των δεδομένων και στην ανάλυσή τους. Πριν από τα παραπάνω βήματα πρέπει να έχει διατυπωθεί το κατάλληλο βιολογικό ερώτημα. Το βιολογικό ερώτημα που τέθηκε αφορούσε στις διαφορές στη γονιδιακή έκφραση των γενετικά τροποποιημένων εμβρυικών ινοβλαστών του ποντικού οι οποίοι έφεραν έλλειψη του ενός αλληλομόρφου της πρωτεΐνης Geminin σε σύγκριση με ομόζυγους εμβρυικούς ινοβλάστες. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκε μικροσυστοιχία δοκιμής με 384 ανιχνευτές γονιδίων ποντικού σε διπλά αντίγραφα. Απομονώθηκε ολικό RNA από τα κύτταρα, σημάνθηκε με απ’ ευθείας σήμανση και οι cDNA στόχοι που προέκυψαν, υβριδοποιήθηκαν στη μικροσυστοιχία. Έπειτα από δοκιμές καθορίστηκαν οι κατάλληλες συνθήκες για ένα ολοκληρωμένο πείραμα σύγκρισης μεταγραφικού προφίλ. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε προκαταρκτική ανάλυση του πειράματος η οποία περιελάμβανε ποσοτικοποίηση της εικόνας που προέκυψε, κανονικοποίηση των δεδομένων και πολυπαραμετρική ανάλυσή τους. / Transcriptional profiling using DNA microarrays was optimized during the last decade. The process can be separated in two parts: the experimental part and the computational part. The first part includes the steps of microarray choice, isolation of the biological material, labeling and amplification, hybridization and scanning. The computational part includes image quantification, data normalization and data analysis. Before the above steps, an appropriate biological question should be formulated. We wished to study differences in the gene expression profile of genetically modified mouse embryonic fibroblasts bearing a knock – out allele of the Geminin gene (homozygote|+/- Gem), in comparison to wild type embryonic fibroblasts. For this reason, a trial microarray was chosen with 384 gene probes in duplicates. Total RNA was isolated from the cells, directly labeled and the cDNA targets synthesized were hybridized to the microarray. After a series of trials, optimal conditions for a complete transcriptional profiling experiment were determined. Initial analysis including quantification of the image, data normalization and further multifunctional analysis was then carried out.

Οι μικροσυστοιχίες συμπληρωματικού DNA (cDNA) αποτελούν αποδοτικά και αποτελεσματικά μέσα για την ταυτόχρονη ανάλυση της λειτουργίας δεκάδων χιλιάδων γονιδίων. Μια τυπική cDNA εικόνα μικροσυστοιχιών αποτελεί μια συλλογή πράσινων και κόκκινων κηλίδων (spots) που περιέχουν DNA. Κάθε κηλίδα καταλαμβάνει ένα μικρό τμήμα της εικόνας, με τη μέση τιμή της έντασης της κηλίδας να είναι στενά συνδεδεμένη με το επίπεδο έκφρασης του αντίστοιχου γονιδου. Η κύρια διαδικασία υπολογισμού της έντασης περιλαμβάνει τρία στάδια: Διευθυνσιοδότηση ή κατασκευή πλέγματος (gridding), κατάτμηση (Segmentation) και τέλος η διαδικασία εξαγωγής έντασης. Στη παρούσα εργασία, η διευθυνσιοδότηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια αυτόματη τεχνική κατασκευής πλέγματος στηριζόμενη στον συνεχή μετασχηματισμό κυματιδίων (CWT). Ποιο συγκεκριμένα,, υπολογίστηκαν τα προφίλ του χ και y άξονα της εικόνας. Δεύτερον, εφαρμόστηκε, σε κάθε προφίλ, ο CWT μετασχηματισμός εώς το 15 επίπεδο, χρησιμοποιώντας daubechies 4 (db4) ως μητρικό κυματίδιο. Τρίτον, υπολογίστηκε το άθροισμα των 15 επιπέδων για κάθε ένα από τα δύο σήματα x και y. Τέταρτον, εφαρμόστηκε στα δύο νέα σήματα τεχνική καταστολής θορύβου με χρήση μετασχηματισμού Wavelet. Τελικά, το κέντρο και όρια της κάθε κηλίδας καθορίστηκαν μέσω του υπολογισμού των τοπικών ελαχίστων και μέγιστων του κάθε σήματος. Για την κατάτμηση της εικόνας, μια νέα μέθοδος προτάθηκε, η οποία διακρίνεται σε τρία βασικά βήματα: Πρώτον, ο à trous μετασχηματισμός κυματιδίων (AWT) εφαρμόστηκε έως το δεύτερο επίπεδο στην αρχική εικόνα. Δεύτερον, στις λεπτομέρειες (details coefficients) του κάθε επιπέδου εφαρμόστηκε φίλτρο καταστολής θορύβου, προκειμένου να υποβαθμιστεί ο θόρυβος. Τρίτον, η αρχική εικόνα μαζί με τις προσεγγίσεις (approximations) και τις λεπτομέρειες (details) του κάθε επιπέδου εφαρμόστηκαν σε ένα συλλογικό σχήμα (ensemble scheme) στηριζόμενο στο MRF μοντέλο κατάτμησης. Ως τελεστές του σχήματος χρησιμοποιήθηκαν οι: Majority Vote , Min, Product και Probabilistic Product. Η αξιολόγηση των προτεινόμενων αλγορίθμων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση υψηλής ποιότητας εικόνας προσομοίωσης αποτελούμενη από 1040 κηλίδες (spots) με ρεαλιστικά μορφολογικά χαρακτηριστικά, η οποία δημιουργήθηκε σύμφωνα με το μοντέλο προσημείωσης μικροσυστοιχιών του Matlab καθώς και 14 πραγματικές εικόνες, επτά 16-bit grayscale TIFF εικόνες από κάθε κανάλι (κόκκινο και πράσινο), οι οποίες αποκτήθηκαν από την ευρέως διαδεδομένη βάση δεδομένων DERICI. Επιπλέον, προκειμένου να παρατηρηθεί η συμπεριφορά των αλγορίθμων στη παρουσία θορύβου, η απομιμούμενη εικόνα υποβαθμίστηκε με τη προσθήκη λευκού Gaussian θορύβου. Η ακρίβεια της ακολουθούμενης διαδικασίας κατάτμησης, στη περίπτωση της εικόνας προσομοίωσης, προσδιορίστηκε μέσω του segmentation matching factor (SMF), probability of error (PE) και coefficient of determination (CD) με σεβασμό στη πραγματική κλάση στην οποία ανήκουν (φόντο-υπόβαθρο). Στη περίπτωση των πραγματικών εικόνων η αξιοπιστία των αλγορίθμων προσδιορίστηκε έμμεσα μετρώντας την ένταση κάθε κηλίδας, μέσω του Mean Absolute Error (MAE). Το σύνολο των αλγορίθμων, εφαρμοσμένο στην απομιμούμενη εικόνα, κατάφερε να οδηγήσει σε καλύτερο προσδιορισμό των κηλίδων σε σχέση με το απλό MRF μοντέλο κατάτμησης. Επιπλέον, ο τελεστής Majority Vote επέτυχε το υψηλότερο ποσοστό σε όλες τις περιπτώσεις, ειδικά σε κελία (cells) με υψηλή παρουσία θορύβου (SMF: 82.69%, PE: 6.60% and CV:0.809 ), ενώ το απλό μοντέλο περιορίστηκε στο χαμηλότερο ποσοστό (SMF:94.87%-82.69%, PE:3.03%-9.85%, CV:0.961-0.729). Στη περίπτωση των πραγματικών εικόνων ο min τελεστής επέτυχε το χαμηλότερο ποσοστό (MAE: 803.96 and Normalized MAE: 0.0738), σε αντίθεση με τον τελεστή Majority Vote, ο οποίος κατάφερε να επιτύχει το υψηλότερο ποσοστό ανάμεσα στους χρησιμοποιούμενους τελεστές (MAE 990.49 and Normalized MAE 0.0738).Επιπλέον όλοι οι προτεινόμενοι αλγόριθμοι κατάφεραν να μειώσουν τη μέση τιμή MAE σε σχέση με το απλό μοντέλο MRF (MAE 1183.50 and Normalized MAE 0,0859). / Complementary DNA microarrays are a powerful and efficient tool that uses genome sequence information to analyze the structure and function of tens of thousands of genes simultaneously. A typical cDNA microarray image is a collection of green and red discrete spots containing DNA. Each spot occupies a small fraction on the image and its mean fluorescence intensity is closely related to the expression level of the genes. The main process for measuring spot intensity values involves three tasks: gridding, segmentation and data extraction. In the present study, spot location was accomplished by using an automatic gridding method based on continues wavelet transform (CWT): Firstly, line-profiles for x and y axes were calculated. Secondly, the CWT was applied up to 15 scales to both profiles by using daubechies 4 (db4) as mother wavelet. Thirdly, a summation point by point of the signals of all the 15 scales was calculated. Fourthly, a hard-thresholding wavelet based technique was applied to each signal. Finally, spots centers and boundaries were defined by calculating the local maxima and the local minima on both signals. The proposed segmentation method is divided into three major steps: Firstly, à trous wavelet transform was applied up to second scale on the initial cell. Secondly, on the details coefficients, a hard threshold filter was carried out in order to suppress the noise. Finally, the initial image among the approximations and details of each scale were implemented in an ensemble scheme based on MRF model. As operators of the ensemble scheme were chosen: Majority Vote, Min, Product and Probabilistic Product. The validation of the proposed algorithms was accomplished by a high quality simulated microarray image of 1040 cells with realistic morphological characteristics generated by using the Matlab microarray simulation model and fourteen real cDNA microarray images, seven 16-bit grayscale TIFF images of both channels (green and red), collected from the DERICI public database. In order to investigate the performance of the algorithms in presence of noise, the simulated image was corrupted with additive white Gaussian noise. In the case of simulated image, the segmentation accuracy was evaluated by means of segmentation matching factor, probability of error and coefficient of determination in respect to the pixel actual classess (foreground-background pixels). In the case of real images the evaluation was based on Mean Absolute error (MAE), in order to measure indirectly their reliability. According to our results in simulated cells, the proposed ensemble schemes managed to lead to more accurate spot determination in comparison to conventional MRF model. Additionally, the majority vote operator managed to accomplish the highest score in all cases, especially on cells with high noise (SMF: 82.69%, PE: 6.60% and CV:0.809), while the conventional MRF managed to gather the lowest score in all cases (SMF:94.87%-82.69%, PE:3.03%-9.85%, CV:0.961-0.729). In the case of real images, the min operator achieved the lowest score (MAE: 803.96 and Normalized MAE: 0.0738) in contrast to majority vote, which reached the highest score among the proposed evaluating methods (MAE 990.49 and Normalized MAE 0.0738). Additionally, all the proposed algorithms managed to suppress MAE value compared to the conventional MRF segmentation model (MAE 1183.50 and Normalized MAE 0,0859).

- / -

In this thesis, a comparative evaluation of five different wavelet-based filtering techniques in the task of microarray image denoising and enhancement, as well as, a new methodology for the segmentation of microarray images is developed. Clinical material comprised complementary DNA (cDNA) microarray images collected from the Oak Ridge National Laboratory, simulated data produced by using a Microarray Scan Simulator, and a set of two simulated images, each containing 200 spots. Image pre-processing was performed in two stages: In the first stage an Exponential Histogram Equalization filter was applied to real cDNA images in order to increase the contrast between spots and surrounding background. In the second stage, five wavelet-based image filters (Simple Piece-Wise Linear Mapping Filter (SPWLMF), Hard Threshold filter (HTF), Wavelet Enhancement with Noise Suppression filter (WEWNSF), Non Linear Enhancement filter (NLEF) and Sigmoidal Non-linear Enhancement filter (SNLEF)) were implemented for denoising and enhancing gene microarray spots. The enhancing effectiveness of the five filters was assessed by calculating the Mean-Square-Error (MSE) and the Signal-to-MSE ratio. An automatic gridding scheme was applied to both real and simulated cDNA images, for the task of determining spots and their borders (cells). Firstly, the segmentation capability of the Gaussian Mixture Models GMM boosted by the five wavelet based preprocessing filters was evaluated by calculating the segmentation matching factor for each spot. Significant noise suppression was accomplished by the SPWLMP filter, which scored the minimum MSE and the maximum Signal-to-MSE ratio. Optimal segmentation results were obtained by pre-processing the microarray image by all the wavelet-based filters. Finally, a new methodology for spot identification based on the combination of GMM clustering technique with Gradient Vector Flow (GVF) active contours was introduced. According to that method, a GMM clustering algorithm was firstly applied in all individual spot images of the cDNA image. Afterwards, the output of the GMM algorithm was used to utilize a Gradient Vector Flow (GVF) active contour. The major advance of our method is that it overcomes limitations of GMM and deformable models when used individually. For the evaluation of our method, segmentation matching factors, as well as mean intensity value were calculated for every cell using GMM, GVF active contours and GMM and GVF active contours combination. Numerical experiments using simulated cDNA images have also shown that our method was more accurate in measuring mean intensity values and detecting real boundaries of spots with foreground mean intensity value close to the background, compared with GMM and snakes used individually. / Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η συγκριτική αξιολόγηση πέντε διαφορετικών φίλτρων βασισμένα σε μετασχηματισμό κυματιδίου, τα οποία εφαρμόστηκαν σε εικόνες μικροσυστοιχιών. Επίσης, μια νέα μέθοδος για την κατάτμηση των εικόνων αυτών πραγματοποιήθηκε. Ως υλικό, χρησιμοποιήθηκαν εικόνες συμπληρωματικού DNA από το Oak Ridge National Laboratory, απομιμούμενα δεδομένα με την χρήση του Microarray Scan Simulator, καθώς και ένα σετ από δύο απομιμούμενες εικόνες, οι οποίες περιείχαν 200 κηλίδες. Η προεπεξεργασία των εικόνων πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια. Πρώτα, ένα εκθετικό φίλτρο ισοστάθμισης ιστογράμματος εφαρμόστηκε στις πραγματικές εικόνες, με σκοπό την αύξηση της αντίθεσης της εικόνας. Στη συνέχεια, αναπτυχθήκαν και εφαρμόστηκαν τα πέντε φίλτρα βασισμένα σε μετασχηματισμό κυματιδίου (Simple Piece-Wise Linear Mapping Filter (SPWLMF), Hard Threshold filter (HTF), Wavelet Enhancement with Noise Suppression filter (WEWNSF), Non Linear Enhancement filter (NLEF) and Sigmoidal Non-linear Enhancement filter (SNLEF)) με σκοπό την αύξηση της αντίθεσης. Ποσοτικά, η ικανότητα βελτίωσης των πέντε παραπάνω αλγορίθμων μετρήθηκε με το Mean-Square-Error (MSE) και το Signal-to-MSE. Ένα αυτόματο σύστημα διευθυνσιοδότησης εφαρμόστηκε στις πραγματικές και τις απομιμούμενες εικόνες με σκοπό την ανίχνευση των κηλίδων. Στην συνέχεια εφαρμόστηκαν αλγόριθμοι κατάτμησης μίξης Γκαουσιανών μοντέλων (GMM). Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του παράγοντα ταυτοποίησης κατάτμησης. Σημαντική μείωση του θορύβου πραγματοποιήθηκε από το φίλτρο SPWLMF, το οποίο πέτυχε το μικρότερο MSE και το μεγαλύτερο S/MSE. Επίσης, καλύτερα αποτελέσματα πάρθηκαν από τις εικόνες οι οποίες είχαν προεπεξεργαστεί από τα φίλτρα μετασχηματισμού κυαμτιδίου. Στη συνέχεια, υλοποιήθηκε μια νέα τεχνική κατάτμησης βασισμένη στο συνδυασμό GMM και Gradient Vector Flow (GVF) ενεργών περιγραμμάτων. Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, ο αλγόριθμος GMM εφαρμόζεται και δημιουργείτε μια δυαδική εικόνα η οποία περιέχει το περίγραμμα της κηλίδας. Στην συνέχεια, αυτό το περίγραμμα χρησιμοποιείται για την εκκίνηση ενός GVF ενεργού περιγράμματος. Το κυριότερο πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι ότι ξεπερνά περιορισμούς των δύο αυτών αλγορίθμων, όταν αυτοί χρησιμοποιούνται μεμονωμένα. Για την αξιολόγηση της μεθόδου υπολογίστηκε ο παράγοντα ταυτοποίησης κατάτμησης, καθώς και η μέση τιμή για κάθε κηλίδα, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο GMM, τον αλγόριθμο GVF ενεργών περιγραμμάτων καθώς και το υβριδικό μοντέλο GMM και GVF ενεργού περιγράμματος. Αριθμητικά αποτελέσματα σε απομιμούμενες εικόνες απέδειξαν ότι η μέθοδος μας είναι πιο αποτελεσματική στο να βρίσκει τα όρια των κηλίδων, κυρίως σε αυτές στις οποίες η τιμή της έντασης βρίσκεται πολύ κοντά στο φόντο.

Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη πιο συχνά εμφανιζόμενη νευροεκφυλιστική νόσος του ΚΝΣ και επηρεάζει το 1%-2% του γηράσκοντα πληθυσμού. Η κύρια ιστοπαθολογία της νόσου χαρακτηρίζεται από την προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλαινας ουσίας, γεγονός που οδηγεί στην εμφάνιση των πρωτογενών συμπτωμάτων της νόσου τα οποία σχετίζονται με κινητικές δυσλειτουργίες. Τα συμπτώματα της νόσου, στα οποία στηρίζεται η διάγνωσή της, εμφανίζονται αφού ένας σημαντικός αριθμός ντοπαμινεργικών νευρώνων έχει ήδη εκφυλιστεί. Επιπρόσθετα, τα συμπτώματα αυτά δεν είναι ειδικά για τη ΝΠ, θέτοντας τη διάγνωσή της ειδικά στα πρώτα στάδια εκδήλωσής της σχετικά επισφαλή. Η αιτιολογία της νόσου παραμένει άγνωστη έως σήμερα. Η ΝΠ θεωρείται ένα πολυπαραγοντικό σύνδρομο, οι μηχανισμοί παθογένειας της οποίας είναι ακόμα αδιευκρίνιστοι, καθώς τα πρώτα στάδια εξέλιξής της, στα οποία η όποια θεραπεία αναμένεται να είναι πιο αποτελεσματική, δε γίνονται αντιληπτά και κατά συνέπεια δεν μπορούν να μελετηθούν άμεσα στον άνθρωπο. Η παρούσα ερευνητική εργασία είχε 2 σκοπούς: 1) τη μελέτη της παθογένειας της εκφύλισης της μελαινοραβδωτής οδού και 2) την ανίχνευση του παθολογικού φαινοτύπου της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. 1) Στα πλαίσια της πρώτης κατεύθυνσης μελετήθηκε ο μεταλλαγμένος μυς weaver, που αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό γενετικό μοντέλο προοδευτικής εκφύλισης της μελαινοραβδωτής οδού. Ο ιστοπαθολογικός του φαινότυπος στηρίζεται σε μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο girk2 που κωδικοποιεί μια υπομονάδα των GIRK καναλιών. Αν και η μετάλλαξη αυτή βρέθηκε να μη συσχετίζεται με την εμφάνιση της ΝΠ στον άνθρωπο, ανάλογοι υποπληθυσμοί ντοπαμινεργικών κυττάρων εκφυλίζονται και χαρακτηρίζουν την παθολογία του μοντέλου όσο και της νόσου. Σημαντικό πλεονέκτημα του μοντέλου weaver επίσης είναι ότι η έναρξη της νευροεκφυλιστικής διαδικασίας είναι γνωστή και άρα μπορεί να μελετηθεί. Έχοντας ως βάση τα προηγούμενα, κύριος στόχος της ερευνητικής αυτής προσέγγισης ήταν ο προσδιορισμός υποψήφιων γονιδίων που ενέχονται στην έναρξη της ντοπαμινεργικής εκφύλισης στο μοντέλο weaver. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκε το μεταγραφικό προφίλ ολόκληρου του γονιδιώματος της ευρύτερης θιγόμενης περιοχής του μεσεγκεφάλου weaver και φυσιολογικών μυών χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώματος μυός. Επιλέχτηκαν μύες 7 ημερών, ηλικίας που βρίσκεται ακριβώς πριν την έναρξη της εκφυλιστικής διαδικασίας. Τα αποτελέσματα που παρήχθησαν περιλαμβάνουν ένα σχετικά μικρό αριθμό γονιδίων που σημειώνουν περιορισμένη αλλά σημαντική αλλαγή των επιπέδων έκφρασης τους στους weaver μύες. Τα γονίδια αυτά διακρίνονται με βάση την λειτουργία τους σε 4 κατηγορίες που αφορούν στη φυσιολογία της σύναψης ή τη νευροδιαβίβαση, τη μεταγωγή σήματος, την ενεργοποίηση της μεταγραφής και τη μεταφορά. Αν και εξετάστηκε η ευρύτερη περιοχή του μεσεγκεφάλου που παράλληλα με τη μέλαινα ουσία περιλαμβάνει και μη θιγόμενες ντοπαμινεργικές ή μη περιοχές και επιφέρει σημαντική αραίωση στα αποτελέσματα των γονιδίων που εμπλέκονται στην εκφύλιση της μελαινοραβδωτής οδού, οι λειτουργίες αυτές έχουν βρεθεί ότι επηρεάζονται στη ΝΠ και στο νευροτοξικό μοντέλο MPTP σε μύες, ακόμα και σε πρώιμα στάδια νευροεκφύλισης. Μάλιστα, είναι η πρώτη φορά που μία τέτοια προσπάθεια προσδιορισμού των μοριακών μηχανισμών παθογένειας του ντοπαμινεργικού θανάτου πραγματοποιείται σε τόσο πρώιμο στάδιο, πριν ουσιαστικά η εκφύλιση αρχίσει να παρατηρείται. Μεταξύ των γονιδίων των οποίων το μεταγραφικό προφίλ βρέθηκε να χαρακτηρίζει ειδικά τη μεσεγκεφαλική περιοχή των μυών weaver, επιλεχτήκαν να πιστοποιηθούν περαιτέρω με QPCR σε μια νέα ομάδα ζώων της ίδιας ηλικίας συγκεκριμένα γονίδια με γνώμονα τη λειτουργία τους και το ποσοστό της αλλαγής των επιπέδων έκφρασής τους στα μεταλλαγμένα ζώα. Τα γονίδια που πιστοποιήθηκαν ότι αλλάζουν το προφίλ της έκφρασής τους στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών περιλαμβάνουν το supt16h, το lasp1, το dlgh4 και ένα καινούργιο μετάγραφο του nurr1. Το supt16h κωδικοποιεί τη μεγάλη υπομονάδα του συμπλόκου FACT, το οποίο είναι σύμπλοκο αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης και παίζει σημαντικό ρόλο στη διεκπεραίωση της μεταγραφικής διαδικασίας. Η μείωση της έκφρασης του supt16h στο μεσεγκέγαλο των μυών weaver είναι πιθανό να σηματοδοτεί ένα γενικότερο μηχανισμό μείωσης της μεταγραφικής δραστηριότητας στην περιοχή. Το nurr1 είναι ένα πρώιμο γονίδιο με καλά χαρακτηρισμένη λειτουργία στην ανάπτυξη και διατήρηση των ντοπαμινεργικών νευρώνων, ενώ μεταλλάξεις του έχουν εμπλακεί στην παθογένεια της ΝΠ. Αλλαγές στο προφίλ έκφρασης του ίσως σηματοδοτούν ένα αντισταθμιστικό μηχανισμό που ενεργοποιείται στη θιγόμενη περιοχή στα πρώιμα στάδια εκφύλισης ή εμπλέκονται στους μοριακούς μηχανισμούς παθογένειας της νευροεκφύλισης. Το lasp1 και το dlgh4 παρατηρήθηκαν να μειώνουν τα επίπεδα της έκφρασής τους στο μοντέλο weaver. Πρόκειται για 2 γονίδια που κωδικοποιούν 2 συναπτικές πρωτεΐνες με πολύ σημαντικό ρόλο στη νευροδιαβίβαση και την απόκριση του μετασυναπτικού νευρώνα. Η μείωση των επιπέδων των πρωτεϊνών αυτών στο μοντέλο weaver μπορεί να οδηγήσει σε δυσλειτουργία της σηματοδότησης στη σύναψη ή της απόκρισης του μετασυναπτικού κυττάρου σε μηχανισμούς που τροποποιούν τη συναπτική φυσιολογία. Επιπρόσθετα, η μείωση των επιπέδων των συναπτικών αυτών πρωτεϊνών θα μπορούσε να επιφέρει αλλαγές στην αρχιτεκτονική της σύναψης, οι οποίες είναι αναμενόμενο να έχουν αντίκτυπο και στο προσυναπτικό άκρο. Συνοψίζοντας, τόσο η μεταβολή της μεταγραφικής δραστηριότητας όσο και η απώλεια ή η διαταραχή της συναπτικής λειτουργίας όπως ανιχνεύονται από τον προσδιορισμό των γονιδίων που διαφοροποιούν το μεταφραφικό τους προφίλ ειδικά στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών, υπαινίσσονται διαδικασίες που ενεργοποιούνται στην ευρύτερη περιοχή πριν η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων αρχίσει να παρατηρείται. Η περαιτέρω ιστολογική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων αυτών στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών, ίσως σηματοδοτεί μια νέα μοριακή κατεύθυνση στη διερεύνηση της έναρξης της εκφυλιστικής διαδικασίας στα ντοπαμινεργικά κύτταρα. 2) Ο δεύτερος σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η προσπάθεια ανίχνευσης του μοριακού αποτυπώματος της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. Προς την κατεύθυνση αυτή χρησιμοποιήθηκαν περιφερειακά λεμφοκύτταρα αίματος επειδή είναι ένας εύκολα προσβάσιμος ιστός, στον οποίο η έκφραση υποδοχέων νευροδιαβιβαστών έχει προταθεί ότι μπορεί να αντικατοπτρίζει την κατάσταση των ομόλογων υποδοχέων του εγκεφάλου, ενώ ειδικά σε σχέση με τη ΝΠ, έχει δειχθεί ότι εκφράζουν φυσιολογικά υποδοχείς ντοπαμίνης οι οποίοι υπερεκφράζονται στη νόσο, ενώ το περιεχόμενο της ντοπαμίνης και η ανοσοαπόκριση της υδροξυλάσης της τυροσίνης μειώνονται στα πρώιμα στάδια της νόσου. Τα στοιχεία αυτά ενισχύουν το ρόλο των λεμφοκυττάρων ως περιφερικό δείκτη της δυσλειτουργίας του ΚΝΣ στη ΝΠ. Για τη μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των λεμφοκυττάρων ασθενών της ΝΠ χρησιμοποιήθηκαν πρωτοδιαγνωσμένοι ασθενείς που δεν είχαν λάβει καμία θεραπεία. Πραγματοποιήθηκε υψηλής κλίμακας ανάλυση της γονιδιακής τους έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώματος ανθρώπου. Από τη σύγκριση των παρκινσονικών ασθενών με φυσιολογικά άτομα ιδίου φύλου και κατά το δυνατόν αντίστοιχης ηλικίας, η κατηγοριοποίηση όλων των δειγμάτων της έρευνας με βάση το μεταγραφικό προφίλ όλων των γονιδίων τους έδειξε ότι τα παρκινσονικά άτομα διαχωρίζονται μεν, δε διαφέρουν όμως πάρα πολύ από τα φυσιολογικά. Επιπρόσθετα, από την ανάλυση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης σε όλα τα δείγματα προέκυψε ότι η ηλικία, τουλάχιστον οι μεγάλες διακυμάνσεις της, παίζει πιο δραστικό ρόλο στον καθορισμό του μεταγραφικού προφίλ των λεμφοκυττάρων από ότι η νόσος ή το φύλο. Η ομαδοποίηση των δειγμάτων με βάση το πρότυπο της γονιδιακής τους έκφρασης έδειξε ότι τα φυσιολογικά άτομα κατηγοριοποιούνται μαζί σε μία ομάδα παρότι είναι διαφορετικού φύλου. Αντίθετα, το σύνολο των παρκινσονικών ασθενών που χρησιμοποιήθηκαν είναι πιο ετερογενές, γεγονός που υποδεικνύει ότι πέρα από τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών και το στάδιο της νόσου, υπάρχουν άλλοι παράγοντες της νόσου που ρυθμίζουν το μεταγραφικό προφίλ των λεμφοκυττάρων . Λαμβάνοντας υπόψη αυτήν την ποικιλομορφία των παρκινσονικών ασθενών καθώς και το ρόλο της ηλικίας στην εξαγωγή των αποτελεσμάτων, παράλληλα με την κύρια σύγκριση μεταξύ όλων των φυσιολογικών και όλων των παρκινσονικών ατόμων, δοκιμάστηκε μία ακόμη σύγκριση μεταξύ μόνο των παρκινσονικών και υγιών εκείνων ατόμων που πέρα από το χαρακτηρισμό τους διαχωρίζονται μεταξύ τους και από το προφίλ της γονιδιακής τους έκφρασης με βάση τα αποτελέσματα της κατηγοριοποίησης. Τα γονίδια που προέκυψαν από τις συγκρίσεις αυτές να μεταβάλλουν τα επίπεδα έκφρασης τους στα λεμφοκύτταρα των παρκινσονικών ασθενών αφορούν σε λειτουργίες που αντιστοιχούν στη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών και τη μεταγραφή, τη μεταφορά, τη μεταγωγή σήματος και το μεταβολισμό. Οι λειτουργίες αυτές είτε αφορούν σε μηχανισμούς που έχουν βρεθεί να διαταράσσονται στη μέλαινα ουσία της ΝΠ, ή αντιπροσωπεύουν μια περιφερική απόκριση στη νόσο, η παθολογία της οποίας επεκτείνεται έξω από τον εγκέφαλο. Ο προσδιορισμός συγκεκριμένων γονιδίων μεταξύ των αποτελεσμάτων που έχουν ήδη εμπλακεί στη ΝΠ ή παίζουν ρόλο στη φυσιολογία του εγκεφάλου, προσφέρει ένα βιολογικό υπόβαθρο στην προσπάθεια διερεύνησης του μοριακού αποτυπώματος της ΝΠ στα λεμφοκύτταρα. / Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease of the CNS, affecting 1%-2% of the aging population. The main histopathology of the disease is characterized by the progressive degeneration of the dopaminergic neurons of the substantia nigra leading to primary symptoms that are correlated to motor abnormalities. The diagnosis of PD is possible only after its primary symptoms appear, when a severe degree of neurodegeneration has already occurred. Moreover, the symptoms are not specific for the disease, weakening the accuracy of its diagnosis, especially in its early stages. The etiology of the disease remains unknown. PD is considered to be a rather multifactorial syndrome, the pathogenic mechanisms of which have not yet been clarified, as the onset of the disease cannot be identified presymptomatically. The present thesis had two primary targets: 1) The study of the pathogenesis of the degeneration of the nigrostriatal pathway and 2) the detection of the pathological phenotype of PD in blood. 1) Towards the first direction, the mutant mouse weaver was studied, which represents a unique genetic model of progressive nigrostriatal neurodegeneration. Its pathophysiological phenotype lies on an autosomal missense mutation identified in the girk2 gene, which codes for a subunit of a G-protein-activated inwardly rectifying K+ channel. Although this mutation was not correlated to PD in humans, similar subpopulations of dopaminergic neurons are affected and characterize the pathology of both PD and the weaver mouse model. In addition, a crucial advantage in weaver mice is that the onset of the progressive dopaminergic degeneration is known and thus, can be studied. Based on these facts, the first aim of this thesis was the identification of candidate genes involved in the initiation of the dopaminergic degeneration in weaver mice. In this context, the complete transcriptional profile of the affected midbrain area of weaver mice was investigated using mouse full-genome DNA microarrays. Seven days-old mice were selected for this study, a time point that is currently the last reported at which no neurodegeneration has yet occured in the weaver midbrain. The results that were obtained include a relatively small number of genes that exhibit a limited but significant change in their expression levels. These genes are separated based on their function in four categories that concern the physiology of the synapse or neurotransmission, signal transduction, the regulation of transcription and transport. In the current experimental approach, the broader midbrain area of weaver mice was examined that besides the substantia nigra it includes other non affected dopaminergic or non dopaminergic areas, thus inducing quite a dilution to the genes identified to alter their expression significantly during the initiation of dopaminergic degeneration in weaver mice. However, the gene functions detected to be affected in this study have also been reported in PD and in the MPTP neurotoxical mouse model, even in the early stages of neurodegeneration. Notably, this is the first time such a study of the molecular pathogenic mechanisms of dopaminergic death is conducted so early in the neurodegenerative process, even before cell death begins to be observed. Among the genes whose transcriptional profile was found to specifically characterize the midbrain area of weaver mice, certain genes were selected to be validated by QPCR in a new group of weaver mice, based on their function and their ratio of differential gene expression in the mutant mice. The genes validated to alter their expression profile in the midbrain of weaver mice include supt16h, lasp1, dlgh4 and a predicted transcript variant of nurr1. Supt16h codes for the large subunit of the FACT complex, a chromatin remodeling complex playing an important role in transcription processing. The down regulation of Supt16h in the midbrain of weaver mice could imply a more generalized reduction of the transcriptional activity in the area. Nurr1 is an early gene playing an established role in the development and maintenance of dopaminergic neurons, whereas several mutations of the gene have been associated with PD. Changes in the expression level of Nurr1 might be observed either because of a compensative mechanism taking place in the early stages of dopaminergic degeneration, or alternatively due to the involvement of Nurr1 in the pathogenesis of the nigrostriatal neurodegeneration. Lasp1 and Dlgh4 were found to be downregulated in the midbrain of weaver mice. They code for two synaptic proteins that play a very important role in neurotransmission and post-synaptic response. The decrease of the expression levels of both genes in weaver mice could lead to signaling impairment in the synapse or to abnormalities in the post-synaptic response to stimuli affecting synaptic physiology. Furthermore, the down-regulation of those two synaptic proteins could induce alterations in the architecture of the synapse that would be expected to affect the pre-synaptic neuron as well. In summary, both transcriptional activity change and synaptic function loss or impairment as they are detected through the identification of genes that specifically differentiate their transcriptional profile in the midbrain of weaver mice are potentially processes that are observed to take place in the midbrain before the initiation of the dopaminergic degeneration. Further histological analysis of the expression pattern of those genes in the midbrain of weaver mice could possibly indicate a new molecular direction towards understanding the triggering of dopaminergic cell death. 2) The second goal of the current thesis was the detection of the molecular fingerprint of PD in a peripheral tissue. In this direction, the peripheral blood lymphocytes (PBLs) were chosen to be used. PBLs are an easily accessible tissue, expressing several neurotransmitter receptors that are believed to reflect the function of their brain homologues. Especially in relation to PD, PBLs have been found to normally express dopamine receptors that are upregulated in the disease, while both their dopamine content and the immunoreactivity of tyrosine hydroxylase are reduced in the early stages of PD. Those findings enhance the consideration of PBLs as a putative peripheral marker of CNS impairment in PD. To investigate the transcriptional profile of the lymphocytes from PD patients, a high-throughput analysis of gene expression was carried out using whole–genome human DNA microarrays. The PD patients that were used for this survey were all recently diagnosed to suffer from the disease and had received no treatment. The comparison of the transcriptome in lymphocytes between PD patients and age- and sex-matched healthy subjects identified that PD patients, in terms of their transcriptional profile in PBLs , are categorized separately from the healthy subjects, without however differing dramatically. Moreover, the analysis of gene expression among all samples pointed that age, at least its large variations, affects the transcriptional profile of lymphocytes more actively than sex or the disease itself. The clustering of samples according to their gene expression grouped all healthy subjects of advanced age together, regardless of their sex. On the contrary, the group of PD patients is more heterogeneous, a fact indicating that there might be other disease factors that regulate the transcriptional profile of lymphocytes besides the general clinical phenotype of the disease. Taking into consideration the variability of PD patients, as well as the effect of age on the results obtained, besides the main general comparison between all PD patients and all healthy subjects, another comparison was tried between only those PD patients and healthy subjects that are grouped separately between them based on the clustering outcome. The genes identified to specifically change their expression levels in the lymphocytes of PD patients have functions regarding protein biosynthesis transcription, transport, signal transduction and metabolism. Those functions either reflect the mechanisms underlying the pathology of SN in PD, or represent a peripheral response to the disease, the pathology of which extends beyond the brain to the periphery. The correlation of some of the genes identified in this study to previous studies of PD or brain physiology offers a biological background towards understanding the putative molecular fingerprint of PD in lymphocytes.

- / -

To PTEN δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο, μέσω της δράσης του προϊόντος πρωτεΐνης της φωσφατάσης. Η φωσφατάση εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου εμποδίζοντας τα κύτταρα να αναπτυχθούν και έχοντας σαν αποτέλεσμα την υπερβολικά γρήγορη διαίρεση. Το γονίδιο αυτό έχει ταυτοποιηθεί ως ογκοκατασταλτικό και σε αρκετές περιπτώσεις καρκίνων έχουν εντοπιστεί μεταλλάξεις του. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, θα μελετηθεί η δράση του PTEN στο αδενοκαρκίνωμα του παχέως εντέρου και θα εξεταστεί η δυνατότητα χρήσης των επιπέδων έκφρασής του σαν βιοδείκτη για το συγκεκριμένο είδος καρκίνου. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής είναι με χρήση κλινικών δεδομένων και της έντασης της έκφρασης της πρωτεΐνης του γονιδίου PTEN, να μελετηθεί με στατιστικές μεθόδους η δυνατότητα πρόβλεψης της βαθμοποίησης και της σταδιοποίησης του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν πραγματικά κλινικά δεδομένα 60 ασθενών που προήλθαν από το κυτταρολογικό εργαστήριο του Νοσηλευτικού Ιδρύματος Μετοχικού Ταμείου Στρατού 417 (Ν.Ι.Μ.Τ.Σ.). Τα δεδομένα αυτά αναλύθηκαν με εφαρμογή της περιγραφικής στατιστικής, της λογιστικής παλινδρόμησης και της πολυμεταβλητής παλινδρόμησης με χρήση του στατιστικού πακέτου R. Παρόλα αυτά κανένα από τα εξαγόμενα στατιστικά μοντέλα δεν βρέθηκε να μπορεί να συσχετίσει την ποσότητα έκφρασης του PTEN γονιδίου με τη βαθμοποίηση και τη σταδιοποίηση του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου. Για αυτό τον λόγο καταλήγουμε ότι με χρήση των συγκεκριμένων βιολογικών δεδομένων δεν μπορούμε να επαληθεύσουμε ότι το PTEN γονίδιο είναι βιοδείκτης του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου. Μελλοντικά αυτό πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω είτε με τη χρήση επιπλέον κλινικών δεδομένων καθώς το υπάρχον σύνολο δεδομένων περιέχει λίγα δείγματα ασθενών σε σχέση με τις ελεύθερες μεταβλητές του προβλήματος (small sample size problem), είτε με μεθόδους που αυξάνουν τεχνητά τα δείγματα του συνόλου δεδομένων. / PTEN tumor suppressor gene acts as through the action of the protein product of phosphatase. The phosphatase is involved in regulating the cell cycle by preventing cells to grow and the resulting too rapid division. This gene has been identified as tumor suppressor in several cancers identified mutations. In this paper, we studied the effect of PTEN in adenocarcinoma of the colon and consider the possibility of using the levels of expression as biomarker for this type of cancer. The purpose of this thesis is to use clinical data and the intensity of the protein expression of the gene PTEN and be studied using statistical methods for predict the grade and stage of adenocarcinoma of the colon. For this purpose we used real clinical data of 60 patients who came from the cytology laboratory of the hospital in the Army Pension Fund 417 (N.I.M.T.S.). The data were analyzed using the descriptive statistics, regression and multivariate regression using the statistical package R. However none of the extracted statistical models were found to be correlated to the amount of expression of PTEN gene with grade and stage of adenocarcinoma of the colon. For this reason, we conclude that the use of these biological data can not verify that the PTEN gene is a biomarker of adenocarcinoma of the colon. Future should be investigated further or using additional clinical data as the existing data set contains few patient samples relative to the free variables of the problem (small sample size problem), or by methods that increase artificially the samples in the data set.